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Etablierung eines spezies-spezifischen in vitro-Instrumentariums zur Erfassung der Induktion des Fremdstoffmetabolismus

Establishment of a species specific in vitro instrument for the detection of induction in drug metabolism

  • Der Kernrezeptor PXR spielt eine bedeutende Rolle im Fremdstoffmetabolismus als auch im Stoffwechsel endogener Substrate. Er reguliert die Expression zahlreicher Proteine des Fremdstoffwechsels. Deshalb hat die Aktivierung oder Hemmung des PXR einen großen Einfluss auf den Stoffwechselstatus dieser Proteine. Zum derzeitigen Stand der Forschung nimmt der PXR eine Schlüsselfunktion bei der Regulation der CYP3A-Enzyme ein. Es besteht deshalb Interesse Substanzen, die in Verdacht stehen PXR abhängig CYP3A zu induzieren, zu untersuchen. In dieser Arbeit wurden bromierte Flammschutzmittel und der Arzneimittelkandidat EMD untersucht. Aus den Vorversuchen wurde ersichtlich, dass die Rattenhepatomzelllinie H4IIE und die humane Hepatomzelllinie HepG2 geeignete in vitro Systeme zur Untersuchung der PXR-abhängigen CYP3A-Aktivierung darstellen. Untersuchungen zum Genexpressionsverhalten zahlreicher Gene des Fremdstoffmetabolismus mittels TLDA-Karten zeigten, dass die beiden Zelllinien viele dieser Gene exprimieren, die nach Inkubation mit den Prototypinduktoren Rifampicin und Dexamethason spezies-spezifisch reguliert wurden. Die beiden Zelllinien wurden schließlich mit einem Reportergenvektor, der die PXR responsiven Elemente des CYP3A4-Gens enthält, stabil transfiziert. An den stabil transfizierten HepG2-XREM3- und H4IIE-XREM3-Zellen wurden bekannte CYP-Induktoren sowie der Arzneimittelkandidat EMD und die Flammschutzmittel HBCD and der pentaBDE Mix getestet. Die Flammschutzmittel HBCD und der pentaBDE-Mix, werden in Textilwaren, Kunststoffen, Möbeln, Teppichen, Elektrogeräten und Baumaterialen eingesetzt. Falls sie tatsächlich den PXR spezies-spezifisch aktivieren sollten, könnten sie eine Gefahr für Mensch und Umwelt darstellen. Deshalb wurde in dieser Arbeit die CYP3A-mRNA-Expression, die Protein- sowie die Reportergenaktivität überprüft. Als gemeinsamer Aktivator des hPXR und rPXR stellte sich Clotrimazol, aber auch das Flammschutzmittel HBCD heraus, während pentaBDE ein besserer Ligand des hPXR ist. Omeprazol und Phenobarbital induzierten die rPXR-vermittelte CYP3A-Induktion in H4IIE-XREM3-Zellen nicht; in den humanen HepG2-XREM3-Zellen konnte jedoch eine moderate Reportergenaktivität gemessen werden. Weiteres Interesse besteht an dem Arzneimittelkandidaten EMD zur Behandlung des metabolischen Syndroms und Typ II-Diabetes. In vivo (Affen, Ratten) und in vitro (Hepatozyten) wurden bereits spezies-spezifische Effekte auf die CYP3A-Induktion durch EMD beobachtet. Deshalb wurde in dieser Arbeit der über aktivierten PXR vermittelte Mechanismus an Zelllinien überprüft. Dabei stellte sich heraus, dass EMD ein hPXR-Aktivator und CYP3A-Induktor in HepG2-Zellen, jedoch kein Aktivator von rPXR in H4IIE-Zellen ist. Um schwerwiegende Nebenwirkungen und unvorhersehbare Arzneimittelwechselwirkungen durch die Aufnahme von Fremdstoffen zu verhindern, ist es bei der Neuentwicklung von Wirkstoffen aller Art notwendig, die Stoffe auf eine mögliche Induktion der Fremdstoff-metabolisierenden Enzyme zu untersuchen. Deshalb war das Ziel dieser Arbeit die Etablierung von zell-basierten in vitro Assays zur Ermittlung der spezies-spezifischen PXR-abhängigen Induktion von CYP3A durch Chemikalien und Arzneimittelkandidaten, um mögliche Arzneimittel- und Fremdstoffwechselwirkungen und damit verbundene Sicherheitsrisiken vorhersagen zu können. Das etablierte PXR- Screeningsystem repräsentiert zwei in vitro Modelle, die erlauben spezies-spezifische Wirkungen auf die CYP3A-Induktion von Chemikalien, Umweltkontaminanten, Lebensmittelinhaltsstoffe und Arzneimittel schnell, einfach und kostengünstig abschätzen zu können. Eine frühe Erkennung der PXR-Aktivierung und CYP-Induktion von Arzneimitteln in der Entwicklung kann einen Weiterentwicklungsstopp dieser zur Folge haben. Dies hilft zusätzliche Tierversuche und Kosten einzusparen. Dem 3R-Prinzip (Reduce, Refine, Replace) vom Reduzieren der Anzahl der Tierversuche, der Verbesserung der existierenden Experimente und dem Ersetzen von Tierversuchen durch alternative Methoden (Russel & Burch, 1959) wird durch die stabil transfizierten Zelllinien in zweierlei Hinsicht Rechnung getragen: unnötige Tierversuche können vermieden reduction und die Aussagekraft von durchgeführten Tierstudien (z.B. vom Gesetzgeber geforderte Studien zur Arzneimittelentwicklung) verbessert werden (dies trägt auch zu einem refinement bei). Damit stellen die HepG2-XREM3- und H4IIE-XREM3-Zellen eine wichtige innovative Verbesserung bei der Entwicklung von Arzneistoffen sowie bei der regulatorischen Testung von Chemikalien dar.
