Wirkmechanistische Untersuchungen zur Beeinflussung humaner Topoisomerasen durch Anthocyanidine, sowie Einfluss der Tyrosyl-DNA-Phosphodiesterase 1 (TDP1) auf die Wirkung von Topoisomerasegiften

Effect of anthocyanidins on human topoisomerases - relevance for DNA integrity and impact of the tyrosyl-DNA-phosphodiesterase 1 (TDP1) on the effects of topoisomerasepoisons

  • Anthocyane, eine Untergruppe der Flavonoide, sind als natürliche Farbpigmente weit verbreitet in Lebensmitteln pflanzlicher Herkunft. Ihnen werden eine Reihe von gesundheitlich positiven Wirkungen zugeschrieben, was dazu geführt hat, dass auf dem Markt für Nahrungsergänzungsmittel immer mehr Produkte auf Anthocyanbasis auftauchen. Als ein möglicher nachteiliger Faktor für eine potentielle genotoxische Wirkung von Flavonoiden wird die Interaktion mit humanen Topoisomerasen diskutiert. Bezüglich einer möglichen Risiko/Nutzen-Evaluierung ist es nicht nur von Bedeutung, ob Flavonoide/Anthocyane mit diesen Enzymen interagieren, sondern auch die Art dieser Interaktion und sich möglicherweise daraus ergebende Konsequenzen, besonders im Hinblick auf die Integrität der DNA. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Anthocyanidine Delphinidin (Del), Cyanidin (Cy), Pelargonidin (Pg), Paeonidin (Pn) und Malvidin (Mv) hinsichtlich ihrer Beeinflussung humaner Topoisomerase I und II zu untersuchen. Ein Schwerpunkt lag bei der Aufklärung des Wirkmechanismus dieser Verbindungen bezüglich einer Stabilisierung des Cleavable Complex, möglichen Interaktionen mit der DNA und die Relevanz dieser Effekte für die Integrität zellulärer DNA. Es konnte gezeigt werden, dass nur die Verbindungen mit vicinalen Hydroxygruppen im B-Ring des Anthocyangrundgerüstes, Del und Cy, effektiv die katalytische Aktivität isolierter humaner Topoisomerase I und Topoisomerase IIalpha + IIbeta hemmen. Sie wirken jedoch nicht wie die klassischen Topoisomerasegifte Camptothecin oder Etoposid über die Stabilisierung des kovalenten Topoisomerase-DNA-Komplexes, sondern stellen rein katalytische Inhibitoren dar. Del und Cy könnten sogar die DNA vor Topoisomerase I-Giften schützen, da sie zumindest am isolierten Enzym die Stabilisierung des Cleavable Complex der Topoisomerase I durch Camptothecin effektiv verhindern. Für alle getesteten Anthocyanidine konnte gezeigt werden, dass sie im niedrigen mikromolaren Bereich, zwischen 15 µM und 50 µM, sowohl an die kleine Furche der DNA binden, als auch in die DNA interkalieren können und das diese DNA-interagierenden Eigenschaften keinen wesentlichen Beitrag zur Hemmung der Topoisomerasen liefern. Auch wenn im Falle der Anthocyanidine die direkte DNA-Interaktion im Hinblick auf die Topoisomerasehemmung nur von geringer Bedeutung ist, so scheint sie jedoch relevant bezüglich der Integrität zellulärer DNA zu sein. Die einstündige Inkubation von HT29 Kolonkarzinomzellen zeigte, dass bei Inkubation mit den Anthocyanidinen in Konzentrationen >50 µM, signifikant DNA-Schäden induziert werden. Im Hinblick auf die Integrität der DNA lebender Zellen scheint der jeweilige Konzentrationsbereich von entscheidender Bedeutung zu sein. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss der Überexpression der Tyrosyl-DNA-Phosphodiesterase 1 (TDP1) nach Inkubation mit Topoisomerasegiften zu untersuchen. Im Rahmen einer Kooperation mit Prof. Boege, Universitätsklinikum Düsseldorf, wurden uns verschiedene Zellklone zur Verfügung gestellt, die ein Fusionsprotein aus TDP1 und GFP überexprimierten, sowie eine katalytisch inaktive Variante des Enzymes (TDP1-H263A). Im Rahmen dieser Arbeit wurden Untersuchungen an diesen Zelllinien zur Zytotoxizität von Topoisomerasegiften durchgeführt, sowie Untersuchungen zum Einfluss der TDP1 auf die Induktion von DNA-Schäden durch Topoisomerasegifte. Untersuchungen zum Zellwachstum der verschiedenen Zelllinien mittels MTT-Zytotoxiziätsassay zeigten nach 72 stündiger Inkubation mit den Topoisomerasegiften Camptothecin (Topo I) und Etoposid (Topo II) keinen signifikanten Wachstumsvorteil bei Überexpression der TDP1. Betrachtet man jedoch die Induktion von DNA-Schäden bei Kurzzeitinkubationen (1h) von Camptothecin im Comet-Assay, so erkennt man eine signifikante Reduktion der DNA-Schäden bei Überexpression der TDP1. Ist bei der TDP1 das katalytische Histidin 263 gegen Alanin ausgetauscht, steigen die DNA-Schäden auf das gleiche Niveau wie bei nicht TDP1-überexprimierenden Zellen, d.h. es findet keine Reparatur statt. Erstaunlicherweise zeigte sich auch bei der Inkubation mit dem Topoisomerase II-Gift Etoposid, welches ursprünglich als Negativkontrolle gedacht war, der gleiche Reparatureffekt. Eine Hochregulation DNA-reparierender Enzyme ist unwahrscheinlich, da bei Inkubation mit dem DNA-methylierenden Agens N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) alle Zelllinien eine vergleichbare Menge an DNA-Schäden aufwiesen. Die nunmehr erzielten Ergebnisse eröffnen erstmals die Möglichkeit den Comet-Assay, unter Verwendung der unterschiedlichen TDP1-Klone, zum Auffinden von TDP1-Hemmstoffen einzusetzen.
