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Herstellung eines anti-PD-1-Gelonin-Konjugats zum Einsatz in der Transplantationsmedizin

  • Das Ziel der vorliegenden Dissertation war die Herstellung eines Immunotoxins das in der Transplantationsmedizin eingesetzt werden soll. Hierbei wurde das Ribosomen-inaktivierende Protein Gelonin als Toxinkomponente eingesetzt. Die Besonderheit von Gelonin ist, dass es für intakte Zellen nicht toxisch ist, weil es nicht in die Zellen gelangen kann. Um es in die Zelle zu bringen wird eine Ligandenkomponente, in dieser Arbeit der monoklonale anti-PD-1-Antikörper, der an PD-1 auf der Oberfläche von alloreaktiven T-Zellen bindet, benötigt. Gelonin könnte somit durch die Aufnahme über den anti-PD-1-Antikörper in diese Zellen gelangen und sie selektiv zerstören, bevor sie zur Abstoßung des Transplantats führen. Mittels chemischer Kopplung wurden Gelonin und der anti-PD-1-Antikörper miteinander verknüpft, indem sie zunächst mit 2-Iminothiolan modifiziert wurden, um freie Thiolgruppen in die Proteine einzuführen. Nach der weiteren Modifizierung von Gelonin mit Bis-(maleimido)-methylether zur Einführung von Maleimidgruppen erfolgte die Kopplung der beiden Proteine durch Ausbildung einer Thioetherbrücke. Nach der Optimierung war die Herstellung des Konjugats erfolgreich und es erfolgte die Aufreinigung mittels verschiedener chromatographischer Methoden, wie HPLC, ÄKTA und Affinitätschromatographie. Nach der immunologischen Charakterisierung mittels ELISA und Western-Blot wurden Untersuchungen zur Wirksamkeit des Konjugats durchgeführt. Es ergab sich keine signifikante Wirkung des Konjugats auf HEK293T Zellen. Der Grund hierfür könnte sein, dass das Konjugat nicht über Endozytose in die Zelle aufgenommen werden kann. Zur besseren Charakterisierung und Aufreinigung des Konjugats war ein weiteres Ziel dieser Arbeit die Herstellung eines monoklonalen anti-Gelonin-Antikörpers. Hierzu wurden BALB/c Mäuse erfolgreich mit Gelonin immunisiert und im Anschluss die Milzzellen mit der Myelomzelllinie (X63Ag8.653) fusioniert. Nach zweifacher Klonierung und Expansion wurden mittels Protein-G-Affinitätschromatographie zwei unterschiedliche anti-Gelonin-Antikörper isoliert. Auf Grund ihrer niedrigen Affinität konnten sie aber nicht zur Aufreinigung, sondern nur zur Charakterisierung des Konjugats eingesetzt werden.

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Metadaten
Verfasserangaben:Jessica Becker
URN (Permalink):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-35221
Betreuer:Wolfgang E. Trommer
Dokumentart:Dissertation
Sprache der Veröffentlichung:Deutsch
Veröffentlichungsdatum (online):31.05.2013
Jahr der Veröffentlichung:2013
Veröffentlichende Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Titel verleihende Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Datum der Annahme der Abschlussarbeit:23.05.2013
Datum der Publikation (Server):03.06.2013
Seitenzahl:XIII, 150 S.
Fachbereiche / Organisatorische Einheiten:Fachbereich Chemie
DDC-Sachgruppen:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie
Lizenz (Deutsch):Standard gemäß KLUEDO-Leitlinien vom 10.09.2012