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Charakterisierung der DNA-schädigenden Wirkung von Acrylamid in Lebensmitteln am Modell der Ratte
(2010)
Die alpha,beta-ungesättigte Carbonylverbindung Acrylamid entsteht beim Erhitzen von kohlenhydratreichen Lebensmitteln aus der Reaktion von Aminosäuren (hauptsächlich Asparagin) und reduzierenden Zuckern als Nebenprodukt der Maillard-Reaktion. In Langzeitstudien an Ratten wurde ein kanzerogenes Potential von Acrylamid nachgewiesen, was zu seiner Klassifizierung als „wahrscheinlich kanzerogen am Menschen“ (Kategorie 2a) durch die International Agency for Research on Cancer führte. Als Auslöser der Kanzerogenität von Acrylamid wird ein genotoxischer Mechanismus vermutet, der auf der Reaktion von Glycidamid mit der DNA unter Ausbildung des Hauptadduktes N7-Glycidamid-Guanin (N7-GA-Guanin) basiert. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der genotoxischen Wirkung von Acrylamid in vivo anhand des modifizierten Comet Assays sowie der massenspektrometrischen Untersuchung von N7-GA-Guanin-Addukten. Die Problematik wurde in zwei Teilprojekten bearbeitet. Zum einen wurde die Auswirkung verschiedener Lebensmittelmatrices auf die genotoxische Wirkung von Acrylamid in der Ratte im Vergleich zur Acrylamid-Aufnahme über Trinkwasser per Schlundsonde untersucht. Dazu wurden jeweils drei Ratten über maximal neun Tage mit Acrylamid-Dosen von 50 µg/kg KG/d in Trinkwasser oder Brotkruste bzw. 100 µg/kg KG/d in Trinkwasser (Schlundsonde), geschnittenen und rekonstituierten Pommes Frites sowie Lebkuchen behandelt. Zusätzlich wurde jeweils drei Tiere einmalig eine Dosis von 450 µg bzw. 900 µg Acrylamid/kg KG in Trinkwasser mittels Schlundsonde verabreicht, was der maximalen Aufnahmemenge über neun Tage entspricht. Außerdem wurde zwei Tieren einmalig 10 mg Acrylamid/kg KG in Trinkwasser per Schlundsonde gegeben. Die Tötung der Tiere sowie Blut- und Organentnahme erfolgten 24 Stunden nach der letzten Acrylamid-Gabe. Die Untersuchung der Blut- und Leberzellen mittels modifiziertem Comet Assay ließ auf keine signifikante DNA-Schädigung der mit 50 oder 100 µg Acrylamid/kg KG behandelten Tiere schließen. Auch die einmalige Verabreichung von 450 µg bzw. 900 µg Acrylamid/kg KG im Trinkwasser führte zu keiner signifikanten Erhöhung der DNA-Schädigung. Lediglich nach der Gabe von 10 mg Acrylamid/kg KG wurden DNA-Schäden in Blut und Leber detektiert. In den Geweben der für maximal neun Tage mit 50 oder 100 µg Acrylamid/kg KG im Trinkwasser oder Lebensmittel behandelten Ratten wurden keine N7-GA-Guanin-Addukte detektiert und lagen somit unterhalb der Nachweisgrenze von 1 Addukt/10E8 Nukleotide. Nach einmaliger Verabreichung von 450 µg Acrylamid/kg KG wurden in allen Organen der behandelten Tiere N7-GA-Guanin-Addukte detektiert, die allerdings unterhalb der Bestimmungsgrenze von 3 Addukten/10E8 Nukleotide lagen. Die einmalige Gabe von 900 µg und 10 mg Acrylamid/kg KG führte zu quantifizierbaren Addukten in allen untersuchten Organen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die zeit- und dosisabhängige Bildung von N7-GA-Guanin-Addukten in der DNA aus Leber, Niere und Lunge weiblicher Sprague-Dawley Ratten untersucht. Dazu wurden die Ratten zunächst einmalig mit 1 mg oder 10 mg Acrylamid/kg KG per Schlundsonde behandelt und die Gewebeproben