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Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Spin-Label Aminosäure HO3007 (ein Derivat des Alanins, dessen Seitenkette mit dem Spinlabel 2,2,5,5-Tetramethylpyrrolin-nitroxid modifiziert ist) mit der Methode der amber-Suppression in Proteine inkorporiert werden kann. Der Einbau wurde ESR-spektroskopisch nachgewiesen. Dazu wurde eine neue amber-Suppressor tRNA synthetisiert. Am Akzeptorstamm trägt die tRNA die Spin-Label-Aminosäure HO3007, mit ihrem Anticodon erkennt die tRNA das amber Codon. Der Einbau der Aminosäure erfolgte in ein 137 Aminosäuren langes N-terminales Fragment des humanen Mtj1p-Proteins in vitro. Zu diesem Zweck wurde in den in vitro Expressionsvektor pIVEX2.3MCS das Gen für ein 137 Aminosäuren langes N-terminales Fragment des humanen Mtj1p-Proteins einkloniert. Das Gen wurde so mutiert, dass sich an der Position des Codons für die Aminosäure Phe113 (TAC) die amber-Mutation (TAG) befindet. Der neu synthetisierte Vektor trägt die Bezeichnung pIVEX2.3MCSMtj1pN-term. Der Vektor und die amber-Suppressor tRNA wurden in einem E.coli in vitro Translationssystem eingesetzt. Die hohen gebundenen Anteile der anschließend gemessenen ESR-Spektren zeigen, dass die Spin-Label Aminosäure in das nativ gefaltete N-terminale Fragment des Mtj1p-Proteins eingebaut wurde. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass das Substratanalogon 2-N3-2’,3’-SL-ATP auch in der isolierten -Untereinheit der FOF1-ATP-Synthase des thermophilen Bacillus PS3 an die katalytische Bindungsstelle bindet und somit für weitergehende Untersuchungen von Struktur-Funktionsbeziehungen als Reportermolekül geeignet ist. Dazu wurde die isolierte -Untereinheit mit dem Substratanalogon 2-N3-2’,3’-SL-ATP kovalent markiert und anschließend tryptisch verdaut. Die entstandenen Peptidfragmente wurden mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie analysiert. Mit Hilfe der MASCOT-Datenbank und der Software BioTools der Fa. Bruker konnte ein Fragment identifiziert werden, bei dem Tyr 341, das sich in der katalytischen Bindungsstelle befindet, mit dem ADP-Derivat von 2-N3-2’,3’-SL-ATP kovalent markiert ist. Einen weiteren Hinweis für die erfolgreiche kovalente Modifizierung der -Untereinheit mit 2-N3-2’,3’-SL-ATP lieferte die Untersuchung des unverdauten Proteins im MALDI-TOF Massenspektrometer. Im Vergleich zum unmodifizierten Protein weist der Peak der modifizierten -Untereinheit ein deutliches Peak-tailing zu höheren Massen auf. Da die Proben vor der Messung entsalzt wurden, spricht diese Beobachtung deutlich für die kovalente Modifizierung des Proteins. Die Ergebnisse dieses Teils der Arbeit beweisen, dass das Substratanalogon 2-N3-2’,3’-SL-ATP auch im Fall der isolierten -Untereinheit an die katalytische Bindungsstelle bindet.
Die FoF1-ATP-Synthase katalysiert die Synthese von ATP aus ADP und Pi bei der oxidativen bzw. Photophosphorylierung. Der ATP-Synthase-Komplex läßt sich in zwei funktionelle Einheiten unterteilen: Fo ist ein integraler Membranproteinkomplex, der den Protonenkanal bildet. F1 hingegen ist ein wasserlöslicher Proteinkomplex, der die Nukleotidbindungsstellen trägt. Die ATP-Synthase aus Escherichia coli hat die Zusammensetzung alpha3beta3gamma delta epsilon für die F1 und ab2c9-12 für den Fo-Teil. "Native" (d.h. nicht nukleotidbefreite) F1 aus Escherichia coli (EF1) wurde mit verschiedenen spinmarkierten Adeninnukleotiden ESR-spektroskopisch vermessen. Es wurden Spektren mit zwei Signalen gemessen, ein Hinweis auf zwei verschiedene Konformationen der Bindungsstellen. Durch Titrationsexperimente wurden die Bindungsstöchiometrie und die Spektren für die verschiedenen verwendeten Nukleotide ermittelt. Die gleichen Experimente wurden mit einer Mutante, die in den nichtkatalytischen Bindungsstellen keine Nukleotide bindet, durchgeführt. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, daß zwei der drei katalytischen Bindungsstellen zum äußeren Signal beitragen, während die dritte das innere Signal hervorruft. Die Untereinheiten alpha; und beta der EF1, wurden isoliert und in gleicher Weise wie die F1 untersucht. Während alpha; 0,8 Moleküle SL-ATP binden konnte, zeigte beta keine Bindung. Mit 2',3'-SL-ATP in Komplex mit alpha; konnten ESR-Spektren mit zwei Signalen gemessen werden, die SL-ATP-Derivate, bei denen der Spin-Label entweder an der 2'- oder 3'-Position fixiert ist, zeigten lediglich ein Signal. Die beobachteten 2Azz-Werte unterscheiden sich stark in Abhängigkeit von der Position des Spin-Labels. Um die Bindung der F1 an den Fo-Teil und die Struktur des aus den b- und delta-Untereinheiten gebildeten zweiten Stiels zu untersuchen, wurden verschiedene Mutanten einer wasserlöslichen Form der b-Untereinheit (bsyn) mit dem Spin-Label IodacetamidTEMPO markiert. Das System F1/bsyn wurde mit den an unterschiedlichen Positionen markierten bsyn-Mutanten ESR-spektroskopisch untersucht. Dabei wurden Spektren von freiem bsyn sowie bsyn im Komplex mit F1 und F1-delta (alpha3beta3gamma epsilon) aufgenommen: Alle gelabelten b-Mutanten weisen ähnliche ESR-Spektren von stark mobilen Spin-Labeln auf. Die ähnlichen Werte lassen darauf schließen, daß der b-Dimer über weite Teile eine vergleichbare Struktur besitzt. Im Komplex mit F1 zeigen fast alle Mutanten eine stärkere Immobilisierung als die freien b-Mutanten. Tendenziell nimmt in Richtung des C-Terminus die Differenz der Hochfeld : Mittelfeld-Verhältnisse der Spektren von b und F1/b zu, was die Vermutung nahelegt, daß die Bindung von b an die F1 in Richtung des C-Terminus stärkeren Einfluß auf die Struktur hat. bsyn im Komplex mit F1-delta zeigt nur an einzelnen Positionen eine stärkere Immobilisierung des Spin-Labels. Es scheint somit wahrscheinlich, daß die b-Untereinheit außer über delta noch weitere Kontakte mit der EF1 hat.