Nicole Raquet

• Furocumarine (FC) sind sekundäre Pflanzenmetaboliten, die u.a. von Früchten und Gemüsen wie Grapefruit oder Sellerie als Phytoalexine gebildet werden. So liegt die geschätzte durchschnittliche menschliche Exposition über die Nahrung bei einer Gesamt-FC-Menge von 0,56 mg/Tag in Deutschland, bei Akutexpositionen können 100-fach höhere Werte erreicht werden. Ihre Grundstruktur besteht aus einem Cumarinmolekül mit linear oder angular ankondensiertem Furanring, zudem können sie unterschiedlich substituiert sein: über 90 verschiedene natürlich vorkommende Derivate bekannt, die sich in der Ausprägung ihrer Eigenschaften stark unterscheiden. In Kombination mit UVA-Strahlung wirken FCs wie das Cumarin Limettin phototoxisch, photomutagen und photoclastogen. Da in Pflanzen FCs hauptsächlich in Mischungen verschiedener Derivate vorkommen, wurde im Rahmen dieser Arbeit in vitro an V79-Zellen ein einfaches Instrument zur Bewertung natürlich vorkommender FC-Gemische entwickelt, welches die relative phototoxische, -mutagene und -clastogene Potenz verschiedener FCs berücksichtigt. Hierzu wurden versch. Assays speziell für photochemische Anwendungen etabliert und optimiert: Die phototoxischen Effekte wurden über den Resazurin-Reduktionstest charakterisiert und quantifiziert, die Quantifizierung des photomutagenen Potentials erfolgte mit Hilfe des HPRT-Assays, die des photoclastogenen über den Mikrokerntest. Am Beispiel von 5-Methoxypsoralen (5-MOP) konnte eine Abhängigkeit des EC50-Wertes der Zellvitalität 72 h nach der Bestrahlung, der Erhöhung der Mutationsfrequenz (MF) und der Erhöhung der Zahl mikrokerntragender Zellen (MNZ) sowohl von der 5-MOP-Konzentration als auch von der applizierten UVA-Dosis gezeigt werden; im HPRT-Assay und Mikrokerntest waren strikt lineare Zusammenhänge zu beobachten. Adverse Effekte unter Lichtausschluss konnten nicht festgestellt werden. Zum Vergleich der Potenz verschiedener FC-Derivate wurde eine Standard-UVA-Dosis von 125 mJ/cm² festgelegt. 5-MOP war in allen Testsystemen am reaktivsten, weshalb allen anderen FCs Phototoxizitäts, -mutagenitäts bzw. -clastogenitäts-Äquivalenzfaktoren (PTEF, PMEF, PTCF) relativ zu 5-MOP zugeordnet wurden über den Vergleich der EC50-Werte und der Steigungen der Linearregressionen der Auftragung der MF bzw. der MNZ gegen die FC-Konzentration; 5-MOP wurde der Faktor 1 zugewiesen. Generell waren angulare FCs im Vergleich zu ihren linearen Strukturisomeren deutlich weniger photoreaktiv, an Pos. 8 substituierte lineare FCs waren unreaktiver als an Pos. 5 substituierte, die Einführung einer Hydroxygruppe oder Zweitsubstitution mit einer Methoxygruppe führte zum Reaktivitätsverlust. Das Verhalten von Furocumarinen in Mischungen wurde isobolographisch am Beispiel von 5-MOP und 8-MOP untersucht. Komplexere Mischungen mit bis zu 9 verschiedenen FC-Derivaten wurden bezüglich ihres Interaktions-Index’ CI auf Abweichungen von 1 untersucht und die Dosis-Wirkungsbeziehungen der theoretischen 5-MOP-Dosisäquivalente mit 5-MOP verglichen. So konnte auf Vorliegen von Dosis-Additivität geschlossen werden. Als Ursache für die beobachteten Reaktivitätsunterschiede konnten mangelnde Absorption, geringere Interkalationsfähigkeit oder generell Wechselwirkungen mit der DNA über den Vergleich der Absorptionsspektren, hypochromen und bathochromen Effekten in Gegenwart von Kalbsthymus-DNA oder die Ethidiumbromid- und Hoechst33258-Verdrängungsassays ausgeschlossen werden. Weiterhin konnten zwei Systeme zur Bestimmung der zellfrei photochemisch gebildeten Singulett-Sauerstoff und Superoxidradikalanionen etabliert werden. Hier wurden Psoralen für die O2•--Bildung und Riboflavin für die 1O2-Bildung als Positivkontrolle benutzt, wobei angulare FCs und Limettin generell stärker zur ROS-Produktion fähig waren. Das in dieser Arbeit etablierte Äquivalenzfaktoren-Modell stellt ein gutes Instrument zur Bewertung komplexer natürlich vorkommender FC-Gemische und Abschätzung der in vivo-Phototoxizität über die direkt in der Haut bzw. im Blutplasma gefundene FC-Konzentration dar. Zur direkten Bewertung der oral oder dermal aufgenommen Menge müssen allerdings weitere Faktoren wie Absorption, Metabolismus, zeitabhängige Verteilung und Exkretion, Hauttyp, Reparatur oder generell komplexere Reaktionen des Gewebes in vivo wie Entzündung oder Krebs berücksichtigt werden.