  • In the present study we investigated the effect of the anthocyanidins delphinidin (DEL), cyanidin (CY), pelargonidin (PG), paeonidin (PN) and malvidin (MV) on human topoisomerases I and II and its relevance for DNA integrity within human cells. We especially focused on the mechanism of interaction with the target enzyme, particularly the stabilization of the covalent DNA-topoisomerase-intermediate (cleavable complex), possible interactions with DNA and the potential relevance for DNA integrity within human cells. Anthocyanidins bearing vicinal hydroxyl groups at the B-ring, DEL and CY, were found to potently inhibit the catalytic activity of human topoisomerases I and II, without discriminating between the IIalpha and IIbeta isoforms. However, in contrast to topoisomerase poisons, DEL and CY did not stabilize the cleavable complex. Using recombinant topoisomerase I, the presence of CY or DEL (> 1 µM) effectively prohibited the stabilization of the cleavable complex by the topoisomerase I poison camptothecin. In contrast, the stabilization of the topoisomerase II cleavable complex by etoposide remained unaffected. Using a fluorescence competition assay with ethidiumbromide or Hoechst 33258, it could be shown that at all analogues were able to compete with ethidium bromide for the intercalation into calf thymus DNA or to replace the minor groove binder Hoechst 33258. Furthermore it could be shown that at concentrations > 50 µM all anthocyanidins tested (delphinidin, cyanidin, malvidin, pelargonidin, paeonidin), including those not interfering with topoisomerases, were found to induce DNA strand breaks in the comet assay. These data indicate substantial affinity to double stranded DNA, which might contribute at least to the DNA strand breaking effect of anthocyanidins. The effect of anthocyanidins on DNA integrity appears to depend on the concentration range. A second focus of the present study was the influence of an overexpression of the tyrosyl-DNA-phosphodiesterase 1 (TDP1) on the effects of topoisomerase poisons. The group of Prof. Boege, Düsseldorf University Hospital, established a cell line that overexpresses a fusion protein of TDP1 with the green fluorescent protein (GFP), as well as a catalytic inactive form of the fusionprotein (TDP1-H263A). Within the scope of a cooperation, we investigated the cytotoxic effect of topoisomerase poisons on these cell lines and the impact of the TDP1 overexpression on DNA damage induced by topoiosmerase posions. Studies on cell growth of the different cell lines were performed using a MTT-cytotox assay. After 72h incubation with the topoisomerase poison camptothecin (topo I) or etoposide (topo II), there was no significant advantage in cell growth when TDP1 was overexpressed. Regarding the DNA damaging effect of a short time incubation (1h), it could be shown that a TDP1 overexpression results in a significant reduction of the DNA damage induced by camptothecin. If the catalytic histidine 263 of TDP1 is mutated to alanine, the amount of DNA damage in this cell line is comparable to the parental control cell line, i.e. an active TDP1 is needed for the “repair” of the drug-stabilized covalent topoisomerase-DNA-complex. To our utter astonishment, a similar effect was seen upon exposure to the topo II poison etoposide, initially meant as a negative control. This unexpected result seemed to suggest that overexpression of active TDP1 confers some sort of a general resistance to DNA-damaging agents. However, this hypothesis had to be discarded because treatment of the cells with N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), a chemical compound that damages DNA in a manner independent of topo I or topo II, produced DNA comets of similar size in all cell lines. It might even be worthwhile to consider TDP1 as a therapeutic cotarget of topo I and topo II poisons. These results might allow to use the comet assay, in combination with the available cell lines, to search for TDP1 inhibitors.

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Metadaten
Author:Michael Habermeyer
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-18498
Advisor:Doris Marko
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2005
Year of Publication:2005
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2005/05/02
Tag:DNA-Schäden; Topoisomerasegifte; Topoisomerasehemmstoffe; Tyrosyl-DNA-Phosphodiesterase 1 (TDP1)
DNA damage; TDP1; anthocyanidins; mechanism; topoisomerases
GND-Keyword:Anthocyanidine ; Topoisomerasen
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften

$Rev: 12793 $