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Der TRPV5 Ionenkanal ist ein hoch selektiver Kalziumkanal, der in der Niere exprimiert wird und dort für den transzellulären Kalziumtransport im distalen Konvolut verantwortlich ist. TRPV5 Transkripte sind auch in anderen Geweben, wie z.B. der Plazenta, identifiziert worden. In dieser Arbeit wurde versucht, das TRPV5 Protein in verschiedenen Geweben nachzuweisen und den Kanal sowie eventuell daran assoziierte Proteine aus der Plazenta zu isolieren. Hierzu wurden verschiedene Strategien verfolgt. Zum einen wurden vier polyklonale Peptidantikörper generiert, einer gegen einen N- und drei gegen C-terminale Bereiche des humanen TRPV5 Proteins. Diese wurden eingehend mittels ELISA, Peptidblot-Analysen, Western Blot Analysen und immunhistochemischen Färbungen bezüglich ihrer Spezifität und Affinität charakterisiert. Alle generierten Antikörper erkennen spezifisch nur die antigenen Bindungsregionen in Glutathion-S-Transferase (GST)-TRPV5-Fusionsproteinen und detektieren das endogen in humaner Plazenta exprimierte Protein. Der Antikörper, der gegen den absoluten C-Terminus des TRPV5 Ionenkanals gerichtet ist (982/3), erwies sich zum Nachweis des TRPV5 Proteins im distalen Konvolut in Mausnieren als geeignet, allerdings zum Nachweis des TRPV5 Proteins im Synzytiotrophoblasten der humanen Plazenta, ist einer der anderen C-terminalen TRPV5 Antikörper besser geeignet. Der Antikörper 982/3 wurde auch in Immunpräzipitationen und Antikörper-Affinitäts-chromatographien eingesetzt. Mit diesen beiden Methoden konnte das TRPV5 zwar in kleinen Mengen aus humanem Plazentagewebe bzw. Mausnieregewebe angereichert und im anschließenden Western Blot detekiert werden, allerdings war die Menge des isolierten Proteins so gering, dass eine massenspektrometrische Identifikation nicht möglich war. Parallel wurden GST-Pulldown Versuche mit Fusionsproteinen, die den N- und C-Terminus des TRPV5 Proteins enthalten, mit Proteinextrakten der humanen Plazenta durchgeführt. Hierbei wurden insgesamt 38 Proteine als putative Interaktionspartner von TRPV5 identifiziert. Darunter befinden sich bereits in der Literatur beschriebene Interaktionspartner, wie NHERF2 und Galectin-1, und zahlreiche potentielle TRPV5 bindende Proteine. Zu den häufigsten identifizierten Proteinen zählen die Proteine 11ß-HSD2, Ku70 und Calpain-6. Ihre Bindung an N- und C-terminale Bereiche des Ionenkanals, nicht aber an GST konnte in weiteren GST-Pulldown-Experimenten und anschließender Identifikation im Western Blot bestätigt werden. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass das TRPV5 Protein in der humanen Plazenta an der Blut-Plazenta Schranke exprimiert wird. Aller Wahrscheinlichkeit nach ist dort das Protein mit anderen Proteinen assembliert. Inwiefern diese Interaktionen die Kanalaktivität beeinflussen müsste in weiteren Experimenten untersucht werden.
TRP-Proteine sind integrale Membranproteine, die Untereinheiten von Kationenkanälen bilden, die z.B. an der Schmerz und Temperaturwahrnehmung, der Absorption von Mg2+ und Ca2+ im Darm und in der Niere oder für die Freisetzung von Entzündungsmediatoren in Immunzellen verantwortlich sind.
Das in der vorliegenden Arbeit untersuchte TRPV6-Protein stellt einen hochselektiven Ca2+¬-Kanal dar, der für den tranzellulären Ca2+-Transport in Endothelzellen des Dünndarms und der Plazenta verantwortlich ist und für den bisher noch kein hochaffiner Agonist bekannt ist. Das niedrig exprimierte, integrale Membranprotein konnte ich erstmal im Rahmen meiner Diplomarbeit aus humaner Plazenta zusammen mit Annexin A2 und Cyclophilin B (CyPB) anreichern. Diese putative Interaktion zwischen dem Ionenkanal und CyPB wird im Rahmen meiner Doktorarbeit mit Coimmunpräzipitation, Saccharosedichtegradientenzentrifugation, Peptidblotanalyse und GST-Pulldown-Analysen untersucht. Hierbei kann die TRPV6-CyPB-Interaktion in Immunpräzipitationen mit unabhängigen Antikörpern bestätigt werden. Die Ergebnisse der Dichtegradientenzentrifugation belegen die Existenz von TRPV6-Multimeren bzw. von TRPV6 enthaltenden Multiproteinkomplexen. Unter diesen Bedingungen ist allerdings keine CyPB-Assoziation mit dem TRPV6-Protein festzustellen. Das Einengen der Bindestelle von CyPB im TRPV6-Protein mittels Peptidblot- und GST-Pulldown-Analyse führt zur der potentiellen Bindungsstelle mit der minimalen Aminosäuresequenz Y66EDCKV71.
Meine Ergebnisse waren Ausgangspunkt für die funktionelle Charakterisierung der TRPV6-CyPB-Interaktion in Xenopus laevis Oozyten, die zeigt, dass CyPB den Ionenkanal aktiviert. Die Bindung zwischen beiden Proteinen ist offenbar wenig affin und scheint nur unter den gegebenen Solubilisierungsbedingungen nachweisbar.
Zur Erhaltung möglicher kalziumabhängiger Proteinbindungen wird die zuvor benutzte mehrstufige TRPV6-Affinitätschromatographie, bestehend aus einer CaM- und einer TRPV6-Antikörpersäule, durch eine einstufige Affinitätsreinigung ersetzt. Zur Solubilisierung und Isolierung des TRPV6-enthaltenden Proteinkomplexes eignen sich hierbei insbesondere die nichtionischen Detergenzien Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) und Digitonin.
Zur Auftrennung und Untersuchung der isolierten TRPV6-Proteinkomplexe kann weiterhin eine zweidimensionale Blue Native-Gelelektrophorese (BN-PAGE) etabliert und die daraus isolierten Proteine massenspektrometrisch analysiert werden. Für die Auftrennung der TRPV6-Proteinkomplexe in der BN-PAGE eigenen sich ebenfalls am besten die nichtionischen Detergenzien DDM und Digitonin. Das TRPV6-Protein wird nach der nativen BN-PAGE als Bestandteil eines oder mehrerer Proteinkomplexe mit einem Molekulargewicht von 440 - 670 kDa detektiert.
Abschließend wird die Übertragbarkeit der für TRPV6 etablierten Vorgehensweise zur Isolierung von Membranproteinkomplexen auf andere TRP-Kanalproteine in verschiedenen Geweben gezeigt. So kann TRPV6 aus Mausplazenta und das TRPC6-Membranprotein aus murinen Mastzellen und Mauslungengewebe mittels Coimmunpräzipitation und Affinitätschromatographie isoliert und spezifisch detektiert werden.