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Die Kenntnis der Transportmechanismen von polaren und unpolaren Molekülen durch biologische Membranen ist notwendig für das Verständnis von vielen biologischen Vorgängen. Die vorliegende Arbeit soll einen Beitrag zum Verständnis des Transportes von kleinen Molekülen durch Phospholipidmodellmembranen liefern. Hierzu wurden kinetische und kalorimetrische Messungen an Lipidvesikeln durchgeführt. Besonders großes Interesse bestand darin, zu klären, wie diese Moleküle die Membran durchqueren. Um das Permeationsverhalten von Wasser zu erforschen, wurden systematische Untersuchungen der osmotisch getriebenen und der diffusionskontrollierten Wasserpermeation an Lipiddoppelschichten, hergestellt aus Phospholipiden mit unterschiedlichen Kopfgruppen und unterschiedlichen Fettsäureketten durchgeführt. Dabei wurde auch die Permeationsgeschwindigkeit im Phasenumwandlungsbereich untersucht. Die diffusionskontrollierte Wasserpermeation wird mit Hilfe des H2O/D2O-Austauschverfahrens gemessen und bei osmotischen Messungen erzeugt man einen Konzentrationsgradienten zwischen intra- und extravesikulärem Raum. Es wurde für alle Lipide und Lipidgemische eine sprunghafte Zunahme der osmotischen und diffusiven Wasserpermeation an der Hauptphasenumwandlung gel -> flüssigkristallin gefunden. Die Permeabilitätskoeffizienten für die osmotische Wasserpermeation lagen bei allen Messungen um den Faktor 100 höher als die Werte für die diffusionskontrollierte Wasserpermeation. Im Phasenumwandlungsbereich durchlaufen die Permeabilitätskoeffizienten ein Maximum. Die experimentell gewonnenen Daten lassen einen Wassertransport durch transiente Poren, die sich durch Defektstellen und thermische Fluktuationen in der Doppelschicht bilden, vermuten und widersprechen einem Löslichkeitsdiffusionsmechanismus. Um den Einfluß des Konzentrationsgradienten auf die Permeation näher zu untersuchen, wurden osmotische Messungen mit unterschiedlichen Harnstoffkonzentrationen durchgeführt. Es zeigte sich, daß die Wasserpermeation abhängig vom angelegten Konzentrationsgradienten war, während die Harnstoffpermeation keine Abhängigkeit zeigte. Die stark unterschiedlichen Permeabilitätskoeffizienten der beiden Moleküle legen den Verdacht nahe, daß sie auf unterschiedlichen Wegen die Lipiddoppelschicht durchdringen. Um das Permeationsverhalten von kleinen Molekülen aufzuklären, wurden Messungen der diffusionskontrollierten Permeation vorgenommen. Desweiteren war von Interesse ob durch den Einbau von Detergensmoleküle in die Lipidmembran die Permeationseigenschaften der Moleküle verändert werden. Mit Hilfe der gewonnen Daten sind Rückschlüsse auf den Mechanismus der Permeation von kleinen Molekülen durch biologische Membranen möglich.
Prozeßanalyse und Modellbildung bei der Herstellung gewebeverstarkter, thermoplastischer Halbzeuge
(1999)
Werkstoff- und verarbeitungsspezifische Vorteile gewebeverstärkter, thermoplastischer Faser-Kunststoff-
Verbunde bieten ein erhebliches Potential für die Umsetzung konsequenter Leichtbauweisen in den verschiedenen Anwendungsbereichen der Industrie. In der Regel erfolgt die
Herstellung von Bauteilen in einer Prozeßkette, die sich aus den beiden Kernprozesse Verbundbildung (Imprägnierung und Konsolidierung) und Formgebung zusammensetzt. Die Verbundbildung erfolgt mit Hilfe diskontinuierlicher (Autoklav, Etagenpresse) oder kontinuierliche (Kalander, Doppelbandpresse) Verfahren, die z.B. umformbare Halbzeuge wie ORGANOBLECHEN, zur weiteren Verarbeitung bereitstellen. Diese Entkopplung des Imprägnierungsprozesses der Verstärkungstextilien mit thermoplastischer Matrix von der Bauteilherstellung ermöglicht - analog der Blechumformung - eine großserientaugliche Prozeßtechnik mit kurzen Taktzeiten. Alle wesentlichen Eigenschaften des Verbundwerkstoffes werden so während der Halbzeugherstellung determiniert, während die Bauteilherstellung dann nur der Umformung dient. Auf dem Verbundwerkstoffmarkt ist ein Reihe von Halbzeugen mit verschiedenen Eigenschaftsprofilen verfügbar. Infolge des ständigen Wandels der werkstofflichen Anforderungsprofile
ist jedoch eine permanente Weiterentwicklung der Halbzeuge notwendig. Hieraus resultiert für die Werkstoffhersteller ein großes technisches und wirtschaftliches Risiko, da die