• Furocoumarins (FC) are secondary plant constituents synthesized i.a. by fruits and vegetables such as grapefruit or celeriac as phytoalexins. So the estimated average daily intake via food in humans is about 0.56 mg total FC in Germany, regarding acute exposures, 100-fold higher values can be reached. Their chemical structure consists of a coumarin molecule with a furan ring attached, resulting in a linear or angular structure, also various substitutents can be attached: more than 90 different naturally occurring derivatives are known, varying highly in the characteristics of their properties. In combination with UVA-light, FCs and the coumarin limettin exhibit phototoxic, photomutagenic and photoclastogenic properties. Since FCs mainly occur in mixtures of different derivatives in plants, a simple in vitro tool in risk assessment of naturally occuring FC mixtures was developed in this thesis using the V79 cell line. This tool regards the relative phototoxic, -mutagenic and -clastogenic potency of different FCs. Therefore diverse assays were established and optimized for photochemical applications: The phototoxic effects were characterized and quantified via the resazurin reduction test, the quantification of the photomutagenic resp. the photoclastogenic potential was done by performing the hprt gene mutation assay resp. the micronucleus test. Using 5-methoxypsoralene (5-MOP) as an example, it was shown that the EC50 value of the cell viability 72 h after irradiation, the increase of the mutation frequency (MF) and furthermore the increase of micronucleated cells (MNC) were dependent on the 5-MOP concentration as well as on the applied UVA-dose; in the HPRT assay and micronucleus test strictly linear relationships were found. Adverse effects under exclusion of light were not detectable. For comparison of the potency of the different FC derivatives a standard UVA dose of 125 mJ/cm² was set. 5-MOP was found to be the most reactive FC in all test systems, so to all other FCs phototoxicity, -mutagenicity and -clastogenicity equivalency factors (PTEF, PMEF, PTCF) relative to 5-MOP were assigned by comparing the EC50 values and the slopes of the linear regressions of the plot MF resp. MNC vs. FC concentration; the factor 1 was assigned to 5-MOP. In general, angular FCs were less photoreactive than their linear structural isomers, linear FCs with a substitution at Pos. 8 were less reactive than the substituted ones at Pos. 5. The introduction of a hydroxy group or a second substitution with a methoxy group coincided with a loss of reactivity. The behaviour of furocoumarins in mixtures was investigated isobolographically by using the example of 5-MOP and 8-MOP. More complex mixtures of up to 9 different FC derivatives were tested for deviations from 1 of their interaction index CI and the dose-response relationships of the theoretical 5-MOP equivalents were compared to 5-MOP. So simple similar action could be concluded. As a reason for the observed differences in reactivity, a lacking absorption, a lesser extent of the ability to intercalate or generally to interact with DNA could be excluded by comparing the absorption spectra, hypochrome or bathochrome effects in presence of calf thymus DNA and via ethidium bromide and Hoechst33258 competition assay. Furthermore two systems for the detection of cell-free photochemically formed singulet oxygen and superoxide radical anions were established. Psoralene served as a positive control for the generation of 1O2, riboflavine as the one for the generation of O2•-, whereupon angular FCs and limettin were generally more capable of forming ROS. The model of equivalency factors established within this thesis represents a suitable tool for risk assessment of complex naturally occurring FC mixtures and estimation of in vivo phototoxicity via the FC concentrations found directly in the skin or blood plasma. For direct risk assessment of orally consumed or dermally applied amounts of FCs, other factors such as absorption, metabolism, time-dependent distribution and excretion, skin type, repair or more complex reactions of the tissue in general such as inflammation or cancer have to be considered.