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In der vorliegenden Arbeit werden Sekundärstrukturmotive von isolierten Peptiden und Peptid-Aggregaten in der Gasphase analysiert. Zur Untersuchung ihrer intrinsischen Eigenschaften werden die isolierten Peptide durch adiabatische Abkühlung in Molekularstrahlen erzeugt. Durch die Anwendung hochsensitiver Techniken der Doppelresonanzspektroskopie, Resonante zwei Photonen Ionisation (R2PI) und Infrarot/Resonante zwei Photonen Ionisation (IR/R2PI), werden die Peptide und Peptid-Aggregate hinsichtlich ihrer Elektronen – und Schwingungsübergängen analysiert. Die Schwingungsfrequenzen im Bereich der Amid A, I, II Moden und im oberen „Fingerprintbereich“ von Peptiden sind sehr signifikant für die Geometrie des Rückgrates und der Seitenketten, z.B. unterscheiden sich Schwingungen von Gruppen, die an Wasserstoffbrückenbindungen beteiligt sind, sehr stark durch ihre Lage und Intensität gegenüber Schwingungen von frei vorliegenden Gruppen. Ein Vergleich mit berechneten Schwingungsfrequenzen aus ab initio und Dichtefunktionaltheorie Rechnungen ermöglicht eine Zuordnung zu einer bestimmten Struktur. Es werden in dieser Arbeit verschiedene Sekundärstrukturen über die Analyse von geschützten Aminosäuren, Di- und Tripeptiden untersucht. Insbesondere gelang es erstmals, ein ß-Faltblattmodellsystem für ein isoliertes Dimer eines Peptids nachzuweisen. Weiterhin werden zum molekularen Verständnis der Mikrosolvatation Aggregate mit Wassermolekülen betrachtet und somit der Einfluss auf die Sekundärstruktur durch sukzessive Aggregation von Wassermolekülen analysiert. In Kooperation mit Prof. Schrader (Universität Duisburg-Essen) werden Templatmoleküle charakterisiert, um ihre Fähigkeiten zur Anlagerung an schädliche ß-Faltblattstrukturen zu untersuchen, die in sogenannten neurodegenerativen Krankheiten häufig auftreten. Die Effizienz ist sowohl über die Analyse der Zahl und Stärke der inter- und intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen als auch über die gebildete Clusterstruktur untersucht worden.
Anionenrezeptoren aus Cyclopeptiden mit 6-Aminopicolinsäure- und substituierten Prolinuntereinheiten
(2007)
Ziel dieser Arbeit war es, neue Cyclopeptide auf Basis der in der Arbeitsgruppe um S. Kubik untersuchten Anionenrezeptoren aus L-Prolin- und 6-Aminopicolinsäure zu entwickeln und hinsichtlich ihrer Rezeptor- und Sensoreigenschaften zu untersuchen. Das Hauptaugenmerk lag dabei auf dem Einfluss von Substituenten an den Prolinuntereinheiten auf die Bindungsaffinität und -selektivität. Durch eine systematische Syntheseoptimierung konnte eine effiziente Strategie für ein 4R-Amino-L-prolin-haltiges Dipeptid erarbeitet werden, welches es ermöglicht, verschiedene Substituenten mit der gewünschten Konfiguration an den C(γ)-Atomen der Prolineinheiten einzuführen. Aus den funktionalisierten Dipeptiden konnten anschließend die entsprechenden Cyclopeptide nach Standardmethoden aufgebaut werden. Die Charakterisierung der Bindungseigenschaften dieser Verbindungen hinsichtlich der Komplexierung verschiedener Sulfonate und Acetat erfolgte mittels NMR-Spektroskopie und isothermer Titrationskalorimetrie in unterschiedlichen Lösungsmitteln. Die Untersuchungen zeigten, dass die Struktur und die Flexibilität der peripheren Substituenten um den Cyclopeptidhohlraum einen signifikanten Einfluss auf die Substratbindung besitzt.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit Anionenrezeptoren aus einfach und zweifach verbrückten Bis(cyclopeptiden). Die Cyclohexapeptiduntereinheiten bestehen dabei aus einer alternierenden Sequenz aus L-Prolin und 6-Aminopicolinsäure. