In vitro Untersuchungen zur Gentoxizität der Alkenylbenzene α-, β- und γ-Asaron sowie ausgewählter oxidativer Metaboliten
- α-, β- und γ-Asaron gehören zur Gruppe der Phenylpropanoide und kommen überwiegend in Pflanzen der Familien Aristolochiaceae, Acoraceae und Lauraceae vor. Asarone sind im etherischen Öl dieser Pflanzen enthalten, welches hauptsächlich als Aromastoff in
alkoholischen Getränken wie Bitterlikören oder in der traditionellen Pflanzenmedizin
eingesetzt wird. α- und β-Asaron besitzen pharmakologische Eigenschaften und könnten potentiell in der Therapie von verschiedenen Krankheiten eingesetzt werden, jedoch haben Studien gezeigt, dass diese Verbindungen sowie indisches Kalmusöl im Tierversuch im Nager
krebserregend sind (Dünndarm und Leber). Der Mechanismus dieser kanzerogenen Wirkung ist derzeit noch unklar, wobei ein gentoxischer Weg nicht ausgeschlossen werden kann. Studien zur Gentoxizität der propenylischen Verbindungen α- und β-Asaron sind bislang uneinheitlich. Daten zur Kanzerogenität und Gentoxizität des allylischen γ-Asarons fehlen
gänzlich. Basierend auf der aktuellen Datenlage ist eine Risikobewertung für Zubereitungen, die Asarone enthalten, nicht möglich. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation sollte daher
mithilfe von verschiedenen in vitro Testsystemen ein Beitrag zur Aufklärung des Wirkmechanismus der Kanzerogenität geleistet und die Frage nach der Gentoxizität der Asarone geklärt werden. Dazu wurde zunächst ein bakterieller Mutagenitätstest (Ames-Fluktuationstest) mit und ohne exogene metabolische Aktivierung (S9-Mix) in den Salmonella
typhimurium-Stämmen TA97a, TA98, TA100 und TA102 eingesetzt. Zusätzlich wurden Untersuchungen zur Zytotoxizität und Gentoxizität in Säugerzellen durchgeführt. Zur Überprüfung der Mutagenität diente der Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT)-Test in V79-Zellen und gentechnisch veränderten V79-Zellen (V79-hCYP1A2-hSULT1A1*1 und V79-
rCYP1A2-rSULT1C1) und zur Bestimmung des gentoxischen Potentials wurde der
Mikrokerntest in V79-Zellen und metabolisch kompetenten HepG2-Zellen herangezogen. α- und β-Asaron zeigten im Ames-Fluktuationstest nur nach metabolischer Aktivierung ein mutagenes Potential. Diese Ergebnisse deuten auf die wichtige Rolle des Metabolismus in der
Toxizität der propenylischen Asarone hin. Deshalb wurden neben den drei Asaron-Isomeren auch ausgewählte oxidative Metaboliten ((E/Z)-Asaron-1',2'-epoxid, γ-Asaron-2',3'-epoxid, erythro- und threo-1',2'-Dihydro-1',2'-dihydroxyasaron, (E/Z)-3'-Oxoasaron und 2,4,5-Trimethoxyphenyl-2-propanon) auf Mutagenität getestet. Dabei konnte festgestellt werden, dass die mutagene Wirkung von α- und β-Asaron auf die Epoxidierung der Seitenkette
zurückzuführen ist, da die entsprechenden Epoxide im Ames-Fluktuationstest ebenfalls mutagen waren. Außerdem führte der HPRT-Test in den gentechnisch veränderten V79-hCYP1A2-hSULT1A1*1-Zellen zu einer leichten Erhöhung der Mutationsfrequenz nach Inkubation mit den Asaronen, während der Test in den Standard-V79- und V79-rCYP1A2-rSULT1C1-Zellen für diese Verbindungen keine Veränderung im Vergleich zur Negativkontrolle zeigte. Im Mikrokerntest in HepG2-Zellen konnte ebenfalls ein gentoxisches Potential für die
propenylischen Asarone nachgewiesen werden. Welchen Einfluss dabei der Metabolismus der Substanzen hat, wurde mithilfe einer Vorinkubation mit TCDD überprüft, welches vor allem zur Induktion von CYP1A-Enzymen in HepG2-Zellen führt. Bei allen drei Asaron-Isomeren
wurde dadurch eine Erhöhung der relativen Mikrokernrate erreicht, insbesondere jedoch bei α-Asaron. Die Inkubation mit den oxidativen Metaboliten gab Hinweise darauf, dass die gentoxische Wirkung hier vermutlich auf die Bildung von (E/Z)-3'-Oxoasaron zurückzuführen ist. In der vorliegenden Arbeit konnte somit gezeigt werden, dass nicht nur zwischen allylischen und propenylischen Asaronen Unterschiede in der Gentoxizität vorliegen, sondern auch zwischen dem trans(α)- und cis(β)-Isomer. Dieser Befund geht mit den neuesten Untersuchungen zum Metabolismus dieser Substanzen einher, der sich ebenfalls zwischen den propenylischen Asaronen unterscheidet. Dem allylischen γ-Asaron liegt wiederum ein anderer Wirkmechanismus zugrunde. Der postulierte Metabolismusweg für vergleichbare allylische Alkenylbenzene basiert auf einer CYP-Hydroxylierung der Seitenkette und einer weiteren Sulfonierung durch Sulfotransferasen. Durch eine spontane Abspaltung der Sulfat-Gruppe entsteht ein reaktives Carbokation, das mit nukleophilen Zentren (z.B. Proteinen oder DNA) reagieren und somit letztlich zu Mutationen und der Entstehung von Krebs beitragen
kann. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit geben jedoch keinen Hinweis darauf, dass es bei γ-Asaron analog zu anderen allylischen Propenylbenzenen zu einer Bildung eines ultimaten Kanzerogens kommt, da keine mutagene Wirkung in den hier verwendeten Testsystemen zu
beobachten war, die zum Großteil eine Aktivierung über Sulfotransferasen ermöglichten.
