Functional Characterization of Mitochondrial Uncoupling Protein 2 by EPR Studies

  • Uncoupling protein1 (UCP1) in brown adipose tissue was discovered earlier as the main uncoupling source of respiration. We describe the basic facts and a modest contribution of our group to the area of research on mitochondrial uncoupling proteins. After defining the terms uncoupling, leak, proton-mediated uncoupling, we discuss the assumption that due to its low abundance, uncoupling protein 2 (UCP2) can provide only mild uncoupling, i.e. can decrease the proton motive force by several mV only. A fatty acid cycling mechanism is described as a plausible explanation for the protonophoretic function of all uncoupling proteins together with our experiments supporting it. A speculation for the phylogenesis of all uncoupling proteins can be deduced by estimated UCP2 content in several tissues, and details of its activation are explained on the basis of our experiments. In the present study a solubilization and refolding method for UCP2 from inclusion bodies was developed and characterized. As it was known and also demonstrated from previous experiments on UCP1 that fatty acids are substrates, we used the same procedure to study the function of UCP2. Utilizing spin-labelled fatty acids (SLFA) for our experiments we demonstrated the binding of fatty acids to UCP2, and the competition of other natural fatty acids like oleic acid, palmitic acid, arachidonic acid and eicosatrienoic acid to the preformed complex emphasizes the presence of a fatty acid binding site for mitochondrial UCP2. The findings were observed by EPR spectroscopy where the highly immobilized spectra with presence of spin-labelled fatty acid eventually end up as free spin label spectra with a particular concentration of the natural fatty acid added to the UCP2 bound with spin-labelled fatty acid. This fits in significantly with the earlier findings of UCP1 and also leads to assumption of functional explanation about the physiological relevance between the uncoupling proteins functions. The present study, in which representative and sensitive parameters for EPR spectroscopy were established, at the same time describes the concentration effects of fatty acids upon the protein bound with spin-labelled fatty acids which are much of importance in comparison to physiological levels, being in the micromolar range (µM) as compared with milli molar (mM) as for UCP1 previously. In appropriate examples, different fatty acids are used and compared with competitors like alkylsulfonates also emphasizing the function of the protein. And the studies with the effect of nucleotides inhibition demonstrate that there exists a putative binding site for fatty acids. Much significance lies in demonstration with the spin-labelled-ATP studies where competition of ATP to the protein bound to spin-labelled ATP explains about the inhibition effect of nucleotides on the UCP2. So the present study applies different methods for the functional characterization of UCP2. The studies of natural fatty acids and alkylsulfonates with UCP2 bound to spin-labelled fatty acid, and study of nucleotide inhibition on UCP2 are closely related and give the much awaited answer to the question of functional similarities between UCP1 and UCP2. This supports the discussion of many groups which predict the functional similarity between these two proteins based upon sequence homology. Also many attempts have been reported in literature to explain the physiological functional relevance where by this present study can also be added to as we now suppose from the present conclusions of our experiments.
