Alexander T. Cartus

• Methyleugenol (ME), (\(\it E \))-Methylisoeugenol (MIE), alpha-Asaron (aA), beta-Asaron (bA) und gamma-Asaron (gA) sind natürlich vorkommende Pflanzeninhaltsstoffe aus der Klasse der Phenylpropene (PP) und Bestandteil der menschlichen Ernährung. ME, aA und bA erwiesen sich im Tierversuch als hepatokanzerogen. MIE und gA wurden bislang nicht untersucht. Die allylischen Hepatokanzerogene Estragol und Safrol werden im Verlauf des Fremdstoff-metabolismus durch Cytochrom P450-Enzyme (CYP) in 1‘-Position hydroxyliert und anschließend durch Sulfotransferasen sulfoniert. Der reaktive Schwefelsäureester kann DNA-Addukte bilden, wodurch in der Folge Mutationen und Tumoren ausgelöst werden können. Für ME wurde der gleiche Mechanismus der Aktivierung postuliert, obgleich definitive Beweise bislang fehlten. Im Gegensatz dazu war die Mehrheit der bislang untersuchten propenylischen PP nicht kanzerogen. aA und bA stellen insofern eine Ausnahme dar. Tierexperimentelle Untersuchungen legen einen alternativen Mechanismus für die Aktivierung von aA und bA nahe. Untersuchungen zum Metabolismus der Asarone liegen bisher nicht vor. Ziel der Arbeit war es daher, den hepatischen Metabolismus dieser fünf PP zu untersuchen, um Einblicke in die potentiellen gentoxischen Mechanismen zu erhalten. Die Metabolitenbildung der fünf Substanzen wurde zeit- und konzentrationsabhängig in humanen und tierischen Lebermikrosomen (LM) sowie verschiedenen humanen CYP-Enzymen (Supersomes\(^{TM}\)) untersucht. Die Metaboliten wurden charakterisiert, identifiziert und synthetisiert, um als Referenzverbindungen für die Quantifizierung sowie für weitere mechanistische in vitro Untersuchungen zu dienen. Ferner wurden enzymkinetische Parameter bestimmt, um eine Extrapolation der Metabolitenbildung hin zu kleinen Substratkonzentrationen sowie die Beteiligung humaner CYPs an der Metabolitenbildung in humanen LM zu ermöglichen. Außerdem wurde die Bildung von DNA-Addukten in primären Rattenhepatozyten nach Inkubation mit ME, MIE sowie deren Metaboliten untersucht. Für alle Verbindungen konnten die folgenden fünf enzymatischen Reaktionen identifiziert werden: Hydroxylierung der Seitenkette, Oxidation dieser Alkohole, Epoxidierung der Seitenkette und Hydrolyse zu Diolen sowie \(\it O \)-Demethylierung. Als Hauptmetaboliten von ME, MIE, aA und gA wurden die jeweiligen Seitenkettenalkohole identifiziert, während bA hauptsächlich über Epoxide zu Diolen metabolisiert wurde. Die Ergebnisse belegen, dass ME, im Gegensatz zu MIE, über den gleichen Mechanismus wie Safrol und Estragol, auch in geringen, humanrelevanten Konzentrationen aktiviert werden kann. Für aA und vor allem bA scheint eine Aktivierung über Epoxide wahrscheinlicher, während es für gA keine Hinweise auf potentiell gentoxische Metaboliten gibt.
• Methyleugenol (ME), (\(\it E \))-methylisoeugenol (MIE), alpha-asarone (aA), beta-asarone (bA) and gamma-asarone (gA) are naturally occurring plant constituents, and thus part of the human nutrition. They belong to the class of phenylpropenes (PP) or alkenylbenzenes. ME, aA and bA are hepatocarcinogenic to male mice, whereas the carcinogenicity of MIE and gA were not investigated so far. Estragole and safrole, both allylic hepatocarcinogens, are activated via Cytochrom P450 enzymes (CYP) and sulfotransferases during xenobiotic metabolism by forming a 1’-hydroxy metabolite (side chain), which is afterwards sulfonated. After loss of sulfate, the remaining carbocation can form DNA-adducts leading to mutations and tumors in rodent liver. For ME, the same mechanism of activation was assumed, although ultimate evidences were lacking. In contrast, the majority of propenylic PP examined as yet is not or very weakly carcinogenic. The propenylic compounds aA and bA are hence an exception. Based on the results of animal experiments, an alternative mechanism of bioactivation is likely for aA and bA. Data on the metabolism of asarone-isomers are not yet available. Therefore, the aim of this work was to elucidate the metabolism of these five PP to uncover their possible carcinogenic mechanisms and metabolic pathways. The formation of metabolites was measured time- and concentration-dependent using human and animal liver microsomes, as well as different human CYP enzymes (Supersomes\(^{TM}\)). The metabolites were characterized, identified and synthesized to use them as reference compounds for quantification and to test them in further mechanistic in vitro assays. Kinetic data were derived to enable extrapolation to low substrate concentration, more relevant for the human nutrition, and to determine the contribution of different human CYPs in metabolite formation in human liver microsomes. Finally, the formation of DNA adducts by ME, MIE and there metabolites was studied using primary rat hepatocytes. For all compounds, the following five enzyme-catalyzed reactions were identified: hydroxylation of the side chain, oxidation of those alcohols to aldehydes or ketones, epoxidation of the side chain followed by hydrolysis yielding diols, as well as \(\it O \)-demethylation. Major metabolites of ME, MIE, aA and gA were the corresponding side chain alcohols, whereas bA was mainly metabolized via the epoxide/diol pathway. The results show, that ME, but not MIE, are bioactivated by the same mechanism as safrole and estragole even at low substrate concentrations. In case of aA and bA an alternative bioactivation via epoxides, not side chain alcohols, is highly likely. For gA, there are no hints for a genotoxic mode of action or genotoxic metabolites.