- α-, β- und γ-asarone are naturally occurring phenylpropenes that can be found in different plant families mainly in Aristolochiaceae, Acoraceae and Lauraceae. Plants containing asarones are especially used as flavoring agents in alcoholic beverages (bitters), traditional
human phytomedicine or the rhizome of i.e. Acorus calamus is used for the preparation of tea. Although α- and β-asarone show potential as pharmaceuticals in the treatment of several diseases, previous studies have shown a carcinogenic potential in rodents (duodenum and liver). However, the mechanism of action is unclear but may be based on a genotoxic pathway. Studies on mutagenicity of propenylic α- and β-asarones are inconsistent so far and
data on carcinogenicity and genotoxicity of allylic γ-asarone are lacking completely. On account of current existing data it is not possible to carry out a risk assessment of preparations containing asarones. Thus, the present study determined the cytotoxicity and genotoxicity of the three asarone isomers using different in vitro assays to clarify the mode of action concerning carcinogenic properties and to gather more information about a possible
genotoxic pathway. Therefore, the Ames fluctuation assay with and without exogenous metabolic activation (S9 mix) in standard Salmonella typhimurium-strains TA97a, TA98, TA100 and TA102 was initially used in this study. Additionally, mutagenicity in mammalian cells was
examined by using the hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) assay in V79 cells and genetically modified V79 cells (hCYP1A2+hSULT1A1*1, rCYP1A2+rSULT1C1). These cells
were used to mimic the metabolic pathway that is already known for other allylic
alkenylbenzenes. Additionally, the micronucleus assay in metabolic competent HepG2 cells was performed to further investigate genotoxicity. α- and β-asarone showed mutagenic potential in the Ames fluctuation assay only after metabolic activation. These results
demonstrate the importance of metabolism and hence, mutagenic potency of selected oxidative metabolites ((E/Z)-asarone-1',2'-epoxide, γ-asarone-2',3'-epoxide, erythro- and threo-1',2'-dihydro-1',2'-dihydroxy-asarone, (E/Z)-3'-oxoasarone und 2,4,5-trimethoxyphenyl-
2-propanone) was further examined. α- and β-asarone epoxides were mutagenic in the Ames fluctuation assay with and without S9 mix, confirming the thesis that epoxidation of the side chain plays a key role in mutagenicity of propenylic alkenylbenzenes. Furthermore, the HPRT
assay in metabolic competent V79 cells (hCYP1A2+hSULT1A1*1) showed a marginal effect on mutagenic rate for asarones whereas the HPRT assay in standard V79 cells and in genetically
engineered V79 cells expressing murine CYP1A2 and SULT1C1 did not show an increase. The micronucleus assay in HepG2 cells resulted in an increase of micronuclei, mainly after incubation of α-asarone and its metabolite 3'-oxoasarone. A preincubation with TCDD, which mainly induces CYP1A enzymes in this cell line, caused an increased micronuclei rate of all
three asarone isomers showing once again the importance of metabolism. This work could display that there are not only differences between allylic and propenylic alkenylbenzenes but also between trans(α)- and cis(β)-isomers. The postulated pathway of allylic phenylpropenes is described via CYP hydroxylation and further sulfonation resulting in a reactive carbocation that may cause DNA damage. If not being repaired, the mutations can lead to cancer. However, this pathway seems not to be important for the genotoxicity of γ-asarone as it did not show any mutagenic potential in none of the test systems.