  • Entkoppler-Protein 1 (uncoupling protein 1, UCP1) wurde bereits früher als Hauptursache der Atmungs-Entkopplung in braunem Fettgewebe entdeckt. Wir beschreiben hier die grundlegenden Tatsachen sowie unseren Beitrag zur Erforschung der mitochondrialen Entkoppler-Proteine. Nach einer Definition der Begriffe Entkopplung, Leck (leak) und Protonen-vermittelte Entkopplung, diskutieren wir die Annahme, dass Entkoppler-Protein 2 (UCP2) auf Grund seines geringeren Vorkommens nur schwache entkoppelnde Wirkung zeigen, d. h. die protonmotorische Kraft nur um wenige mV senken kann. Ein Fettsäure-Austausch-Mechanismus wird als plausible Erklärung für die Protonentransport-Funktion aller Entkoppler-Proteine beschrieben, der durch unsere Ergebnisse unterstützt wird. Eine Spekulation über die Phylogenese aller Entkoppler-Proteine kann durch Abschätzung des UCP2-Gehalts in verschiedenen Geweben abgeleitet werden, und Einzelheiten der Aktivierung können auf Grund unserer Experimente erklärt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Solubilisierungs- und Rückfaltungsmethode für UCP2 aus inclusion bodies entwickelt und charakterisiert. Da aus früheren Experimenten mit UCP1 bekannt war, dass Fettsäuren als Substrate fungieren, benutzten wir beim Studium der Funktion von UCP2 dieselbe Vorgehensweise wie dort. Unter Verwendung von spinmarkierten (spin-label-, SL-)Fettsäuren für unsere Experimente demonstrierten wir die Bindung von Fettsäuren an UCP2, und die Konkurrenzreaktion natürlicher Fettsäuren wie Ölsäure, Palmitinsäure, Arachidonsäure und Icosatriensäure am vorgeformten Komplex unterstreicht das Vorhandensein einer Fettsäure-Bindungstasche bei mitochondrialem UCP2. Die Beobachtungen wurden mit Hilfe von EPR-Spektroskopie gemacht, wobei zunächst bei Zugabe von SL-Fettsäure zu UCP2 Spektren erhalten werden, die für hohe Immobilisierung typisch sind, die aber bei Zugabe bestimmter Konzentrationen natürlicher Fettsäuren in die Spektren der freien SL-Fettsäure übergehen. Dies passt bedeutsamerweise zu den früheren Ergebnissen mit UCP1 und führt auch zu einer Annahme über die physiologische Relevanz der Funktionen der Entkoppler-Proteine. Die vorliegende Studie, in der repräsentative und sinnvolle Parameter für die EPR-Spektroskopie erarbeitet wurden, beschreibt zugleich Konzentrationseffekte von Fettsäuren auf den Komplex von Protein und SL-Fettsäure, die auch im Hinblick auf physiologische Konzentrationen durchaus Bedeutung haben, da sie im mikromolaren Bereich auftreten im Gegensatz zum millimolaren zuvor bei UCP1. Eine geeignete Auswahl verschiedener Fettsäuren wurde als Kompetitoren benutzt und in dieser Eigenschaft mit Alkylsulfonaten verglichen, wodurch ebenfalls die Funktion des Proteins deutlich gemacht wurde. Untersuchungen des Effekts der Inhibierung durch Nucleotide zeigen ebenfalls die Existenz der fraglichen Fettsäure-Bindungstasche. Große Bedeutung liegt in der Demonstration der Verdrängung von SL-ATP durch ATP aus dem Komplex mit dem Protein, wodurch der inhibitorische Effekt von Nucleotiden auf UCP2 erklärt wird. Hierzu werden in der vorliegenden Arbeit verschiedene Methoden zur funktionellen Charakterisierung von UCP1 angewandt. Die Untersuchungen natürlicher Fettsäuren und Alkylsulfonate mit UCP2 im Komplex mit spinmarkierter Fettsäure und die Untersuchung der Nucleotid-Inhibition von UCP2 hängen eng zusammen und geben die lang erwartete Antwort auf die Frage nach funktionellen Ähnlichkeiten bei UCP1 und UCP2. Dies stellt die Diskussionen vieler Gruppen auf eine neue Grundlage, die die funktionelle Ähnlichkeit beider Proteine auf Basis der Sequenzhomologie vorhersagen. Es gab auch viele Versuche in der Literatur, die physiologische Relevanz aufzuklären, wozu durch diese Untersuchungen, nach unseren gegenwärtigen Experimenten zu schließen, ebenfalls ein Beitrag geleistet werden kann.

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Metadaten
Author:Mandapati V.L. Narasimha Raju
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-19800
Advisor:Wolfgang Trommer
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:English
Year of Completion:2006
Year of Publication:2006
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2006/08/15
Tag:EPR Spektroskopie; Fettsäuren; Mitochondrien; UCP2
EPR Spectroscopy; Fattyacids; Mitochondria; UCP2
GND-Keyword:EPR Spektroskopie
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften

$Rev: 12793 $