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Metabolic channeling during phycoerythrobilin biosynthesis.

  • The transfer of substrates between to enzymes within a biosynthesis pathway is an effective way to synthesize the specific product and a good way to avoid metabolic interference. This process is called metabolic channeling and it describes the (in-)direct transfer of an intermediate molecule between the active sites of two enzymes. By forming multi-enzyme cascades the efficiency of product formation and the flux is elevated and intermediate products are transferred and converted in a correct manner by the enzymes. During tetrapyrrole biosynthesis several substrate transfer events occur and are prerequisite for an optimal pigment synthesis. In this project the metabolic channeling process during the pink pigment phycoerythrobilin (PEB) was investigated. The responsible ferredoxin-dependent bilin reductases (FDBR) for PEB formation are PebA and PebB. During the pigment synthesis the intermediate molecule 15,16-dihydrobiliverdin (DHBV) is formed and transferred from PebA to PebB. While in earlier studies a metabolic channeling of DHBV was postulated, this work revealed new insights into the requirements of this protein-protein interaction. It became clear, that the most important requirement for the PebA/PebB interaction is based on the affinity to their substrate/product DHBV. The already high affinity of both enzymes to each other is enhanced in the presence of DHBV in the binding pocket of PebA which leads to a rapid transfer to the subsequent enzyme PebB. DHBV is a labile molecule and needs to be rapidly channeled in order to get correctly further reduced to PEB. Fluorescence titration experiments and transfer assays confirmed the enhancement effect of DHBV for its own transfer. More insights became clear by creating an active fusion protein of PebA and PebB and comparing its reaction mechanism with standard FDBRs. This fusion protein was able to convert biliverdin IXα (BV IXα) to PEB similar to the PebS activity, which also can convert BV IXα via DHBV to PEB as a single enzyme. The product and intermediate of the reaction were identified via HPLC and UV-Vis spectroscopy. The results of this work revealed that PebA and PebB interact via a proximity channeling process where the intermediate DHBV plays an important role for the interaction. It also highlights the importance of substrate channeling in the synthesis of PEB to optimize the flux of intermediates through this metabolic pathway.
  • Der Transfer von Substraten zwischen Enzymen innerhalb eines Biosyntheseweges ist ein effektiver Weg, das spezifische Produkt zu synthetisieren und eine gute Möglichkeit, Stoffwechselstörungen zu vermeiden. Dieser Prozess wird als metabolic channeling bezeichnet und beschreibt den (in-)direkten Transfer eines Intermediats zwischen den aktiven Zentren zweier beteiligter katalytischer Enzyme. Durch die Bildung von Multi-Enzym-Kaskaden werden die Effizienz der Produktbildung als auch der Flux erhöht und die Intermediate werden von den Enzymen korrekt übertragen und umgesetzt. Bei der Tetrapyrrolbiosynthese treten viele Substrattransferereignisse auf und sie sind Voraussetzung für eine optimale Pigmentsynthese. In diesem Projekt wurde der metabolic channeling-Prozess beim pinken Pigment Phycoerythrobilin (PEB) untersucht. Die für die PEB-Bildung verantwortlichen Ferredoxinabhängigen Bilinreduktasen (FDBR) sind PebA und PebB. Bei der Pigmentsynthese wird das Intermediat 15,16-Dihydrobiliverdin (DHBV) gebildet und von PebA auf PebB übertragen. Während in früheren Studien ein metabolic channeling des DHBV postuliert wurde, zeigt diese Arbeit neue Erkenntnisse über die Vorrausetzungen dieser Protein-Protein-Interaktion. Es wurde deutlich, dass die wichtigste Anforderung für die PebA/PebB-Interaktion die Affinität zu ihrem Substrat/Produkt DHBV ist. Die bereits hohe Affinität beider Enzyme zueinander wird in Gegenwart von DHBV in der Bindungstasche von PebA verstärkt, was zu einer schnelleren Übertragung auf das nachfolgende Enzym PebB führt. DHBV ist ein instabiles Molekül und muss schnell übertragen werden um korrekt weiter zu PEB reduziert zu werden. Fluoreszenztitrationsexperimente und Transferassays bestätigen den Verstärkungseffekt von DHBV für den eigenen Transfer. Weitere Erkenntnisse der Substratübertragung wurden durch die Erstellung eines aktiven Fusionsproteins aus PebA und PebB und den Vergleich seines Reaktionsmechanismus mit Standard-FDBRs deutlich. Dieses Fusionsprotein PebAgB setzt Biliverdin IXα (BV IXα) zu PEB um, welche damit eine starke Ähnlichkeit zu der PebS-Aktivität besitzt, die auch BV IXα über DHBV in PEB als einzelnes Enzym umwandeln kann. Das Produkt und das Intermediate dieser Reaktionen wurden mittels HPLC und UV-Vis-Spektroskopie identifiziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass PebA und PebB über einen proximity-channeling-Prozess interagieren, bei dem DHBV eine wichtige Rolle für die Interaktion spielt. Weiterhin wird die Bedeutung der Substratkanalisierung bei der Synthese von PEB unterstrichen, welche verantwortlich ist, den Flux der Intermediate während diesem Stoffwechselweg zu optimieren.

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Metadaten
Verfasserangaben:Marco Aras
URN (Permalink):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-54120
Betreuer:Nicole Frankenberg-Dinkel
Dokumentart:Dissertation
Sprache der Veröffentlichung:Englisch
Veröffentlichungsdatum (online):06.11.2018
Datum der Erstveröffentlichung:06.11.2018
Veröffentlichende Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Titel verleihende Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Datum der Annahme der Abschlussarbeit:16.10.2018
Datum der Publikation (Server):07.11.2018
Seitenzahl:111
Fachbereiche / Organisatorische Einheiten:Fachbereich Biologie
DDC-Sachgruppen:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften, Biologie
Lizenz (Deutsch):Creative Commons 4.0 - Namensnennung, nicht kommerziell, keine Bearbeitung (CC BY-NC-ND 4.0)