aufwendige Werkstoffentwicklung - aufgrund mangelnder wissenschaftlicher Grundlagen - mit erheblichen Unsicherheiten behaftet ist. Derzeit wird die Neuentwicklung von anforderungsspezifischen Halbzeugen mit Hilfe von Trial- and-Error Versuchen hinsichtlich der universellen Prozeßparameter (Temperatur, Zeit und Druck) betrieben. Derartige Versuchsreihen bedingen einen beträchtlichen finanziellen und zeitlichen Umfang und stellen somit ein wesentliches Entwicklungsrisiko dar. Darüber hinaus sind die Ergebnisse nur für Anlagen gleichen Typs und Bauart uneingeschränkt anwendbar. Eine Übertragbarkeit der Prozeßparameter auf andere Anlagenkonzepte ist nicht gegeben, so daß die Prozeßfenster jeweils immer individuell ermittelt werden müssen. Aufgrund
dieser aufwendigen Vorgehensweise werden deshalb intensive Anstrengungen unternommen, die während der Materialherstellung auftretenden Vorgänge mathematisch zu
modellieren, um dann durch rechnerische Simulation der Verarbeitungsprozesse eine Abschätzung des energetischen und zeitlichen Aufwandes zu ermöglichen. Daraus ergab sich die Aufgabe, das Imprägnierungs- und Konsolidierungsverhalten gewebeverstärkter, flächiger thermoplastischer Halbzeuge durch umfangreiche Untersuchungen an verschiedensten Materialkombinationen zu analysieren. Ziel war es, die bei der Halbzeugherstellung
auftretenden Effekte zu charakterisieren, Ansätze zu deren Modellierung zu entwickeln und Erkenntnisse zur Optimierung der Prozeß- und Materialparameter zu gewinnen. Wesentliche Ergebnisse der Prozeßanalyse sind das Auftreten von transversalen Makro- und Mikroströmen sowie das Entstehen von festigkeits- und steifigkeitsreduzierenden Bindenähten
und Lufteinschlüssen. Ferner laufen innerhalb der Faserbündel, temperatur- und druckabhängige Lösungs- und Diffusionsvorgänge bei der Eliminierung der Lufteinschlüsse sowie Wechselwirkungen zwischen elastischen Geweben und strömender Matrix ab. Zentrales Ergebnis der Untersuchung stellt ein abgeleitetes System von funktionalen Abhängigkeiten dar, welches einen ersten, grundlegenden Schritt zur Erstellung eines umfassenden Simulationsmodells des komplexen Prozesses bildet. Hiermit schließt die vorliegende Arbeit erstmals eine Lücke zwischen anlagenspezifischen Versuchsreihen und der allgemeinen numerischen Prozeßsimulation, die es ermöglicht, das
Imprägnierungs- und Konsolidierungsverhalten gewebeverstärkter thermoplastischer Halbzeuge auf experimenteller Basis anlagenunabhängig zu beschreiben. Dazu wurden die regelbaren Prozeßgrößen Verarbeitungstemperatur T (°K), Verarbeitungszeit t (s) und
Konsolidierungsdruck P (Pa) zu einer dimensionslosen, matrixspezifischen Prozeßkonstanten - B-Faktor (tP/n(T))- zusammengefaßt, die den Verarbeitungszyklus energetisch und zeitlich bilanziert. Diese Vorgehensweise erlaubt die Untersuchung des funktionalen Zusammenhangs zwischen Prozeßregelgrößen und Imprägnierungsqualität innerhalb bestimmter Grenzen sowie den Vergleich verschiedenartiger diskontinuierlicher und kontinuierlicher Anlagentypen und
die Ableitung von Substitutionsbeziehungen zwischen den Regelgrößen. Dabei konnte gezeigt werden, daß die imprägnierungsbedingte Abnahme der Halbzeugdicke in Abhängigkeit des B-Faktors unabhängig von der verwendeten Anlagentechnik einem exponentiellen Gesetz folgt, dessen halbzeugspezifische Regressionskoeflizienten die während der Imprägnierung und Konsolidierung auftretenden Effekte zusammenfassen und die Ableitung optimaler Prozeßeinstellungen erlauben. Damit ist es möglich, für bestimmte Materialpaarungen mit Hilfe des B-Faktors einen Verarbeitungsbereich zu identifizieren, der aufgrund der
anlagenunabhängigen Betrachtungsweise der Parameter Temperatur, Imprägnierzeit und Konsolidierungsdruck
unter Berücksichtigung verschiedener Randbedingungen prinzipiell auf jede beliebige Anlagenkonfiguration zur Imprägnierung und Konsolidierung übertragen werden kann. Dies schließt deshalb nicht nur diskontinuierliche und kontinuierliche Prozesse zur Herstellung flächiger Halbzeuge, sondern darüber hinaus auch Verfahren zur Weiterverarbeitung dieser Materialien ein. Für jede potentielle Materialpaarung kann, ähnlich wie bei rheologischen Kennwerten für Kunststoffe, mit standardisierten Methoden eine Datenbasis geschaffen werden, die die Abhängigkeit des Imprägnierungsgrades von den Verarbeitungsbedingungen beschreibt. Damit kann der Versuchsaufwand bei der Einführung eines neuen Werkstoffsystems auf einer Anlage reduziert, die Verarbeitung wirtschaftlich optimiert, die Beanspruchung der Werkstoffkomponenten bei der Verarbeitung minimiert und die Einsatzstoffe verarbeitungsgerecht modifiziert werden.
