Martin Hossann

• Mit Hilfe von Trifluormethansulfonsäure gelang die chemische Deglykosylierung von natürlichem Gelonin. Durch die Charakterisierung mit Hilfe von SDS-PAGE, wurden Hinweise auf das Vorliegen der Aminosäurensequenz von Nolan et al. gefunden. Durch Auswertung massenspektrometrischer Daten wurde ein mögliches Glykosylierungsmuster vorgeschlagen. Die Expression von rekombinantem Gelonin in E.coli und anschließende Isolierung mit Hilfe der Nickel-Affinitätschromatographie führte zu einem Produkt, das trotz fehlender Glykosylierung um den Faktor 2 toxischer war als natürliches Gelonin und vergleichbare immunologische Eigenschaften aufwies. Durch molekularbiologische Arbeiten wurde der Expressionsvektor für ein AChR-Fragment (a-Untereinheit, AS 4-181) um die DNA-Information für die Aminosäuren 182-208 erweitert. Eine Expression führte zur Bildung eines nativen Produktes, während die native Isolierung des verkürzten Fragmentes nicht erfolgreich war. Ein rekombinant hergestelltes Fusionsprotein aus Gelonin und einem AChR-Fragment (a-Untereinheit, AS 4-181) konnte in hoher Ausbeute und Reinheit mit Hilfe von Nickel-Affinitätschromatographie isoliert werden. Da eine denaturierende Aufarbeitung notwendig war, wurde eine geeignete Renaturierungsmethode entwickelt. Trotz Optimierung fielen allerdings noch bis zu 80% des Fusionsproteins als falsch-gefaltete, unlösliche Proteinaggregate aus. Durch Einführung einer „Recyclingmethode“ konnte der Proteinverlust deutlich minimiert werden. Beide Domänen zeigten sich nativ gefaltet. Allerdings war das Gelonin-Fragment um den Faktor 11 untoxischer als rekombinantes Gelonin alleine. Das Fusionsprotein wurde in einem Tiermodell der Myasthenia gravis auf seine potentiellen antigenspezifischen immunsuppressiven Eigenschaften gestestet. Nach der Induktion der Erkrankung in Ratten durch Gabe von komplettem AChR, wurde die Erkrankung durch repetitive Nervenstimulation untersucht. Eine Methode die auch bei humaner Myasthenie angewendet wird. Nach der Gabe des Fusionsproteins verschwanden die myasthenen Symptome in der Ratte innerhalb einer Woche. Damit zeigte das Fusionsprotein einen therapeutischen Effekt. Langzeitstudien wurden allerdings nicht durchgeführt.
• Trifluormethanesulfonic acid was used to deglycosylate the plant toxin gelonin, isolated from the seeds of Gelonium multiflorum. After characterization with SDS-PAGE hints for the amino acid sequence determined by Nolan et al. were found. After the evaluation of mass spectroscopic data from gelonin, a potential glycosylation pattern was calculated. The expression of recombinant gelonin in e.coli and the following isolation with affinity chromatography yielded pure protein. Recombinant gelonin was twice as toxic as natural gelonin, even without gylcosylation, and showed similar immunological properties. With the help of molecular biological techniques the extension of the expression vector for an acetylcholine receptor (AchR)-Fragment was achieved. It was possible to obtain the extracellular fragment of the alpha-subunit (aa 4-208) for the first time native in the cell lysate after expression in e.coli. A recombinant engineered fusion protein consisting of gelonin and an AChR-fragment (alpha-subunit, aa 4-181) was isolated in high yield an purity with the help of nickel-ion affinity chromatography. A denaturated isolation was necessary , so a refolding protocol was developed. To increase the yield of native fusion protein, a recycling method was used. Both domains of the protein were folded in native conformation, but the gelonin fragment was one magnitude less toxic, than recombinant gelonin alone. The fusion protein was tested in an animal model for myasthenia gravis for a possible antigenspecific immunsuppressive capability. After induction of the animal model in rats using complete AChR, the ongoing disease was examined with repetitive nerve stimulation. A method also used in the human disease. After the application of the fusion protein the myasthenic signs vanished during one week, showing the poitive effect of the protein in treatment of the disease. Long-term studies were not undertaken.