The Role of 17beta-Estradiol on 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin-mediated Oxidative DNA Damage in Liver Cell Models

Der Einfluss von 17beta-Estradiol auf 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin vermittelte oxidative DNA Schäden in Leberzellmodellen

  • 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) is a highly toxic and persistent organic pollutant, which is ubiquitously found in the environment. The prototype dioxin compound was classified as a human carcinogen by the International Agency for Research on Cancer. TCDD acts as a potent liver tumor promoter in rats, which is one of the major concerns related to TCDD exposure. There is extensive evidence, that TCDD exerts anti-estrogenic effects via arylhydrocarbon receptor (AhR)-mediated induction of cytochromes P450 and interferes with the estrogen receptor alpha (ERalpha)-mediated signaling pathway. The present work was conducted to shed light on the hypothesis that enhanced activation of estradiol metabolism by TCDD-induced enzymes, mainly CYP1A1 and CYP1B1, leads to oxidative DNA damage in liver cells. Furthermore, the possible modulation by 17beta-estradiol (E2) was investigated. The effects were examined using four different AhR-responsive species- and sex-specific liver cell models, rat H4II2 and human HepG2 hepatoma cell lines as well as rat primary hepatocytes from male and female Wistar rats. The effective induction of CYP1A1 and CYP1B1 by TCDD was demonstrated in all liver cell models. Basal and TCDD-induced expression of CYP1B1, which is a key enzyme in stimulating E2 metabolism via the more reactive formation of the genotoxic 4-hydroxyestradiol, was most pronounced in rat primary hepatocytes. CYP-dependent induction of reactive oxygen species (ROS) was only observed in rodent cells. E2 induced ROS only in primary rat hepatocytes, which was associated with a weak CYP1B1 mRNA induction. Thus, E2 itself was suggested to induce its own metabolism in primary rat hepatocytes, resulting in the redox cycling of catechol estradiol metabolites leading to ROS formation. In this study the role of TCDD and E2 on oxidative DNA damage was investigated for the first time in vitro in the comet assay using liver cells. Both TCDD and E2 were shown to induce oxidative DNA base modifications only in rat hepatocytes. Additionally, direct oxidative DNA-damaging effects of the two main E2 metabolites, 4-hydroxyestradiol and 2-hydroxyestradiol, were only observed in rat hepatocytes and revealed that E2 damaged the DNA to the same extent. However, the induction of oxidative DNA damage by E2 could not completely be explained by the metabolic conversion of E2 via CYP1A1 and CYP1B1 and has to be further investigated. The expression of low levels of endogenous ERalpha mRNA in primary rat hepatocytes and the lack of ERalpha in hepatoma cell lines were identified as crucial. Therefore, the effects of interference of ERalpha with AhR were examined in HepG2 cells, which were transiently transfected with ERalpha. The over-expression of ERalpha led to enhanced AhR-mediated transcriptional activity by E2, suggesting a possible regulation of E2 levels. In turn, TCDD reduced E2-mediated ERalpha signaling, confirming the anti-estrogenic action of TCDD. Such a modulation of the combined effects of TCDD with E2 was not observed in any of the other experiments. Thus, the role of low endogenous ERalpha levels has to be further investigated in transfection experiments using rat primary hepatocytes. Overall, rat primary hepatocyte culture turned out to be the more adaptive cell model to investigate metabolism in the liver, reflecting a more realistic situation of the liver tissue. Nevertheless, during this work a crosstalk between ERalpha and AhR was shown for the first time using human hepatoma cell line HepG2 by transiently transfecting ERalpha.