Synthese und erste Anwendungen pH-sensitiver Spinmarker für site-specific spin-labelling Experimente
(1999)
Im Laufe der letzten Jahre ergaben wissenschaftliche Beobachtungen, daß verschiedene anthropogene Umweltkontaminanten, auch als endokrin wirksame Substanzen oder endocrine disruptors bezeichnet, einen negativen Effekt auf das Reproduktionsvermögen von wildlebenden Tierpopulationen haben können. Für eine Reihe von Umweltkontaminanten, zuerst hauptsächlich in aquatischen Systemen beschrieben, wird vor allem eine estrogene Wirkung auf den Organismus diskutiert. In einigen Wildtierspezies, wie Alligatoren (Guilette, 1994), Seevögeln (Fry, 1981), Fischen (Jobling, 1993) und Mollusken (Bryan, 1986) wurde das Auftreten von strukturellen Geburtsfehlern der primären Geschlechtsorgane, Verhaltensanomalien beispielsweise während der Brutpflege und eine Verschiebung des Geschlechtergleichgewichtes bereits beschrieben.
Das Enzym F0F1-ATP-Synthase katalysiert die Phosphorylierung von ADP zu ATP unter Ausnutzung des durch die Atmungskette entstehenden Protonengradienten an Membranen. Hierbei pumpt der membranintegrale F0-Teil des Proteins Protonen durch die Membran und induziert die ATP-Synthese, welche auf dem peripheren, wasserlöslichen F1-Teil des Proteins (F1-ATPase) stattfindet. F0 besteht aus drei Proteinuntereinheiten der Stöchiometrie a b_2 c_9-12, während F1 aus fünf Untereinheiten der Stöchiometrie alpha_3 beta_3 gamma delta epsilon zusammengesetzt ist. 'Native' und nucleotidbefreite F1-ATPase aus Escherichia coli (EF1, mit und ohne intrinsischen Nucleotiden) wurde mit 2',3'-O-(1-Oxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidyliden)-adenosin-5'-triphosphat (SL*-ATP) als Mg2+-Komplex mit ESR-Spektroskopie untersucht. Durch Titrationsexperimente wurden die Bindungsstöchiometrie und die ESR-Spektren in Abhängigkeit der Nucleotidkonzentration ermittelt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen deuten darauf hin, dass unabhängig von der Anwesenheit intrinsischer Nucleotide maximal 3 mol SL*-ATP pro mol Enzym ausschliesslich in den katalytischen Nucleotidbindungsstellen gebunden wurden. Molekülmodelle von SL*-ATP in den Bindungsstellen von mitochondrialer F1-ATPase unterstützten diese Resultate ebenso wie ATPase-Aktivitätstests von EF1 mit SL*-ATP als Substrat. Bei nucleotidbefreiter EF1 war die Substratsättigung bei substöchiometrischen Nucleotidkonzentrationen höher als beim nativen Enzym. Die ESR-Spektren von EF1 mit SL*-ATP.Mg2+ zeigten zwei au! f unterschiedliche Spinsonden-Mobilitäten hinweisende Komponenten beim nucleotidbefreiten Enzym und nur eine bei nativem Enzym. Ein verkürzter, wasserlöslicher Teil der b-Untereinheit von EF0 (b_sol) wurde mit Raum- und Tieftemperatur-ESR-Spektroskopie auf seine Struktur als Untereinheiten-Dimer alleine und an F1 gebunden untersucht. Bei Tieftemperatur-ESR-Spektren ist das Signalamplituden-Verhältnis von Tief- und Hochfeldsignal zu Zentralfeldsignal, auch als Kokorin-Zamaraev-Parameter bezeichnet, ein Indikator für dipolare Wechselwirkungen von Spinsystemen und somit für deren Abstand im Bereich von 8-25 Å. Es wurden einerseits verschiedene Cystein-Mutanten von b_sol (als b_syn bezeichnet) und andererseits eine Cysteinmutante von EF1 spezifisch