nach 8, 16 oder 24 Stunden entnommen und untersucht. Nach Ermittlung des Zeitpunktes der maximalen N7-GA-Guanin-Adduktbildung wurden weitere Ratten einmalig mit 0,1 mg, 0,5 mg, 3 mg oder 6 mg Acrylamid/kg KG behandelt. Neben der N7-GA-Guanin-Adduktbildung wurde die Bildung der Mercaptursäuren von Acrylamid und Glycidamid mittels HPLC-MS/MS untersucht. Die Mercaptursäuren AAMA und GAMA entstehen als Abbauprodukte der Glutathionkonjugate von Acrylamid und Glycidamid und werden über den Urin ausgeschieden. Die dosisabhängige Bildung von N7-GA-Guanin-Addukten wurde 16 Stunden nach Verabreichung von Acrylamiddosen zwischen 0,1 mg und 10 mg/kg KG untersucht. Die N7-GA-Guanin-Addukte konnten erst ab einer Dosis von 1 mg Acrylamid/kg KG in der DNA der Tiere quantifiziert werden. Die Adduktbildung in der 0,1 mg Acrylamid/kg KG-Gruppe lag unterhalb der Nachweisgrenze, während die Addukte in der 0,5 mg Acrylamid/kg KG-Gruppe zwar nachweisbar, aber nicht quantifizierbar waren. Im Bereich von 1 bis 10 mg Acrylamid/kg KG wurde ein dosisabhängiger Anstieg der N7-GA-Guanin-Addukte beobachtet. Die Ergebnisse der gemessenen Mercaptursäuren zeigen insgesamt, dass 53-55 % der Acrylamid-Dosis von 1 und 10 mg/kg KG innerhalb von 24 Stunden als Mercaptursäuren ausgeschieden werden und dadurch eine effektive Entgiftung von Acrylamid gewährleistet ist. Anhand der ausgeschiedenen GAMA-Menge lässt sich rückschließen, dass 14-18 % der verabreichten 1 und 10 mg Acrylamid/kg KG innerhalb von 24 Stunden zu Glycidamid metabolisiert werden. Die Untersuchung der Mercaptursäuren im 16-Stunden-Sammelurin nach Gabe von 0,1 bis 10 mg Acrylamid/kg KG zeigte, dass die absolute Ausscheidung von AAMA und GAMA linear mit der Dosis ansteigt.
Bei Acrylamid handelt es sich um ein genotoxisches Kanzerogen, welches beim Erhitzen von Lebensmitteln gebildet wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, inwieweit spezifische Lebensmittelmatrices die Bioverfügbarkeit und den Metabolismus von Acrylamid beeinflussen. Lebkuchen als zuckerhaltiges, fettarmes und trockenes Lebensmittel auf Getreidebasis und Pommes frites (fett- und wasserreich; Kartoffelbasis) die entweder direkt aus der Kartoffel geschnitten (mit intakter Gewebestruktur) oder aus Kartoffelerzeugnissen „rekombiniert“ wurden sowie Brotkruste wurden an männliche Sprague Dawley-Ratten über 1, 3, 5, 7 und 9 Tage verfüttert und mit der Aufnahme von Acrylamid über Trinkwasser (Schlundsondierung)verglichen. Die täglich verabreichte Acrylamid-Dosis lag bei 100 µg/kg KG für Pommes frites und Lebkuchen bzw. 50 µg/kg KG für Brotkruste. Als Langzeit-Expositionsbiomarker wurden Addukte von Acrylamid und Glycidamid mit dem endständigen Valin (Val) am Hämoglobin (Hb) herangezogen. Das Ausmaß der AAVal-Bildung in den Tieren, denen Acrylamid über Pommes frites verabreicht wurde, entsprach jener nach Gabe einer entsprechenden Dosis Acrylamid in Trinkwasser mittels Schlundsondierung (AA-TW-Gruppen), was auf eine vergleichbare Bioverfügbarkeit von Acrylamid hindeutet. Lediglich in den Gruppen, die Acrylamid über Brotkruste erhielten, wurde eine geringfügig verminderte Bildung von AAVal-Hb-Addukten im Vergleich zu den AA-TW-Gruppen beobachtet. Nach Aufnahme von Acrylamid über Pommes frites wurde kein signifikanter Unterschied in der Gesamtausscheidung an Mercaptursäuren