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden eine Reihe neuer einfach verbrückter Bis(cyclopeptide) synthetisiert und mit dem bis jetzt einzigen bekannten verbrückten Bis(cyclopeptid) dieser Art verglichen. Bei diesen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die neu dargestellten Bis(cyclopeptide) anorganische Anionen auf die gleiche Art wie das bereits bekannte binden. Dabei wird das Anion kooperativ durch die Cyclopeptiduntereinheiten über sechs Wasserstoffbrücken koordiniert. Mittels isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) wurden die thermodynamischen Parameter der Komplexbildung der Anionen mit den Bis(cyclopeptiden) bestimmt. Es stellte sich heraus, dass die Linkerstruktur einen großen Einfluss auf die thermodynamischen Parameter der Komplexbildung besitzt, wenn auch die resultierenden Bindungskonstanten der Rezeptoren für ein Anion in einer ähnlichen Größenordung liegen. Mit einem log Ka von etwa 6,0 konnte in dieser Untersuchung einer der besten neutralen Sulfatrezeptoren in wässrigen Lösungsmitteln identifiziert werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Strategie erarbeitet, die den Zugang zu zweifach verbrückten Bis(cyclopeptiden) ermöglicht. Dabei wurde die dynamische kovalente Chemie (DCC) bei der Synthese verwendet. Als reversible Reaktion wurde der Disulfidaustausch eingesetzt. Bei der Synthese wurde ein entsprechend dithiofunktionalisiertes Bis(cyclopeptid) in Anwesenheit verschiedener Dithiole als Linker und eines Templats umgesetzt. Dabei bildete sich die thermodynamisch stabilste Bis(cyclopeptid)-Linker Struktur aus. Es konnten im Laufe dieser Untersuchungen bereits erste Strukturen identifiziert werden, die selektiv für Anionen der Größe und Geometrie von Sulfat und Iodid waren. Dabei wurden nur Bis(cyclopeptide) gebildet, die einen Linker pro Brücke besaßen und es kam nicht zum Einbau verschiedener Linker in ein Bis(cyclopeptid). Im letzten Teil dieser Arbeit wurde überprüft, ob die Entwicklung eines Sensors auf Basis von einfach verbrückten Bis(cycloeptiden) möglich ist. Es konnte gezeigt werden, dass der Einsatz von Bis(cyclopeptiden) als Ionophore in ionenselektiven Elektroden (ISEs) kein viel versprechender Weg zur Erzeugung eines Sensors ist. Durch die Einführung eines fluoreszenzaktiven Linker konnte aber Bis(cyclopeptid) synthetisiert werden, dass in wässrigen Lösungen einen hochselektiven Fluoreszenzsensor für Sulfat darstellt. Dabei kommt es in Anwesenheit von Sulfat, selbst in Anwesenheit von 100 Äquivalenten Natriumchlorid, zu einer Löschung der Fluoreszenz. Keins der anderen acht untersuchten Anionen hatte einen ähnlichen Effekt auf das Fluoreszenzspektrum. Durch theoretische DFT Rechnungen konnte die Löschung der Fluoreszenz rationalisiert werden. Damit eröffnen sich erste praktische Anwendungen für die Bis(cyclopetide).
In der vorliegenden Arbeit wird das Tragverhalten von Verbundträgern im Bereich von großen Stegöffnungen analysiert und ein Modell zur Ermittlung der Querkrafttragfähigkeit des Betongurts entwickelt. Die Basis dazu bilden umfangreiche experimentelle und rechnerische Untersuchungen. Des Weiteren wird die Reibung zwischen dem Schaft von einbetonierten Kopfbolzendübeln und dem umgebendem Beton experimentell untersucht. Anhand von 21 großmaßstäblichen Traglastversuchen, die erstmals so konzipiert waren, dass im Öffnungsbereich nahezu die gesamte Querkraft durch den Betongurt übertragen wurde, konnte die Querkrafttragfähigkeit des Betongurts experimentell in engen Grenzen bestimmt werden. Neue Erkenntnisse über den Lastabtragungs- und Versagensmechanismus im Öffnungsbereich wurden durch die Auswertung der Dehnungen der Kopfbolzendübel im Öffnungsbereich und das nachträgliche Aufsägen des Betongurts der Versuchsträger gewonnen. Die Versuche wurden mit einem dreidimensionalen FE-Modell, das die Versuche in ihren wesentlichen Teilen abbildete, simuliert. Durch den Vergleich der rechnerischen mit den experimentell ermittelten Werten wurde dieses Modell überprüft und anschließend wurden damit Parameteruntersuchungen durchgeführt. Mit den Erkenntnissen aus den experimentellen und rechnerischen Untersuchungen konnte der Lastabtragungsmechanismus im Öffnungsbereich umfassend analysiert werden und ein Ingenieurmodell zur Bestimmung und zum Nachweis der Querkrafttragfähigkeit des Betongurts im Öffnungsbereich entwickelt werden.