kovalent mit Spinlabeln verknüpft. Die vermessenen b_sol-F1-Komplexe waren somit zum einen ausschliesslich an b, andererseits nur an EF1 und ferner sowohl an b als auch an EF1 spinmarkiert. Die Messungen ergaben, dass die Struktur des carboxyterminalen Bereichs von b_sol zwischen den Aminosäurenpositionen 124 und 139 alphahelikalen Charakter besitzt. Aufgrund vo! n Differenzen der Kokorin-Zamaraev-Parameter scheinen sich bei der Bindung von b_sol an EF1 die Helices der Untereinheiten des b_sol-Dimers gegeneinander zu verdrehen. Trotz Abwesenheit der delta-Untereinheit von EF1 schien b_sol an F1 zu binden. Die Strukturen von b_sol-Dimer alleine, im Komplex mit EF1 sowie EF1 ohne delta scheinen sich jeweils deutlich zu unterscheiden und weisen auf eine hohe Flexibilität der b-Untereinheit hin. Der Abstand der Nucleotidbindungsstellen auf den beta-Untereinheiten von EF1 zum Proteinrückgrat von b_sol ist mit mehr als 20-25 Å einzuschätzen, da mit der oberen Messtechnik keine dipolaren Wechselwirkungen ausgemacht werden konnten. Molekülmodelle eines b_syn-Dimerenfragments im Bereich der Aminosäurenpositionen 120-145 am carboxyterminalen Ende von b sowie verschiedener spinmarkierter Varianten des gleichen Dimerenfragments zeigten eine Verdrehung der beiden Helix-Längsachsen zueinander. Zwischen den Spinsystem-Abständen im Modell und den geme! ssenen Kokorin-Zamaraev-Parametern war eine Korrelation ersichtlich.
Die zweikernigen Eisenkomplexe [{CpR(OC)2Fe}2] (1) reagieren mit weißem Phosphor unter milden Bedingungen selektiv und in sehr guten Ausbeuten zu den Tetraphosphabicyclobutanderivaten 3, deren P4-Butterflygerüst durch zwei 17VE-{CpR(OC)2Fe}-Fragmente in exo/exo-Konfiguration stabilisiert ist. Mit der Röntgenstrukturanalyse des Tri-tert-butylderivates 3a konnte erstmals ein Molekül mit einem solchen Strukturinkrement vollständig charakterisiert werden. Sowohl die thermische als auch die photochemische Decarbonylierung von 3 führt zu den Cyclopentaphosphaferrocenderivaten [CpRFe(h5-P5)] (4) und den pseudo-Tripeldeckerkomplexen [{CpRFe}2(m-h4:4-P4)] (5), die sich auch durch die Langzeit-Cothermolyse der Eisendimere [{CpR(OC)2Fe}2] (1) mit überschüssigem weißen Phosphor herstellen lassen. Die beiden Tri-tert-butylderivate 4a und 5a konnten röntgenstrukturanalytisch untersucht werden. Die thermische Umsetzung äquimolarer Mengen der P4-Butterflymoleküle 3 mit Bisphenyl-acetylen führt zu sehr interessanten neuartigen Produkten: So konnte bei der Reaktion von 3a mit Tolan ein ferrocenanaloges Sandwichmolekül 7a, dessen zentrales Eisenatom jeweils von einem Tri-tert-butylcyclopentadienyl- und von einem 1,2,3-Triphospholylliganden h5-artig koordiniert ist, isoliert und ein solcher heteroaromatischer Ligand erstmals kristallstrukturanalytisch charakterisiert werden. Darüber hinaus konnte bei dieser Reaktion ein weiteres Sandwichmolekül - (Tri-tert-butylcyclopentadienyl)(tetraphospholyl)eisen(II) (8a) - NMR-spektroskopisch und massenspektrometrisch nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte bei der Umsetzung des Pentaisopropylderivates 3c mit Tolan ein zwar theoretisch vorhergesagter, aber bislang nicht experimentell bestätigter Undecaphosphor-Komplex isoliert und kristallstrukturanalytisch untersucht werden.