  • Pre-tests showed that the rat and the human hepatoma cell lines H4IIE and HepG2 represent suitable in vitro systems for the investigation of the PXR dependent CYP3A induction. Examinations of characteristics in gene expression of numerous genes of the drug metabolism using TLDA cards indicated that both cell lines express many of these genes which were regulated species specific after incubation with the prototypical PXR agonists rifampicine and dexamethasone. Both cell lines were then stably transfected with a reporter gene containing the PXR responsive elements that mediate the regulation of PXR target genes such as CYP3A. With the stably transfected human HepG2-XREM3- and rat H4IIE-XREM3-cells well-known CYP-inducers as well as the drug candidate EMD and the BFRs HBCD and the pentaBDE mix were screened. The BFRs HBCD and pentaBDE mix are used in textiles, plastics, furniture, carpets, electrical equipments and construction materials. If they would actually activate PXR species specific they may pose unpredictive hazards for humans and environment. Hence, CYP3A mRNA expression, protein, reporter gene activity were screened in a species specific manner. In the human HepG2-XREM3- and rat H4IIE-XREM3-cells, clotrimazole and HBCD were found as common activators of the human and rat PXR whereas pentaBDE is preferred by the hPXR. Omeprazole and Phenobarbital did not induce the rPXR dependent CYP3A induction in H4IIE-XREM3-cells, but a moderate reporter gene activity could be measured in HepG2-XREM3-cells. Another interest exists in the drug candidate EMD for the treatment of "metabolic syndrome" and type 2 diabetes. In vivo (monkeys, rats) and in vitro (hepatocytes) species specific effects on the CYP3A induction by EMD were already noticed. Therefore, the mode of action of these effects was analyzed for PXR activation in these cell lines. EMD was an hPXR activator and CYP3A inducer in HepG2 cells but no activator of rPXR in H4IIE cells proving its species specific activation observed in vivo. In order to prevent serious adverse effects or unpredicted drug-drug interactions (DDI) by the intake of drugs it is necessary to investigate the possible induction of drug metabolizing enzymes of drugs in the development. Therefore, the aim of this work was to establish cell-based in vitro assays for the evaluation of the species specific PXR dependent induction of CYP3A of chemicals and drug development candidates to predict potential DDI and related safety hazards. The established PXR screening system represents in vitro systems that permit to evaluate simultaneously, fast, simple and cost-effective the species specific effects on the CYP3A induction in humans and rats of chemicals, environmental contaminants, food ingredients and drugs. An early identification of PXR activation and CYP induction of drugs in development can help in the decision to discontinue or advance their further development. This will help to reduce and avoid useless animal experiments. The 3R principles of reducing the number of animal tests, the refinement of existing experiments and the replacement of animal experiments by new and alternative methods (Russel & Burch, 1959) are taken into account by the stably transfected cell lines twofold: unnecessary animal experiments can be avoided ("reduction") and the data interpretation of animal tests (e.g. from the legislator claimed studies for drug development) can be improved (this contributes to a "refinement"). For this reason HepG2-XREM3- and H4IIE-XREM3-cells represent an important innovative improvement for the development of drugs as well as for the regulatory testing of chemicals.

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Metadaten
Verfasserangaben:Yvonne Fery
URN (Permalink):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-24529
Betreuer:Dieter Schrenk
Dokumentart:Dissertation
Sprache der Veröffentlichung:Deutsch
Jahr der Fertigstellung:2009
Jahr der Veröffentlichung:2009
Veröffentlichende Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Titel verleihende Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Datum der Annahme der Abschlussarbeit:12.10.2009
Datum der Publikation (Server):18.12.2009
Freies Schlagwort / Tag:CYP3A4; Cytochrome P450; Fremdstoffmetabolismus; PXR; stabile Transfektion
CYP3A4; Cyochrome P450; PXR; drug metablism; stable transfection
Fachbereiche / Organisatorische Einheiten:Fachbereich Chemie
DDC-Sachgruppen:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie
Lizenz (Deutsch):Standard gemäß KLUEDO-Leitlinien vor dem 27.05.2011