Acrylamid (AA) ist ein Kanzerogen, das beim Braten, Backen und Frittieren stärkehaltiger Le-bensmittel im Wesentlichen aus dem Vorläufer Asparagin in Gegenwart reduzierender Zucker in substantiellen Mengen gebildet wird. AA wird im Organismus metabolisch zu Glycidamid (GA) umgewandelt. Für GA wurden DNA-Addukte insbesondere mit dem N7 des Guanins nachgewiesen. Von besonderem Interesse für die Risikobewertung von AA ist Aufklärung des kanzerogenen Wirkmechanismus sowie des genotoxischen Potentials im Vergleich zu anderen bekannten Kanzerogenen. Ziel der Arbeit war es daher, das genotoxische Potential von AA und seinen Metaboliten GA sowie deren genotoxischen Wirkmechanismus zu charakterisieren. AA wurde im Vergleich zu den alpha, beta-ungesättigten Carbonylverbindungen Acrolein (Ac) und Hexenal (Hex) getestet, GA vergleichend zu aktiven Formen der Kanzerogene Benzo[a]pyren (B[a]P) und N-Nitrosodiethanolamin (NDELA) sowie den N-Nitrosoharnstoffen MNU und HENU und ausgewählten N-Nitroso-oxazolidinonen, einer Gruppe von N-Nitrosaminen, welche möglicherweise endogen im Organismus gebildet und nach Hydrolyse in ihre biologisch aktive Form überführt werden. Humanes Vollblut, isolierte Lymphozyten sowie V79-Säugerzellen wurden als Testsysteme verwendet. Als Endpunkte der Genotoxizität wurde die Induktion und Kinetik der Abnahme von DNA-Strangbrüchen sowie der Einfluss von Glutathion auf die DNA-Strangbruchinduktion im Comet Assay bestimmt. Die Sensitivität und Selektivität des Comet Assays wurde durch zusätzliche Behandlung der DNA mit dem DNA-Reparaturenzym Formamido-pyrimidin-DNA-glykosylase (FPG) gesteigert. FPG erkennt AP Stellen, ring-geöffnete Pyrimidine sowie oxidierte Purine und überführt diese in zusätzliche DNA-Strangbrüche. Das mutagene Potential der Verbindungen nach 5-tägiger Expressionszeit wurde in V79 Zellen mittels hPRT-Genmutations-Assay untersucht. AA erwies sich in allen Testsystemen als nicht genotoxisch. Die im Vergleich getesteten alpha, beta-ungesättigten Carbonylverbindungen Ac und Hex waren ebenfalls in humanem Vollblut nicht genotoxisch, verursachten jedoch in isolierten Lymphozyten in hohen Konzentrationen(> 3000 µM) DNA-Strangbrüche. GA war in allen Testsystemen genotoxisch. Im Comet Assay ohne FPG zeigten sich DNA-Strangbrüche ab 300 µM (1h). Nach zusätzlicher Behandlung der DNA mit FPG wurden bereits ab 10 µM (4h) DNA-Strangbrüche detektiert. DNA-Schäden waren erst ab einer Inkubationszeit von einer Stunde signifikant und erreichten nach 24h ein Maximum. GA induzierte in V79 Zellen zudem erst in 80-fach höheren Konzentrationen hPRT-Mutationen (800 µM) als DNA-Strangbrüche. Zusätzlich zeigte sich, dass die Mutationsrate erst in Konzentrationen signifikant erhöht war, in denen eine Reduktion der DNA-Schäden nicht mehr effektiv erfolgte. Die Genotoxizität von GA beruht vermutlich auf der präferentiellen Bindung an N7-Guanin. Die entstehenden N7-G-Addukte werden entweder spontan zur AP Stelle depuriniert oder zum Formamido-pyrimidin ring-geöffnet. Beide Arten von Folgeprodukten sind FPG-Substrate und werden vermutlich effizient repariert, sodass es erst bei hohen lokalen Konzentrationen (> 800 µM) zu einer signifikanten Ausprägung von Mutationen kommt. Die im Vergleich zu GA getesteten Kanzerogene (±)-BPDE und alpha-Acetoxy-NDELA waren im Comet Assay bei ähnlichen Konzentrationen genotoxisch (10-30 µM; 1h). Im Gegensatz zu GA induzierten beide allerdings hPRT-Mutationen (3-10 µM) im gleichen Konzentrationsbereich wie DNA-Strangbrüche. Ähnliche genotoxische Eigenschaften zeigten auch die im Vergleich zu GA getesteten N-Nitrosoverbindungen. Die Gruppe der N-Nitroso-oxazolidinone wurde erstmals im Hinblick auf Genotoxizität und Mutagenität geprüft. NOZ-2 induzierte in V79 Zellen bereits nach 15’ ab 3 µM maximal DNA-Strangbrüche. HENU induzierte