Sowohl die gesteigerte Komplexität der Signalverarbeitungsalgorithmen und das umfangreichere Diensteangebot als auch die zum Erzielen der hohen erforderlichen Rechenleistungen erforderliche Parallelverarbeitung führen künftig zu einer stark ansteigenden Komplexität der digitalen Signalverarbeitung in Mobilfunksystemen. Diese Komplexität ist nur mit einem hierarchischen Modellierungs- und Entwurfsprozeß beherrschbar. Während die niedrigeren Hierarchieebenen der Programmierung und des Hardwareentwurfs bereits heute gut beherrscht werden, besteht noch Unklarheit bei den Entwurfsverfahren auf der höheren Systemebene. Die vorliegende Arbeit liefert einen Beitrag zur Systematisierung des Entwurfs auf höheren Hierarchieebenen. Hierzu wird der Entwurf eines Experimentalsystems für das JD-CDMA-Mobilfunkkonzept auf der Systemebene betrachtet. Es wird gezeigt, daß das Steuerkreismodell ein angemessenes Modell für die digitale Signalverarbeitung in einem Mobilfunksystem auf der Systemebene ist. Das Steuerkreismodell läßt sich einerseits direkt auf die in zukünftigen Mobilfunksystemen einzusetzenden Multiprozessorsysteme abbilden und entspricht andererseits auch der nachrichtentechnischen Sichtweise der Aufgabenstellung, in der das Mobilfunksystem durch die auszuführenden Algorithmen beschrieben wird. Das Steuerkreismodell ist somit ein geeignetes Bindeglied, um von der Aufgabenstellung zu einer Implementierung zu gelangen. Weiterhin wird gezeigt, daß das Steuerkreismodell sehr modellierungsmächtig ist, und sein Einsatz im Gegensatz zu vielen bereits bekannten Entwurfsverfahren nicht auf mittels Datenflußmodellen beschreibbare Systeme begrenzt ist. Die klassischen, aus der von Datenflußmodellen ausgehenden Systemsynthese bekannten Entwurfsschritte Allokierung, Ablaufplanung und Bindung können im Kontext der Steuerkreismodellierung als Verfahren zur Konstruktion der Steuerwerksaufgabe verstanden werden. Speziell für das Experimentalsystem werden zwei verschiedene Ablaufsteuerungsstrategien modelliert und untersucht. Die volldynamische Ablaufsteuerung wird zur Laufzeit durchgeführt und ist daher nicht darauf angewiesen, daß die auszuführenden Abläufe a priori bekannt sind. Bei der selbsttaktenden Ablaufsteuerung werden die hier a priori bekannten Abläufe zum Zeitpunkt der Systemkonstruktion fest geplant, und zur Laufzeit wird dieser Plan nur noch ausgeführt. Schließlich werden noch die Auswirkungen der paketvermittelten burstförmigen Nachrichtenübertragung auf die digitale Signalverarbeitung in zukünftigen Mobilfunksystemen untersucht. Es wird gezeigt, daß es durch Datenpufferung sehr gut möglich ist, die Rechenlast in einem Mobilfunksystem zu mitteln.
Diese Dissertation ist ein Beitrag zur Untersuchung der Anwendbarkeit der Random-Matrix-Theorie (RMT) in der Quantenchromodynamik (QCD). Untersucht werden die Fluktuationen der kleinen Eigenwerte des Dirac-Operators mit Kogut-Susskind-Fermionen und SUc(2)-Eichfeldern. Diese werden mit Hilfe eines Hybrid-Monte-Carlo-Algorithmus erzeugt. Die Universalität der Fluktuationen kleiner Eigenwerte, das heisst die Übereinstimmung der numerisch berechneten Spektren mit den Vorhersagen des chiralen Random-Matrix-Modells wird in dieser Arbeit nachgewiesen. Die Bedeutung dieses Resultats liegt in der Allgemeinheit des Ansatzes, die QCD-Zustandssumme für ein endliches Volumen durch ein Random-Matrix-Modell zu approximieren.
Die Prämature Chromosomenkondensation (PCC) - Untersuchungen zum Einsatz in der Mutagenitätstestung
(1999)
In dieser Arbeit wurde die Wirkung der a,b-ungesättigten Aldehyde Crotonaldehyd (CA), trans-2-Hexenal (HX), und des N-Nitrosodiethanolamin (NDELA) untersucht. Als Kontrollsubstanzen wurde das als Aneugen bekannte Diethylstilbestrol (DES) und die als Klastogene bekannten Mutagene Mitomycin C (MMC) und Bleomycin (BLM) eingesetzt. Es wurde die Technik der vorzeitigen Chromosomenkondensation (PCC) an unstimulierten Lymphozyten in der G0-Phase eingesetzt, die für 1 Stunde mit dem jeweiligen Mutagen inkubiert worden waren. Das Ausmaß der mutagenen Schädigung bei den PCCs wurde lichtmikroskopisch durch Auszählen von Chromatinelementen analysiert. Ze llen mit mehr als 46 Chromatinelementen wurden als geschädigt gewertet. Die Resultate der PCC-Studien wurden mit den Ergebnissen aus 48 Stunden-Metaphasenkulturen verglichen. Mit der Fluoreszenz plus Giemsa (FPG)-Technik wurden die Mitosen, die zum erstenmal nach Mutagenapplikation das Metaphasestadium erreicht hatten, identifiziert. Die Metaphasenanalyse aus 48 Stunden-Kulturen zeigte für CA bei 