  • 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) ist ein ubiquitär in der Umwelt vorkommendes humanes Kanzerogen. Die Prototypsubstanz der Dioxine agiert als potenter Tumorpromotor in der Rattenleber. Es bestehen reichlich Hinweise darauf, dass TCDD über den aktivierten Arylhydrocarbon Rezeptor (AhR) und dadurch vermittelte Induktion der Cytochrome P450 CYP1A1 und CYP1B1 antiestrogene Wirkung ausübt und in den Estrogenrezeptor alpha (ERalpha) vermittelten Signalweg eingreifen kann. In der vorliegenden Arbeit wurde die Hypothese überprüft, ob eine gesteigerte Aktivierung des Estradiolmetabolismus durch die TCDD induzierten Enzyme CYP1A1 und CYP1B1 zu oxidativen DNA Schäden in Leberzellen führen kann. Außerdem wurde die mögliche Modulation durch 17beta-Estradiol (E2) untersucht. Die ausgewählten spezies- und geschlechtsspezifischen AhR-responsiven Leberzellmodelle, die Hepatomzelllinien HepG2 (human) und H4IIE (Ratte) sowie primäre Rattenhepatozyten von männlichen und weiblichen Wistar Ratten, zeigten eine Induktion von CYP durch TCDD. Die basale und TCDD-induzierte Expression von CYP1B1, welches als Schlüsselenzym im Estradiolmetabolismus E2 in das reaktivere und gentoxische 4-Hydroxyestradiol überführt, war am besten in den primären Rattenhepatozyten ausgeprägt. Die CYP-abhängige Induktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) konnte nur in Rattenzellen gezeigt werden und lässt diese als bessere Stimulatoren des Estradiolmetabolismus über den reaktiveren CYP1B1-vermittelten Reaktionsweg vermuten. Estradiol selbst induzierte ROS nur in primären Rattenhepatozyten, was gleichzeitig mit einer Induktion von CYP1B1 mRNA verbunden war. Zum ersten Mal wurde in dieser Arbeit die Rolle von TCDD und E2 auf oxidative DNA Schäden im Comet Assay in vitro an Leberzellen untersucht und brachte beide Substanzen als Induktoren oxidativer DNA Basenmodifikationen nur in den primären Rattenhepatozyten hervor. Die direkte DNA schädigende Wirkung der beiden Hauptestradiolmetaboliten, 4-Hydroxyestradiol und 2-Hydroxyestradiol, trat ebenfalls nur in primären Rattenhepatozyten auf und zeigte, dass E2 die DNA im gleichen Ausmaß schädigte. Die Induktion oxidativer DNA Schäden durch E2 konnte allerdings nicht vollständig mit der metabolischen Umwandlung von E2 durch CYP1A1 und CYP1B1 erklärt werden und muss weiter untersucht werden. Die endogene Expression geringer Mengen an ERalpha mRNA in Rattenhepatozyten und das Fehlen von ERalpha in den Hepatomzelllinien wurde zum Anlass genommen, die Effekte von ERalpha in transfizierten HepG2 zu untersuchen. Durch die Überexpression von ERalpha zeigte E2 eine steigernde Wirkung auf die AhR-vermittelte transkriptionelle Aktivität als mögliche Regulation von E2 Levels. Im Gegenzug reduzierte TCDD die durch E2 aktivierte ERalpha Signalwirkung und bestätigte die antiestrogene Wirkung von TCDD. Eine solche Modulation durch die Kobehandlung von TCDD mit E2 konnte in allen anderen Experimenten nicht beobachtet werden und die Rolle niedriger endogener ERalpha Levels muss in weiteren Transfektionsversuchen an primären Rattenhepatozyten untersucht werden. Nichtsdestotrotz wurde in dieser Arbeit ein Crosstalk zwischen ERalpha und AhR zum ersten Mal in der Hepatomazelllinie HepG2 nach transienter Transfektion mit ERalpha gezeigt.

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Metadaten
Author:Manuela Göttel
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-25667
Advisor:Dieter Schrenk
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:English
Year of Completion:2009
Year of Publication:2009
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2009/12/10
Tag:17beta-Estradiol ; AhR/ER Crosstalk; CYP1A1 ; CYP1B1 ; oxidative DNA Schäden
17beta-Estradiol ; AhR/ER Crosstalk; Cytochomes P450 ; TCDD ; oxidative DNA Damage
GND-Keyword:Ah-Rezeptor ; Cytochrom P-450 ; DNS-Schädigung; Estradiol ; Estradiolrezeptor ; Leber ; Tetrachlordibenzodioxine
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften

$Rev: 12793 $