DNA-Strangbrüche ab 100 µM (15’). In beiden Fällen hatte FPG keinen Einfluss auf die DNA-Strangbruchinduktion. Sowohl NOZ-2 als auch HENU sind hydroxyethylierend. Im Gegensatz dazu, waren das carboxymethylierende oder methylierende NOZ-5 und das methylierende MNU im Comet Assay ohne FPG nur gering aktiv (> 300 resp. 1000 µM; 15’), während nach FPG-Behandlung die Aktivität im Comet Assay (NOZ-5: >10µM; MNU: >100µM; 15’) deutlich gesteigert war. Die Kinetik der Abnahme von DNA-Strangbrüchen ist für die Verbindungen unterschiedlich. Während die NOZ-2-induzierten DNA-Läsionen (30µM) persistieren, wurden die durch NOZ-5 und HENU induzierten DNA-Schäden -vergleichbar mit GA- effektiv innerhalb einer 8-stündigen Nachbehandlungszeit reduziert. Für alle untersuchten N-Nitrosoverbindungen waren hPRT-Mutationen im gleichen Konzentrationsbereich wie DNA-Strangbrüche im Comet Assay mit FPG nachweisbar. Die N-Nitrosoverbindungen sind damit insgesamt deutlich potenter mutagen als GA. NOZ-2 und HENU führen vermutlich vergleichbar mit alpha-Acetoxy-NDELA zu einer Hydroxyethylierung der DNA-Phosphodiester. Die resultierenden Phosphotriester sind instabil und werden voraussichtlich schnell in DNA-Strangbrüche gespalten. Des Weiteren ist die Bildung instabiler N7-G- und promutagener O6-G-2-Hydroxyethyl-Addukte zu erwarten. Das potentiell DNA-carboxymethylierende/methylierende NOZ-5 und das DNA-methylierende MNU alkylieren ver-mutlich die gleichen Positionen in der DNA. Allerdings scheinen die gebildeten Methyl- oder Carboxymethyl-Phosphotriester stabil zu sein und werden nicht spontan in Strangbrüche überführt. Die gebildeten N7-G-Addukte sind FPG-Substrate, was sich am FPG-vermittelten Anstieg der DNA-Strangbruchrate zeigt. Dies steht im Gegensatz zu NOZ-2, bei welchem FPG keinen Einfluss auf die DNA-Strangbruchinduktion hatte. Vermutlich ist dies auf die Hydroxyethylierung der Phosphat-Gruppen durch NOZ-2 zurückzuführen, deren spontane DNA-Strangbruch-Induktion den Nachweis von N7-G-Addukten mittels FPG überlagert. Weiterhin zeigte sich, dass trotz vergleichbar hoher hPRT-Mutagenität, NOZ-5-induzierte DNA-Schäden deutlich geringer persistent als entsprechende NOZ-2-Läsionen sind. Das mutagene Potential von NOZ-5 ist daher vermutlich, neben anderen nicht reparierten DNA-Schäden, auf promutagene O6-G-Addukte zurückzuführen, welche in MGMT-defizienten V79 Zellen nicht repariert werden. Orientierend wurde der Einfluss detoxifizierender Makromoleküle auf die Genotoxizität von GA und alpha, beta-ungesättigten Carbonylverbindungen durch Vergleich der Aktivitäten in humanem Vollblut und isolierten Lymphozyten sowie durch Co-Inkubation mit Glutathion (GSH) in V79 Zellen untersucht. Während Ac und Hex in isolierten Lymphozyten deutlich potenter DNA-schädigend als in humanem Vollblut sind, ist GA in beiden Systemen vergleichbar genotoxisch. Offensichtlich wird in humanem Vollblut die Aktivität von GA durch detoxifizierende Blutbestandteile nur unwesentlich beeinflusst. Ein entsprechender Effekt zeigt sich auch bei der Co-Inkubation von V79 Zellen. Während GSH die DNA-schädigende Wirkung von Ac und Hex in V79 Zellen deutlich reduzierte, war für GA kein signifikanter Unterschied zur DNA-Strangbruchrate in ausschließlich GA-behandelten Zellen nachzuweisen. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass AA selbst nicht genotoxisch bzw. mutagen ist; Ac und Hex in humanem Vollblut ebenfalls nicht genotoxisch sind, allerdings in isolierten Lymphozyten bei hohen Konzentrationen (> 3000 µM) Genotoxizität induzieren; die genotoxische/ mutagene Wirkung von AA durch GA vermittelt wird; GA im Vergleich zu anderen potenten Kanzerogenen Genotoxizität nur sehr langsam induziert (signifikant nach 1h) und eher schwach mutagen ist; GA-induzierte DNA-Läsionen schnell (innerhalb von 8h) repariert werden;die physiologische Umgebung in Humanblut nur geringen Einfluss auf die biologische Aktivität von GA hat; NOZ-2 vergleichbar mit HENU mit und ohne FPG-Behandlung signifikant DNA-Strangbrüche erzeugt. Vermutlich führt die Hydroxylierung am Phosphat-Rückgrad zu spontanen Strangbrüchen, die den FPG-Effekt überlagern; NOZ-5 (vermutlich methylierend oder carboxymethylierend im Comet Assay) im Gegensatz dazu ohne FPG-Behandlung im Comet Assay nur schwach aktiv ist, während nach FPG-Behandlung offenbar die vermutete Bildung von N7-G-Addukten zum Tragen kommt; NOZ’s in V79-Zellen potente Mutagene sind; dies vermutlich in Folge von O6-Guanin-Addukt-Bildung, welche in MGMT-defizienten V79 Zellen nicht repariert werden; durch Kombination unterschiedlicher Protokolle des Comet-Genotoxizitäts- und hPRT-Mutagenitätstests orientierende Aussagen über den Zusammenhang zwischen DNA-Alkylierung, Detoxifizierung, DNA-Reparatur und der Entstehung von Mutationen gemacht werden können.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden pflanzliche Membranproteine mit strukturellen Ähnlichkeiten zu Anion:Cation-Symportern, insbesondere zu den Transportern der NaPi1- Familie aus Tieren untersucht. Neben den bereits bekannten Anion-Transporter (ANTR) aus Arabidopsis thaliana (ROTH et al., 2004) wurde in dieser Arbeit eine homologe Proteinfamilie aus Oryza sativa identifiziert. Dabei konnte die funktionelle Verwandtschaft der Proteine AtANTR5 aus A. thaliana und OsANTR5.1 aus O. sativa mittels Komplementation der antr5-Mutante nachgewiesen werden. Der Schwerpunkt der Arbeit lag in der Charakterisierung der physiologischen Bedeutung des AtANTR5-Proteins in der Phosphathomöostase, im Stickstoffstoffwechsel oder bei Pathogenbefall. Mittels GFP-Fusionsexperimenten konnte für AtANTR5 eine subzelluläre Lokalisierung im Golgi-Apparat festgestellt werden. Durch AtANTR5-Promotor-GUS-Pflanzen wurde die gewebe- und entwicklungsspezifische Expression des Membranproteins untersucht. AtANTR5 weist in den meisten Geweben eine sehr geringe Transkriptmenge auf und ist mittels GUS-Färbung nur in Pollen detektierbar. Dennoch ist das AtANTR5-Protein für die ganze Pflanze von essentieller Bedeutung, da eine Inaktivierung des Gen zu gravierenden phänotypischen Veränderungen, gekennzeichnet durch zwergenhaften Wuchs, eingerollten Blättern und Blattläsionen. Aufgrund der Ähnlichkeit zu tierischen Phosphattransportern, wurde zunächst der Einfluss von AtANTR5 auf die Phosphathomöostase in entsprechenden „knock out“-Mutanten untersucht. Es konnte jedoch keine Veränderungen im Phosphathaushalt festgestellt werden. Vielmehr weist die antr5-Mutante eine erhöhte Sensitivität gegenüber Aminosäuren, Ammonium und Salz auf. Offensichtlich ist die durch AtANTR5 Transportaktivität innerhalb des Golgi-Apparates von außerordentlichen Wichtigkeit für den pflanzlichen Stoffwechsel. Des weiteren konnte ein Zusammenhang zwischen AtANTR5 und Pathogenabwehr festgestellt werden. „Northern-Blot“-Analysen zeigten eine Induktion der AtANTR5-Expression als Antwort auf Pathogenbefall durch P. syringae. Zytologische sowie histochemische Analysen haben bei antr5-Pflanzen die Ausprägung zahlreicher Abwehrmechanismen, wie Ablagerungen von Callose in den Zellwänden, Akkumulation von phenolischen Metaboliten, Salizylsäure, PR Proteinen und Wasserstoffperoxid oder Absterben der Zellen, gezeigt. Weiterhin konnte eine erhöhte Resistenz der antr5-Pflanzen gegenüber dem Befall von P. syringae ermittelt werden. Durch die Expression des NahG-Gens in antr5-Mutanten konnte gezeigt werden, dass die Expression der PR-Gene Salizylsäure abhängig, das spontane Absterben der Zellen jedoch Salizylsäure unabhängig war. Dieses Befund lässt den Schluss zu, dass erhöhte SA-Akkumulation und die dadurch aktivierte Abwehr, sekundäre Effekte der AtANTR5-Inaktivierung darstellen.
