Refine
Document Type
- Doctoral Thesis (2)
Has Fulltext
- yes (2)
Keywords
- Streptomyces (2) (remove)
Faculty / Organisational entity
Durch das Entstehen von neuen Infektionskrankheiten und das Auftreten von Resistenzen können bisher verwendete Medikamente ihren pharmazeutischen Nutzen verlieren. Daher ist eine konstante Weiterentwicklung von bioaktiven Pharmazeutika lebensrettend. Viele pflanzli-che und mikrobielle Sekundärmetabolite besitzen gesundheitsfördernde Wirkungen und kön-nen als Ressourcen für die Entwicklung neuer Arzneimittel herangezogen werden. Da Pflan-zen und Mikroorganismen ein sehr umfangreiches Repertoire an pharmazeutisch-interessanten Intermediaten besitzen, soll im Rahmen dieser Arbeit die Produktbildung von pflanzlichen und mikrobiellen Sekundärmetaboliten vorgestellt werden, die für weiterführende medizinische Studien von Interesse sind.
Die in dieser Arbeit präsentierten mikrobiellen Sekundärmetabolite sind β-Lactam Antibiotika der Gruppe der OA-6129 und besitzen antibakterielle Eigenschaften gegen grampositive als auch gramnegative Mikroorganismen. Durch die Kultivierung des filamentösen Actinobakteri-ums Streptomyces fulvoviridis A933 17M9 1501 können diese sehr wirksamen Antibiotika gebildet werden. Für eine erfolgreiche Produktbildung wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zweistufiger Prozess im Bioreaktor etabliert, der sich über einen Zeitraum von neun Tagen erstreckt. Durch Optimierung und Variation des Mediums, sowie durch die Veränderung der Rührergeometrie, kann die maximale Antibiotikakonzentration um 385 % gesteigert werden.
Neben der zu optimierenden Produktbildung ist auch die Stabilität der Antibiotika im wässrigen Milieu von Interesse. Die Untersuchungen erfolgten am Produktanalogon Imipenem. Es zeig-te sich, dass durch Interaktionen der Imipenemmoleküle der Zerfall mit steigender Antibiotik-akonzentration beschleunigt wird. Ein dazugehöriger Zerfallsweg des Imipenems in deionisie-rem Wasser bei pH 7 konnte durch die Auswertung der HPLC und Massenspektrometrie-Analytik beschrieben werden. Bioaktive Zerfallsprodukte, wie das sehr aktive β-Lactam Thienamycin, können aus dieser Zerfallsreaktion resultieren. Auch im Fermenta¬tionsmedium kann ein konzentrationsabhängiger Zerfall nachgewiesen werden, was für eine wirtschaftli-che, fermentative Herstellung problematisch wäre. Durch die Verwendung von Morpholino-sulfonsäurepuffern ist eine Stabilisierung des Antibiotikums im Wasser und im Fermentati-onsmedium realisierbar. Eine Steigerung der Halbwertszeit von über dem 10fachen gegen-über einer reinen Imipenemlösung im Wasser kann durch die Verwendung dieser Puffersub-stanzen erzielt werden.
Bei den zweiten, in dieser Arbeit behandelten Sekundärmetaboliten, handelt es sich um die pflanzlichen Triterpene Oleanol- und Ursolsäure, von denen antibakterielle, antivirale, entzün-dungshemmende und Krebs vorbeugende Aktivitäten bekannt sind. Neben anderen Pflanzen bilden Spezies von Salbei und Basilikum diese interessanten Sekundärmetabolite. Da bei ei-ner Freilandkultivierung die Produktkonzentrationen jährlichen Schwankungen durch abioti-schen und biotischen Faktoren unterliegen, kann durch eine in situ Kultivierung eine reprodu-zierbare Produktbildung erzielt werden. Im Zuge der Arbeit wurden Kalluskulturen von Salvia officinalis und Ocimum basilicum in verschiedenen Reaktortypen und mit verschiedenen Pro-zessstrategien eingesetzt und betreffend ihrer Produktbildung untersucht. Eine Oleanol- und Ursolsäurebildung durch eine Kalluskultur von Ocimum basilicum konnte durch diese Arbeit zum ersten Mal präsentiert werden.
Im Vergleich zu Kultivierungen in Erlenmeyerkolben fördert eine Kultivierung im Wavebag-Reaktor das Wachstum und die Produktbildung, sodass die maximale Triterpenkonzentration um 210 % gesteigert werden kann. Durch Variation der batch-Prozessstrategie in ein repea-ted-batch-Verfahren kann eine signifikante Steigerung der Oleanolsäurebildung um das 16fache und der Ursolsäurebildung um das 35fache erzielt werden. Es wird angenommen, dass auftretende Substratlimitierung zu einer Steigerung der Produktbildung führt.
Durch eine nachfolgende Biotransformation ist es möglich, die beiden Triterpene zu modifizie-ren. Eine Derivatisierung kann neben einer Verbesserung der Wasserlöslichkeit der Triterpene auch in einer Erhöhung der pharmazeutisch-interessanten Aktivitäten resultieren. Aus diesem Grunde wurden neun Organismen betreffend ihrer biokatalytischen Aktivität untersucht. Mit-tels des Actinobakteriums Nocardia iowensis werden die Oleanol- und Ursolsäure zunächst in ihre korrespondierenden Methylester transformiert. Des Weiteren entstehen bei der Biotrans-formation von Oleanolsäure zwei weitere, bisher unbekannter Derivate, welche durch HPLC, HPLC-ESI-MS und HPLC-1H-NMR charakterisiert werden konnten. Anhand dieser Resultate kann ein neuer Biosyntheseweg für eine Oleanolsäuretransformation mittels Nocardia iowen-sis beschrieben werden.
