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EVALUATION OF THE ROLE OF C-ABL IN IMATINIB-INDUCED TOXICITY IN CARDIOMYOCYTES

Bewertung des Einflusses von c-Abl auf die von Imatinib induzierte Toxizität in Kardiomyozyten

  • It was recently reported that imatinib causes cell death in neonatal rat ventricular cardiomyocytes (NRVCM) by triggering endoplasmic reticulum (ER) stress and collapsed mitochondrial membrane potential. Retroviral gene transfer of an imatinib-resistant mutant c-Abl into NRVCM appeared to alleviate imatinib-induced cell death and it was concluded that the observed imatinib-induced cytotoxicity is mediated through direct interactions of imatinib with c-Abl. The imatinib effects were described as being specific for cardiomyocytes only, which are relevant also for the in vivo situation in man. [Kerkelä et al. 2006] The goal of the present study was to reproduce the published experiments and to further explore the dose-response relationship of imatinib-induced cell death in cardiomyocytes. Additional markers of toxicity were investigated. The following biochemical assays were applied: LDH release (membrane leakage marker), MTS-reduction (marker of mitochondrial integrity), ATP cellular contents (energy homoeostasis) and caspase 3/7 activity (apoptosis). The endoplasmatic reticulum (ER) stress markers eIF2α (elongation initiation factor 2α), XBP1 (X Box binding Protein 1), and CHOP (cAMP response element-binding transcription factor (C/EBP) homologous protein) were determined at the transcriptional and protein level. Online monitoring of cell attachment of, oxygen consumption and acidification of the medium by rat heart cells (H9c2) seated on chips (Bionas) allowed the determination of the onset and reversibility of cellular functions. Image analysis measured the spontaneous beating rates after imatinib treatment. The role of imatinib-induced reactive oxygen species was evaluated directly by 2’,7’-Dichlorofluorescein fluorescence and indirectly by means of interference experiments with antioxidants. The specificity of imatinib-induced effects were specific to cardiomyocytes was evaluated in fibroblasts derived from rat heart, lung and skin. The specific role of c-Abl in the imatinib-induced cellular toxicity was investigated by specific gene silencing of c-Abl in NRVCM. The results demonstrated that imatinib caused concentration-dependent cytotoxicity, apoptosis, and ER stress in heart, skin and lung fibroblasts, similar or stronger to those observed in cardiomyocytes. Similar to the results from cardiomyocytes, ER stress markers in fibroblasts were only increased at cytotoxic concentrations of imatinib. This effect was not reversible; also, reactive oxygen species did not participate in the mechanism of the imatinib-induced cytotoxicity in NRVCM. Small interfering RNA (siRNA)-mediated reduction of c-Abl mRNA levels by 51 % and c-Abl protein levels by 70 % had neither an effect on the spontaneous beating frequency of cardiomyocytes nor did it induce cytotoxicity, apoptosis, mitochondrial dysfunction or ER stress in NRVCM. Incubation of imatinib with c-Abl siRNA-transfected NRVCM suggested that reduced c-Abl protein levels did not rescue cardiomyocytes from imatinib-induced cytotoxicity. In conclusion, results from this study do not support a specific c-Abl-mediated mechanism of cytotoxicity in NRVCM.
  • Vor kurzem wurde berichtet, dass die Inkubation von Imatinib zum Zelltod von neonatalen ventrikulären Kardiomyozyten der Ratte (NRVCM) führt, indem es Stress im endoplasmatischen Retikulum (ER Stress) auslöst und das mitochondriale Membranpotential zum Zusammenbruch führt. Der durch Imatinib induzierte Zelltod schien bei einer c-Abl-Mutanten, welche resistent gegen Imatinib ist und retroviral transfiziert wurde, in NRVCM vermindert zu werden. Daraus wurde geschlossen, dass die beobachtete, durch Imatinib induzierte Zytotoxizität direkt durch die Beeinflussung von c-Abl mit Imatinib vermittelt wird. Des Weiteren wurden die Effekte von Imatinib als spezifisch auf Kardiomyozyten beschrieben, welche folglich