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Synthese neuartiger, substituierter N,N,N-tridentater Liganden auf der Basis der Stammverbindungen 2,6-Di(pyrazol-3-yl)pyridin und 2,6-Di(pyrimidin-4-yl)pyridin. Die katalytische Aktivität von Dichloroeisen- und Dichlorocobaltkomplexen dieser Liganden in der Olefinpolymerisation wurde getestet. Einen weiteren Schwerpunkt stellte die Synthese von Rutheniumkomplexen auf der Basis dieser neuartigen Liganden und deren Anwendbarkeit in homogen katalysierten Oxidations- und Epoxidationsreaktionen sowie der Hydrovinylierungsreaktion dar. Die Möglichkeit den Liganden 2,6-Di(pyrazol-3-yl)pyridin leicht chemisch modifizieren zu können, wurde genutzt, um Eigenschaften (z. B. die Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln) des Liganden und der sich ableitenden Komplexe zu beeinflussen. Zur regioselektiven N-Funktionalisierung der Pyrazolringe wurden nucleophile Substitutionsreaktionen genutzt. Dieser einfache Zugangsweg zu substituierten 2,6-Di(pyrazol-3-yl)pyridinen wurde ebenso dazu verwendet, um funktionelle Gruppen, die eine Substraterkennung über Wasserstoffbrückenbindungen und eine Komplexierung von Lewis-Säuren ermöglichen sollte, in die Peripherie dieser Liganden anzubinden.
Sepsis ist eine lebensbedrohliche Krankheit und eine der häufigsten Todesursachen auf Intensiv-Stationen. Eine der Hauptursachen für die Schwere dieser Krankheit ist die Lymphopenie, d. h. die apoptotische Depletion von Lymphozyten, die vor allem in der späten hypo-inflammatorischen Phase der Sepsis auftritt. Die dafür verantwortlichen Signalwege sind jedoch nicht im Detail geklärt. Die Liganden-vermittelte Aktivierung von PPARgamma (‚peroxisome proliferator activated receptor gamma’), einem wichtigen Regulator der Immunantwort, führt zur Apoptose in aktivierten T-Zellen. Daher postulierte ich, dass die PPARgamma-vermittelte Apoptose in T-Zellen zur Lymphopenie während der Sepsis beiträgt. Hierbei konnte ich zeigen, dass T-Zellen aus dem peripheren Blut von Sepsis-Patienten eine stark erhöhte PPARgamma-mRNA-Expression zeigten und in vitro stark erhöhte Apoptoseraten infolge einer Liganden-vermittelten PPARgamma-Aktivierung aufwiesen. Die hierfür erforderlichen PPARgamma-Liganden lagen im Plasma von Sepsis-Patienten vor. D. h. die PPARgamma-vermittelte Apoptose in T-Zellen könnte zur nachgewiesenen Lymphopenie während der Sepsis beitragen. Aufgrund der anti-inflammatorischen Wirkung von PPARgamma könnte dessen gezielte Aktivierung in der frühen hyper-inflammatorischen Phase durch Thiazolidindione (TZDs) als synthetische PPARgamma-Aktivatoren therapeutisch interessant sein. Da diese jedoch auch auf PPARgamma-unabhängigen Wegen den Zelltod in T-Zellen induzieren können, war es essentiell, die dafür verantwortlichen Signalwege zu klären. Dabei konnte ich feststellen, dass Ciglitazon Nekrose und Troglitazon Apoptose auf PPARgamma-unabhängigen Wegen bereits nach 4 h in Jurkat T-Zellen induzierten, wohingegen Rosiglitazon keinen Einfluss auf den Zelltod hatte. Die Inkubation der TZDs führte zur Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, welche eine wichtige Rolle bei der Ciglitazon-induzierten Nekrose, jedoch nur marginal bei der Troglitazon-induzierten Apoptose spielten. Durch Studien in submitochondrialen Partikeln konnte ich zeigen, dass die getesteten TZDs den Komplex I der mitochondrialen Atmungskette inhibierten, während nur Ciglitazon und Troglitazon zusätzlich den Komplex II hemmen konnten. Mit Hilfe synthetischer Atmungskette-Inhibitoren konnte ich weiterhin zeigen, dass die Zelltod-Induktion nach Ciglitazon und Troglitazon in Jurkat T-Zellen hauptsächlich auf der Hemmung des Komplexes II beruhte. Da die Ciglitazon-Inkubation zur Depletion des ATP-Gehaltes führte, erfolgte eine Nekrose-Induktion nach Ciglitazon, wohingegen Troglitazon den ATP-Gehalt nicht beeinflusste und daher Apoptose induzierte. Die von mir identifizierten PPARgamma-unabhängigen Mechanismen der Zelltod-Induktion durch TZDs könnten eventuell Nebenwirkungen bei TZD-basierten Therapien erklären.