60microM und für HX bei 100microM eine schwach signifikante Erhöhung der Anzahl aberranter Metaphasen. Die für CA zusätzlich durchgeführten 73 Stunden-Kulturen, bei denen die Mutagenbehandlung erst 48 Stunden nach Kulturansatz durchgeführt wurden, ergab ab 240microM eine schwach signifikante Erhöhung aberranter Metaphasen im Vergleich zu unbehandelten Lymphozyten. Die Analyse der Metaphasen aus 48 Stunden-Kulturen nach NDELA-Behandlung ergab, daß sich die Zahl der aberranten Metaphasen nur bei einer Konzentration von 2000microM signifikant im Vergleich zu den Zellen aus den Kontrollkulturen erhöhte. Die anderen getesteten NDELA-Konzentrationen auch die in den 73 Stunden-Kulturen eingesetzten erhöhten die Aberrrationsrate in den Metaphasechromosomen, allerdings statistisch nicht signifikant. Nach MMC-Behandlung (6microM) zeigten 27,5%, nach DES-Behandlung (100microM) 7,6% und nach Bleomycin-Behandlung (10microg/ml) 8,8% der Metaphasen Aberrationen. Damit war die Anzahl geschädigter Metaphasen im Vergleich zu den Zellen unbehandelter Kontrollkulturen nach MMC-Inkubation (6microM) und nach Bleomycin-Applikation (10microg/ml) statistisch hoch signikant, nach DES-Inkubation (100microM) allerdings nicht signifikant erhöht. Die PCC-Technik erwies sich als die im Vergleich zur Metaphasenanalyse sensitivere Methode. Alle getesteten Substanzen erhöhten die Anzahl der Chromatinelemente/Zelle dosisabhängig. Unbehandelte Lymphozyten wiesen zwischen 1,0 und 1,8 Fragmente pro geschädigte Zelle auf. Dabei waren zwischen 6,1 und 15,8% der unbehandelten Zellen geschädigt. Nach CA-Inkubation (240microM) stieg die Zahl geschädigter PCCs auf 48,7% an, wobei 3,4 Fragmente pro geschädigte Zelle zu beobachten waren. Nach Behandlung der Zellen mit HX(150microM) waren 42,9% der Zellen geschädigt und wiesen 4,6 Fragmente pro geschädigte Zelle auf. Damit war die Zunahme der Schädigung im Vergleich zur Kontrolle hoch signifikant. Die Inkubation mit NDELA schädigte die Lymphozyten in der G0-Phase bereits ab einer Konzentration von 1000microM hoch signifikant. Dabei waren 56,6% der Lymphozyten geschädigt und es traten 4,1 Fragmente pro geschädigte Zelle auf. Nach Inkubation mit MMC (20microM) waren 46,3% der Zellen geschädigt und wiesen 3,3 Fragmente pro geschädigte Zelle auf. Die Behandlung der Lymphozyten mit DES (200microM) induzierte in 26,3% der Zellen mehr als 46 Chromatinelemente pro Zelle, wobei 2,8 Fragmente pro geschädigte Zelle auftraten. Nach Behandlung der Lymphozyten mit a,b-ungesättigten Aldehyden wurde in den PCCs zusätzlich ein interessantes Phänomen beobachtet: die vorzeitig kondensierten Chromosomen erschienen im Vergleich zu den PCCs unbehandelter Zellen weniger stark kondensiert. Um das Ausmaß der Entspiralisierung erfassen zu können, wurden die PCCs zunächst semiquantitativ gemäß ihrem Kondensationsgrad in 4 Kategorien eingeteilt, wobei der Kategorie 1 die am stärksten kondensierten PCCs, der Kategorie 4 die am wenigsten kondensierten PCCs zugeordnet wurden. Bei einer CA-Konzentration von 480microM waren 55,6% und einer HX-Konzentration von 300microM waren 57,4% der untersuchten Zellen Kategorie 4 zuzuordnen. Durch die Kombination der PCC-Technik mit der Fluoreszenz in situ-Hybridisierung und den Einsatz einer Painting Sonde (exemplarisch für Chromosom 4) wurde die Längenveränderung der PCCs genauer quantifiziert werden. Dazu wurde die Länge der Chromosom 4-PCC vor und nach Behandlung mit Crotonaldehyd (240microM und 480microM) mit einem computergestützten Programm ausgemessen. So ergab sich nach Crotonaldehyd-Behandlung (480microM) durchschnittlich eine Längenzunahme um das zwei- bis dreifache. Elongierte PCCs wurden nach Inkubation der Lymphozyten mit NDELA und Bleomycin nicht beobachtet; nach Inkubation mit den Mutagenen MMC (20microM) und DES (200microM) trat dieses Phänomen nur leicht auf. Reparaturkinetikstudien mit den Hemmstoffen Arabinofuranosylcytosin, Hydroxyharnstoff und Novobiocin lassen eine verstärkte Excisionsreparatur als Ursache für die beobachtete verminderte Kondensation der PCCs nach Inkubation mit a,b-ungesättigten Aldehyden unwahrscheinlich erscheinen. Die nach Inkubation mit a,b-ungesättigten Aldehyden beobachtete verminderte Kondensation der PCCs ist eher das Resultat von Veränderungen der mitotischen Faktoren und/oder Chromatinstrukturen. Möglicherweise interferieren a,b-ungesättigte Aldehyde mit den Phosphorylierungsprozessen der Histone H1 und/oder H3, die für die PCC-Induktion bedeutsam sind und die durch die Aktivität der mitotischen Faktoren vermittelt werden.