auch für die in vivo Situation im Menschen relevant ist. [Kerkelä et al. 2006] Die vorliegende Studie nahm es sich zum Ziel, die publizierten Experimente zu reproduzieren und Dosis-Wirkungs-Beziehungen von Imatinib-induziertem Zelltod in Kardiomyozyten auszuweiten. Außerdem wurden zusätzliche Toxizitätsmarker untersucht. Dazu wurden folgende biochemische Untersuchungen durchgeführt: LDH-Freisetzung (Enzymaktivität der Laktatdehydrogenase im Überstand), MTS-Reduktion (Aktivität von mitochondrialen Enzymen), ATP-Gehalt in Zellen (Energiehomöostase) und Caspase 3/7-Aktivität (Apoptose). Marker für den ER Stress wurden auf transkriptionaler und Proteinebene untersucht: eIF2α (elongation initiation factor 2α), XBP1 (X Box binding Protein 1), und CHOP (cAMP response element-binding transcription factor (C/EBP) homologous protein). Die Zellanhaftung, der Sauerstoffverbrauch und die Ansäuerung des Mediums wurden bei Rattenkardiomyozyten (H9c2) kontinuierlich gemessen (Bionas), welche auf Chips kultiviert waren. Mit dieser Methode kann man das Einsetzen der Toxizität als auch die Reversibilität zellulärer Funktionen untersuchen. Das spontane Schlagen der Kardiomyozyten nach der Behandlung mit Imatinib wurde anhand einer Bildanalyse gemessen. Die Fluoreszenz von 2’,7’-Dichlorofluorescein gab direkt Aufschluss über den Einfluss von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Indirekt wurde die Bildung von ROS über Interferenz-Experimenten mit Antioxidantien beurteilt. Die Spezifität von Imatinib-induzierten Effekten zu Kardiomyozyten wurde in Fibroblasten der Ratte bestimmt, welche vom Herzen, der Lunge und der Haut entstammten. Die spezielle Rolle von c-Abl in der von Imatinib induzierten Zelltoxizität wurde anhand spezifischen Genesilencing von C-Abl in NRVCM untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass Imatinib konzentrationsabhängige Zytotoxizität, Apoptose und ER Stress in Herz-, Haut- und Lungenfibroblasten hervorrief, ähnlich oder stärker als sie in Kardiomyozyten beobachtet wurden. Ähnlich zu den Ergebnissen, welche von Kardiomyozyten erhalten wurden, zeigten sich ER Stress-Marker in Fibroblasten nur bei zytotoxischen Konzentrationen von Imatinib erhöht. Dieser Effekt stellte sich als nicht reversibel heraus. Auch konnte keine Teilnahme von reaktiven Sauerstoffspezies in dem Mechanismus von Imatinib-induzierter Zytotoxizität in NRVCM nachgewiesen werden. Die small interfering RNA (siRNA)-vermittelte Verminderung der c-Abl-mRNA-Gehalte um 51 % und c-Abl-Proteingehalte um 70 % hatten weder einen Effekt auf die spontane Schlagfrequenz von Kardiomyozyten, noch wurden Zytotoxizität, Apoptose, mitochondriale Fehlfunktion oder ER Stress in NRVCM induziert. Die Inkubation von Imatinib mit c-Abl siRNA-transfizierten NRVCM lässt nicht darauf schließen, dass reduzierte Proteingehalte von c-Abl Kardiomyozyten vor Imatinib-induzierter Toxizität bewahren. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass die Ergebnisse der vorliegenden Studie einen spezifischen c-Abl-vermittelten Mechanismus der Zytotoxizität in NRVCM nicht unterstützen.

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Metadaten
Author:Anja Nussher
URN:urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-23719
Advisor:Wolfgang E. Trommer
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:English
Year of Completion:2009
Year of first Publication:2009
Publishing Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2009/02/26
Date of the Publication (Server):2009/08/20
Tag:Adhäsion; Ansäuerung; Bionas; Sauerstoffverbrauch; Schlagfrequenz; c-Abl; neonatale ventrikuläre Kardiomyozyten der Ratte
Bionas; acidification; adhesion; beating rate; c-Abl; cells on chips; neonatal rat ventricular cardiomyocytes; nucleofection; oxygen consumption
GND Keyword:Protein-Tyrosin-Kinasen; Kardiotoxizität; Imatinib mesilat; RNS-Interferenz; Elektroporation; Transfektion; Mutagenität; Apoptosis
Faculties / Organisational entities:Kaiserslautern - Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie
Licence (German):Standard gemäß KLUEDO-Leitlinien vor dem 27.05.2011