Software stellt ein komplexes Werkzeug dar, das durch seine umfassenden Möglichkeiten die moderne Gesellschaft entscheidend geprägt hat. Daraus ergibt sich eine Abhängigkeit von Funktion und Fehlfunktion der Software, die eine an den funktionalen Anforderungen orientierte Entwicklung und Qualitätssicherung der Software notwendig macht. Die vorliegende Arbeit schafft durch Formalisierung und Systematisierung der Verfahren im funktionsorientierten Test eine fundierte Basis für eine Hinwendung zu den funktionsorientierten Techniken in Softwareentwicklung und –qualitätssicherung. Hierzu wird in der Arbeit zunächst ein formales Modell für das Vorgehen im dynamischen Test beschrieben, das sich an der Begriffsbildung der Literatur und dem Verständnis der Praxis orientiert. Das Modell beruht auf wenigen zentralen Annahmen, eignet sich für formale Untersuchungen und Nachweise und ist wegen seiner sehr allgemein gehaltenen Definitionen breit anwendbar und einfach erweiterbar. Auf dieser Basis werden Vorgehen und Verfahren zum funktionsorientierten Test analysiert. Zunächst wird dazu das Vorgehen im funktionsorientierten Test im Rahmen des Modells dargestellt. Darauf aufbauend werden zentrale Verfahren des funktionsorientierten Tests analysiert, die zum Gegenstand die systematische Prüfung der Umsetzung von weitgehend informal beschriebenen Anforderungen in einem Softwareprodukt haben. Betrachtet werden Verfahren der funktionalen Partitionierung, der funktionalen Äquivalenzklassenanalyse und Grenzwertbildung, Verfahren zur Prüfung von kausalen Zusammenhängen zwischen Ursachen und Wirkungen, Verfahren zur Prüfung von graphisch spezifizierter Funktionalität in Syntaxdiagrammen, Aktivitätsdiagrammen, Sequenz- und Kollaborationsdiagrammen und Petrinetzen, Verfahren zum Test zustandsbasierter Systeme sowie Ansätze einer funktionalen Dekomposition. Die Analyse und Diskussion der bekannten Verfahren im formalisierten Rahmenwerk führt zu zahlreichen Ergebnissen und Verfahrensergänzungen. So zeigt sich, dass in den klassischen, informalen Beschreibungen häufig Unklarheiten bestehen. Diese werden hier adressiert und durch Angabe von Kriterien präzisiert, Optimierungsmöglichkeiten werden aufgezeigt. Darüber hinaus wird an der einheitlichen formalen Darstellung der in der Literatur meist separat betrachteten Verfahren deutlich, welche Vergleichbarkeit zwischen den Verfahren besteht, welche Verfahrenskombinationen sinnvoll sind und wie durch ein kombiniert funktions- und strukturorientiertes Vorgehen eine hohe Aussagekraft in der analytischen Qualitätssicherung erreicht werden kann. Bei der Formulierung der Verfahren im Rahmen des Modells wird herausgearbeitet, wo zur Verfahrensdurchführung die kreative Leistung des Testers notwendig ist und welche Anteile formalisiert und damit automatisiert unterstützt werden können. Diese Betrachtungen bilden die Grundlage für die Skizzierung einer integrierten Entwicklungsumgebung, in der ein funktionsorientiertes Vorgehen in Entwicklung und Qualitätssicherung umgesetzt wird: Hier helfen funktionsorientierte Beschreibungsformen bei der Angabe der Spezifikation, ihrer Verfeinerung und ihrer Vervollständigung, sie unterstützen die Entwicklung durch Modellbildung, sie liefern die Basis für eine funktionsorientierte Testdatenselektion mit Adäquatheitsprüfung, sie können bei geeigneter Interpretierbarkeit über den Datenbereichen zur automatisierten Testfallgenerierung genutzt werden und unterstützen als suboptimale Testorakel eine automatisierte Auswertung des dynamischen Tests. Diese Skizze zeigt die praktische Umsetzbarkeit der vorwiegend theoretischen Ergebnisse dieser Arbeit und setzt einen Impuls für ein verstärktes Aufgreifen funktionsorientierter Techniken in Wissenschaft und Praxis.