Um die Abtrennung der Biotransformationskultur von Medium zu vereinfachen und die Wirt-schaftlichkeit zu fördern, kann N. iowensis in Natriumalginat immobilisiert werden. Während kein signifikanter Unterschied zwischen immobilisierten und freien Bakterienzellen betreffend der Substrataufnahme detektiert wird, wird durch die Immobilisierung die Produktbildung re-primiert. Dabei besitzt die Matrixdichte, die aus der Behandlung der Natriumalginatpartikel mit der Calciumchloridlösung resultiert, einen entscheidenden Einfluss auf die Biotransformati-onseffizienz.
Auch eine Zusammenführung von Pflanzenzellkultivierung und Biotransformation in einem Gesamtprozess wurde im Rahmen dieser Arbeit etabliert. Durch den direkten Einsatz der immobilisierten Biotransformationskultur im verdünnten Zelllysat umgeht man eine Aufarbei-tung der Produkttriterpene aus dem Pflanzenzelllysat, was die Wirtschaftlichkeit des Prozes-ses erheblich verbessert. Bis zu einem Mischverhältnis von 50 % Referenzmedium und Zell-lysat kann keine Inhibierung oder Reprimierung der Biotransformation durch vorhandene Pflanzenzellbestandteile, wie z. B. Phenolen, detektiert werden.
Esterases and lipases are widely used as industrial enzymes and for the synthesis of chiral drugs. Because of their rich secondary metabolism, Streptomyces species offer a relatively untapped source of interesting esterases and lipases. S. coelicolor and S. avermitilis contain 51 genes annotated as esterases and/or lipases. In this study I have cloned 14 different genes encoding for lipolytic enzymes from S. coelicolor (11 genes) and S. avermitilis (four genes). Some of these genes were over-expressed in E. coli. Three of the produced enzymes, which were produced by the genes SCO 7131, SCO6966 and SCO3644, were characterized biochemically and one of them was subjected for directed evolution. The gene estA (locus SCO 7131) was annotated as a putative lipase/esterase in the genome sequence of S. coelicolor A3(2), but does not have a homologue in the genome sequence of S. avermitilis or in other known Streptomyces sequences. estA was cloned and expressed in E. coli as a His-tagged protein. The protein was purified and could be recovered in its non-tagged form after digestion with factor Xa. The relative molecular weight was estimated to be 35.5kDa. The enzyme was only active towards acetate esters and not on larger substrates. It had a stereospecificity towards α-naphathylacetate. It was thermostable, with a half-life at 50C of 4.5 hours. Est A showed stability over pH range 5.5-10, and had optimum pH of 7.5. Its activity was drastically decreased when it was pre-incubated in 10mM PMSF, Cu+2 and Hg+2. It was not very stable in most organic solvents and had only slight enantioselectivity. Est A belongs to the HSL family whose founder member is the human hormone-sensitive lipase. I have developed a protein profile for the HSL family modifying the conserved motifs found by Arpigny and Jaeger (1999). Due to the presence of several HSL members with known 3D structure and good homology to Est A, I was able to make a homology model of Est A. Five different mutants of Est A were produced through site directed mutagenesis: W87F, V158A, W87F/V158A, M162L and S163A. The mutants M162L and S163A did not produce a significant change either in substrate specificity or enzyme kinetics. The mutants V158A and W87F/V158A could act on the larger substrates p-nitrophenylbutyrate and caproate and tributyrin. The mutant V158A had improved thermostability and its t1/2 at 50ºC increased to 24h. The affinity of V158A towards p-nitrophenyacetate increased 6-fold when compared with the wild type, whereas the affinity of W87F decreased 4-fold. Directed evolution of Est A was done through random mutagenesis and ER-PCR. A library of 6336 mutants was constructed and screened for mutants with a broader spectrum of substrate specificity. The mutant XXVF7 did show alteration in the substrate specificity of Est A. The mutant XXVF7 had 5 amino acids changes L76R, L146P, S196G, W213R and L267R. The gene locus SCO 6966 (estB gene) was cloned and expressed in E. coli as a His-tagged protein. It was not possible to remove the His-tag using factor Xa. The tagged protein had a molecular weight 31.9kDa. Est B was active against short chain fatty acid esters (C2-C6). Its optimum temperature was 30ºC and was stable for 1h at temperatures up to 37ºC. The enzyme had maximum activity at pH 8-8.5 and was stable over pH range 7.5-11 for 24h. It was highly sensitive for PMSF, Cu+2 and Hg+2. The enzymatic activity deceased in presence of organic solvents, however it was fairly stable for 1h in 20% organic solvents solutions. A third esterase was produced from the gene locus SCO 3644. This esterase was a thermosensitive one with optimum temperature of 35ºC. The three characterized enzymes included a thermophilic, mesophilic and psychrophilic ones. This indicates the high variation in the characters of Streptomyces lipolytic enzymes and highlighting Streptomyces as a source for esterases and lipases of interesting catalytic activity. This study was an initial trial to provide a strategy for a comprehensive use of genome data.