Indirubin ist als antileukämischer Inhaltsstoff in Zubereitungen der traditionellen chinesischen Medizin erkannt und seine antineoplastische Wirkung in einer klinischen Studie an Patienten mit chronisch myeloischer Leukämie gezeigt worden. Ziel dieser Arbeit war es, bekannte und neue Indirubinderivate zu synthetisieren und Indizien für den Wirkmechanismus indigoider Bisindole zu finden. Ein Schwerpunkt sollte dabei in der Darstellung von in 5- und 3'-Stellung substituierten Indirubinderivaten liegen. Unter den 19 synthetisierten Indirubinderivaten sind die zehn neuen Verbindungen 5-Fluorindirubin, 5-Nitroindirubin, 5,5'-Dibromindirubin, das Natriumsalz der 5'-Bromindirubin-5-sulfonsäure, 5-Iodindirubin-3'-oxim sowie fünf Indirubin-5-sulfonsäureamidderivate. An der Verbindungsklasse werden detaillierte NMR-spektroskopische Untersuchungen vorgenommen. Außerdem werden Isoindigo und die beiden Bisindolderivate 2,2'-Bisindol sowie 3,3'-Diphenyl-2,2'-bisindol dargestellt. Identität und Reinheit der synthetisierten Verbindungen werden mittels Dünnschichtchromatographie, Elementaranalyse, Massenspektroskopie, Gaschromatograhie/Massenspektroskopie, UV-Spektroskopie sowie 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektroskopie nachgewiesen. Ergänzt durch kommerziell erhältliche Indigoderivate steht damit eine Auswahl an 2',3-, 2,2'- und 3,3'-Bisindolderivaten zur Verfügung. Bei cyclovoltammetrischen Untersuchungen an Indirubin und 5-Iodindirubin werden im beobachteten Spannungsbereich bei beiden Derivaten eine im Sinne der Cyclovoltammetrie irreversible Oxidation und zwei reversible Reduktionen registriert. Die Höhe der Wellen deutet darauf hin, daß das Indirubinsystem bei den beiden Reduktionen jeweils ein Elektron aufnimmt und bei der Oxidation zwei Elektronen abgibt. Zumindest die erste Reduktion liegt mit einem Halbwellenpotential von -0,8 V in einem Bereich, der physiologisch zugänglich sein sollte. Eine Überführung in eine der vorgeschlagenen oxidierten oder reduzierten Strukturen hätte mit großer Wahrscheinlichkeit eine bessere Löslichkeit und damit eine erhöhte Transportfähigkeit der Indirubinderivate in wäßrigen Systemen zur Folge. Die Ergebnisse des Ethidiumbromidverdrängungsassays deuten darauf hin, daß einige Indirubinderivate interkalative Wechselwirkungen mit der DNA eingehen können. Bei 5-Fluorindirubin, Indirubin-3'-oxim und Indirubin-5-sulfonamid kann ein ED50-Wert bestimmt werden, der fast in der Größenordnung des starken Interkalators Doxorubicin liegt. Eine Beteiligung der Interkalation am Wirkmechanismus scheint bei 5-Fluorindirubin und Indirubin-3'-oxim möglich, denn beide hemmen im gleichen Konzentrationsbereich das Wachstum im Sulforhodamin B-Assay und im Colony-Forming-Assay. Im Colony-Forming-Assay ist Isoindigo die aktivste Substanz. Indirubinderivate haben durchschnittliche IC70-Werte, die eine Größenordnung höher liegen. Die drei Indirubinderivate mit einer freien Sulfonsäuregruppe sowie Indigo sind kaum wirksam. Die sulfonierten Indigoderivate sind inaktiv. Die beiden Melanomzellinien MEXF 989 und MEXF 515LX zeichnen sich gegenüber einigen Verbindungen durch eine bis um den Faktor 75 unterschiedliche Sensitivität aus. Die Mammakarzinomzellinie MCF 7 wird von den meisten der Indirubinderivaten sowie von den beiden 2,2'-Bisindolderivaten stärker gehemmt als der Durchschnitt. Im Luciferase-Assay an transfizierten MCF 7-Zellen kann kein Hinweis auf eine hormonrezeptorgekoppelte Wirkung gefunden werden. Im Sulforhodamin B-Assay sind Isoindigo und Indirubin-3'-oxim die wirksamsten Substanzen. Dies bestätigt das Ergebnis der durchschnittlichen Wirksamkeit in den Colony-Forming-Assays. Die geringe absolute Löslichkeit sowohl in der lipophilen als auch in der hydrophilen Phase verhindert bei etwa der Hälfte der Verbindungen eine exakte Bestimmung des Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten (log POW). Dennoch wird für die restlichen Indirubinderivate eine gute Korrelation zwischen dem durchschnittlichen IC70-Wert im Colony-Forming-Assay und der Lipophilie der Substanzen gefunden. Das Optimum des log POW bewegt sich für Indirubinderivate in Bezug auf die Wachstumshemmung im Colony-Forming-Assay in einem Bereich von 3 bis 4. In ersten, orientierenden in vivo-Versuchen an thymusaplastischen Nacktmäusen, die das großzellige Lungenkarzinom LXFL 529 tragen, können Indirubin und 5-Chlorindirubin das Tumorwachstum verzögern aber nicht stoppen. 5-Methylindirubin, das schneller als die beiden anderen Derivate aus dem Injektionsbereich transportiert wird, kann ab etwa dem zehnten Tag der Behandlung das Tumorwachstum stoppen. Das Gesamtgewicht der Versuchstiere bleibt dabei konstant oder steigt leicht an. 5-Methylindirubin ist somit ein aussichtsreicher Kandidat für eine Weiterentwicklung in Richtung eines antineoplastischen Medikaments. Ausgehend von Indirubin kann durch die Variation der Substituenten eine Steigerung der Hemmwirkung am isolierten Enzymkomplex CDK1/Cyclin B um den Faktor 1200 erreicht werden. Das Natriumsalz der 3'-Hydroxyiminoindirubin-5-sulfonsäure hat einen IC50-Wert von 0,0083 microM. Die Substanzklasse besitzt außerdem eine hohe Selektivität gegenüber anderen Kinasen und übertrifft somit in Wirksamkeit und Selektivität die meisten bekannten CDK-Hemmstoffe. Für Isoindigo kann keine Hypothese zum Wirkmechanismus aufgestellt werden. Seiner hohen Aktivität im Colony-Forming-Assay und im Sulforhodamin B-Assay steht eine nur äußerst geringe Interkalationsfähigkeit sowie eine kaum vorhandene Fähigkeit zur Hemmung des Enzymkomplexes CDK1/Cyclin B gegenüber. In einer Röntgenstrukturanalyse von humaner CDK2 im Komplex mit Indirubin-5-sulfonat bzw. Indirubin-3'-oxim wird deutlich, daß sich die Inhibitoren in die ATP-Bindungstasche einlagern. Im Bereich der Aminosäuren Phe80 bis His84 ist die Form der Indirubinmoleküle komplementär zu der gekrümmten Form der ATP-Bindungstasche, ein Effekt wie er auch bei anderen CDK-Hemmstoffen beobachtet wurde. Die Ausbildung von drei Wasserstoffbrückenbindungen sowie lipophile Wechselwirkungen sind essentiell für die starke Bindung beider Derivate. Anhand der gemessenen Struktur wird deutlich, daß die 5-Position die ideale Substitutionsposition an den Benzolkernen darstellt. Indirubin-5-sulfonat bildet durch die Sulfonatgruppe ionische Wechselwirkungen mit einer Lysinseitenkette (Lys33) des Enzyms aus, die zu einer weiteren Affinitätssteigerung führen. Die Oximgruppe in Position 3' ragt in einen freien Raumbereich, der von anderen Hemmstoffen besetzt wird und eröffnet daher die Möglichkeit, weitere funktionelle Gruppierungen einzubringen und so die Hemmstärke und die Selektivität der Indirubinderivate noch zu steigern. Läßt man die ionischen Verbindungen, die aufgrund ihrer Ladung die Zellmembran (und Zellkernmembran) wahrscheinlich nicht durchdringen können, außer Betracht, so fällt auf, daß alle starken Inhibitoren des Enzymkomplexes CDK1/Cyclin B auch zu einer starken Wachstumshemmung im Colony-Forming-Assay führen. Eine Schwächung der Affinität zwischen Inhibitor und CDK1 durch eine Substitution am N1-Stickstoff führt gleichzeitig zu einem Abfall der Wirksamkeit im Colony-Forming-Assay und in anderen Testsystemen. Durch die Röntgenstrukturanalyse wird verständlich, wie eine Substitution an dieser Stelle die Wechselwirkung zwischen Inhibitor und Enzym abschwächt. Die Befunde deuten darauf hin, daß der antineoplastischen Wirkung von Indirubinderivaten ein komplexes Zusammenspiel mehrerer Teilmechanismen zugrunde liegt, möglicherweise unter Beteiligung von Int erkalation und Redoxcycling, wobei der Hauptwirk mechanismus in der Inhibierung cyclinabhängiger Kinasen besteht.