Die enorme Nachfrage nach neuartigen Naturstoffen sowie Leitstrukturen für die (Teil-) Synthese pharmazeutischer Produkte verlangt ständig nach neuen Innovationen. Ein bedeutender Impuls ist dabei von der Marinen Biotechnologie zu erwarten, die seit einigen Jahren versucht, die sich bietenden medizinischen Potentiale auszuschöpfen. So können neuartige Wirkstoffe bzw. die für deren Produktion verantwortlichen Organismen und Enzyme isoliert und bereitgestellt werden. Häufig ist das Wachstum der Organismen jedoch stark limitiert sowie eine Produktion der Ziel-Metabolite nur unter bestimmten Bedingungen möglich, weshalb ein enormes Interesse an neuen Optimiermethoden zur Lösung des Problems besteht. Neuartige Lösungsansätze sollten daher im Rahmen dieser Arbeit verfolgt werden. Untersucht wurde eine „biochemische“ Wachstums- und Produktionsoptimierung mariner Bakterien durch einen Zusatz von Homoserinlactonen zum Kultivierungsmedium. Dabei konnte neben einem verbesserten Wachstum diverser Prokaryonten eine leichte Variation im Metabolitspektrum ermittelt sowie eine geringfügig erhöhte Produktion biologisch aktiver Substanzen detektiert werden. Soll das Wachstum von (marinen) Mikroorganismen optimiert werden, wird vom Anwender häufig eine unstrukturierte one-factor-at-a-time-Methode angewendet. Da diese in der Regel keine Beeinflussung der zu optimierenden variablen Parameter beachtet, wurden in dieser Arbeit alternativ rechnergestützte Optimierungen zur Umgehung dieses Problems durchgeführt. Zum Einsatz kam dabei eine Kombination aus einem Genetischen Algorithmus, welcher die Identifikation des globalen Optimums erlaubt und einem Simplex-Algorithmus, der zur Verfeinerung des bereits aufgefundenen Optimums dient. Hiermit konnte die Produktion einer marinen L-Serindehydratase im Rahmen einer Nährmediumsoptimierung um mehr als 50 % im Vergleich zum Referenzmedium gesteigert werden. Des Weiteren wurde ein im Polyketidscreening positiv aufgefallenes Bakterium (Halomonas marina) als Modellorganismus für ein neuartiges rechnergestütztes Verfahren eingesetzt, welches eine schnelle Identifizierung der Güte von Wachstumsparametern erlaubt und dabei eine repetitiv geführte Batch-Betriebsweise von Bioreaktoren nutzt. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit ist die Charakterisierung einer rekombinant exprimierten Tryptophan-5-Halogenase. Hierbei konnte nach der Identifizierung des Aktivitätsoptimums hinsichtlich des einzustellenden pH-Werts sowie der Temperatur die Halbwertszeit des Enzyms bei verschiedenen Temperaturen bestimmt und mittels 2 D-Gelelektrophorese der pI-Wert des Enzyms erstmalig determiniert werden. Ein Fokus dieser Untersuchungen lag auf der Optimierung der Enzymkinetik. Dabei konnte insgesamt eine Verbesserung der Ausbeute um den Faktor 1,6 erzielt werden.