im Vergleich zur Gabe in Trinkwasser mittels Schlundsondierung (AA-TW-Gruppen) beobachtet, was auf eine vergleichbare Bioverfügbarkeit von Acrylamid hindeutet. Bei den mit Brotkruste gefütterten Tieren wurde eine im Vergleich zu AA-TW-Gruppen geringfügig erniedrigte Ausscheidung an AAMA beobachtet, was im Einklang mit der erniedrigten AA-Val-Bildung steht. Für die Ermittlung der Gesamtbilanz an Acrylamid-Ausscheidung aus dem Organismus wurde auch die Acrylamid- und Glycidamid-Ausscheidung im 24-Stunden-Sammelurin bestimmt. Die ausgeschiedenen Anteile an der verabreichten Tagesdosis leisten einen im Vergleich zu den Mercaptursäuren verhältnismäßig geringen Beitrag zur Gesamtausscheidung einer verabreichten Acrylamid-Dosis. Zur Untersuchung der Resorptionskinetik von Acrylamid bei Verabreichung über Pommes frites im Vergleich zur Aufnahme in Trinkwasser (Schlundsondierung) wurden über einen Zeitraum von 4 Stunden die Acrylamid- und Glycidamid-Gehalte in Rattenserum bestimmt. Insgesamt deutet der zeitliche Verlauf der Acrylamid-Serumkonzentration in der mit Pommes frites gefütterten Gruppe auf eine im Vergleich zur AA-TW-Gruppe verzögerte Freisetzung bzw. verlangsamte Resorption von Acrylamid im Gastrointestinaltrakt hin. Zur Abschätzung der Hintergrundbelastung mit Acrylamid wurden in 8 humanen Blutproben die Gehalte an Acrylamid- und Glycidamid-Hämoglobin-Addukten (AAVal, GAVal) sowie in 10 humanen Urinproben die Gehalte an Acrylamid- und Glycidamid-Mercaptursäuren (AAMA, GAMA) bestimmt. Bei den Rauchern wurden deutlich höhere AAVal-Gehalte im Vergleich zu Nichtrauchern gemessen, wohingegen die Gehalte an GAVal auf vergleichbarem Niveau lagen. Darüber hinaus wurde bei den Rauchern eine im Vergleich zu Nichtrauchern signifikant höhere Ausscheidung von AAMA und GAMA beobachtet, wobei die entsprechenden GAMA/AAMA-Verhältnisse bei Rauchern erniedrigt waren. Im Rahmen einer humanen Verzehrsstudie „Bedeutung der CYP450 2E1-Aktivität für die Toxikokinetik von Acrylamid beim Menschen“ wurden Addukte von Acrylamid und Glycidamid mit dem endständigen Valin des Hämoglobin bestimmt. Dabei wurde das Ausmaß der Addukt-Bildung bei 13 Probanden nach Aufnahme von ca. 1 mg Acrylamid über Kartoffel-Chips jeweils bei unbeeinflusster, gehemmter und induzierter CYP450 2E1-Aktivität untersucht. In der Referenzperiode ohne Komedikation wurde bei diesen Probanden ein Anstieg der AAVal-Gehalte um 8 ± 5 pmol/g Hb beobachtet. Ein im Vergleich zur R-Phase signifikant erhöhter AAVal-Anstieg (12 ± 5 pmol/g Hb) zeigte sich in der Testperiode T1, in der CYP450 2E1 durch Disulfiram gehemmt wurde. In der Testperiode T2, in der CYP450 2E1 durch eine Vorbehandlung mit Ethanol induziert wurde, wiesen die AAVal-Gehalte einen mit der R-Phase vergleichbaren Anstieg um 9 ± 5 pmol/g Hb auf. Für GAVal hingegen konnten aufgrund der größeren Messwertschwankungen keine signifikanten Veränderungen in der Testperiode T1 bzw. T2 im Vergleich zur Referenzperiode festgestellt werden. Darüber hinaus wurde bei 3 Probanden der zeitliche Verlauf der AAVal-Bildung in den jeweiligen Testperioden über einen Zeitraum von 24 Stunden untersucht. Die maximale AAVal-Konzentration wurde bei den untersuchten Probanden im Zeitraum von 8-10 Stunden erreicht, wobei anschließend ein Plateau-förmiger Verlauf der Bildungskurven beobachtet wurde.