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Pathogene Differenzierung von Botrytis cinerea – Molekulare Grundlagen und Rolle des VELVET-Komplexes

  • Botrytis cinerea, der Erreger der Graufäule, infiziert hunderte verschiedene Pflanzenspezies und verursacht weltweit enorme landwirtschaftliche Verluste. Dabei tötet er das Wirtsgewebe sehr schnell mithilfe lytischer Enzyme und Nekrose-induzierender Metaboliten und Proteine ab. Das Signal-Mucin Msb2 ist in B. cinerea, wie in anderen pathogenen Pilzen, wichtig für die Oberflächenerkennung, Differenzierung von Appressorien und die Penetration des Pflanzengewebes. Msb2 agiert oberhalb der BMP1 Pathogenitäts-MAPK-Kaskade. In dieser Studie konnte eine direkte Interaktion zwischen Msb2 und BMP1, sowie zwischen den beiden Sensorproteinen Msb2 und Sho1 nachgewiesen werden. Dennoch führte die Deletion von sho1 lediglich zu geringfügigen Defekten im Wachstum, der Hyphendifferenzierung und der Bildung von Infektionsstrukturen. Sho1 zeigte nur einen geringen Einfluss auf die Aktivierung von BMP1. Das Fehlen von Sho1 verursachte keine Virulenzdefekte, während der Doppel-KO von msb2 und sho1 zu einer stärkeren Reduzierung der Läsionsausbreitung im Vergleich zu msb2 Mutanten führte. Es wurden mehrere keimungsregulierte, BMP1 abhängige Gene deletiert und die Mutanten phänotypisch charakterisiert. Keines der Gene für lytische Enzyme oder putative Effektorproteine beeinflusste die Virulenz. Mutanten, denen das für ein Ankyrin-repeat Protein codierende arp1 Gen fehlt, zeigten eine gestörte Oberflächenerkennung, gravierende Wachstumsdefekte und reduzierte Virulenz. B. cinerea VELVET-Mutanten sind in der lichtabhängigen Differenzierung und der Ausbreitung nekrotischer Läsionen beeinträchtigt. In dieser Arbeit ermöglichte die Charakterisierung mehrerer Mutanten ein besseres Verständnis der molekularen Vorgänge, aufgrund derer der VELVET-Komplex die Entwicklung und Pathogenese in B. cinerea reguliert. Quantitative Vergleiche der in planta Transkriptome und Sekretome führten zur Identifizierung eines für drei VELVET-Mutanten gemeinsamen Sets an herunterregulierten Genen, welche für CAZymes, Proteasen und Virulenz-assoziierte Proteine codieren. Die meisten dieser Gene wurden zusätzlich im Wildtyp während der Infektion verstärkt exprimiert, was zusätzliche Hinweise auf deren Relevanz im Infektionsprozess lieferte. Die drastisch verringerte Expression von Genen für Proteasen konnte mit niedrigerer Proteaseaktivität und der unvollständigen Mazeration des Gewebes an der Infektionsstelle in Verbindung gebracht werden. Der neu etablierte quantitative Sekretom-Vergleich des Wildtyps und der VELVET-Mutanten mithilfe 15N-markierter Proteine korrelierte eindeutig mit den Transkriptomdaten sekretierter Proteine. Damit wurde gezeigt, dass die Abundanz der Proteine maßgeblich von deren mRNA-Level abhängt. Die Unfähigkeit zur Ansäuerung des Wirtsgewebes ist einer der interessantesten phänotypischen Aspekte der VELVET-Mutanten. Während Citrat die dominierende von B. cinerea ausgeschiedene Säure ist, sekretierten VELVET-Mutanten deutlich weniger Citrat. Weder für Oxalat noch für Gluconat konnte eine wichtige Rolle während der Infektion bestätigt werden. Die Läsionsausbreitung der Mutanten wurde sowohl durch Zugabe von Vollmedium, als auch durch künstlich konstant niedrig eingestellte pH-Werte an den Infektionsstellen gefördert, während die Einstellung auf neutrale pH-Werte die Expansion beim B. cinerea Wildtyp stark beeinträchtigte. Damit ist die Ansäuerung in Tomatenblättern ein wichtiger Virulenzmechanismus, der möglicherweise essentiell für die Aktivität der sekretierten Proteine ist. Überraschenderweise scheint eine Ansäuerung des Gewebes für die erfolgreiche Infektion der Ackerbohne Vicia faba nicht notwendig zu sein. Weder B. cinerea noch der am nächsten verwandte Botrytis fabae, welcher sich als Spezialist auf V. faba aggressiver verhält, zeigten während der erfolgreichen Infektion eine Ansäuerung des Ackerbohnenblattgewebes. B. fabae ist auf wenige Wirtspflanzen der Fabaceae begrenzt. Die Grundlagen der Wirtsspezifität sind bisher unklar. Vergleichende Transkriptom- und Sekretom-Analysen ergaben Hinweise für die molekularen Ursachen der unterschiedlichen Wirtsspektren von B. cinerea und B. fabae. In dieser Arbeit konnte die schlechte Infektion durch B. fabae auf Tomatenblättern mit einer deutlich niedrigeren Proteaseaktivität in Verbindung gebracht werden, während artifiziell konstant niedrige pH-Werte die Läsionsausbreitung kaum förderten. Im Gegensatz zur Infektion von Tomatenblättern wurden jedoch auf V. faba insgesamt deutlich niedrigere Proteaseaktivitäten in den Sekretomen beider Spezies gemessen. Diese Daten weisen darauf hin, dass die beiden Spezies nicht nur generell unterschiedliche Infektionsstrategien anwenden, sondern dass die Virulenzmechanismen zusätzlich vom infizierten Pflanzengewebe abhängig sind.
  • Botrytis cinerea is a necrotrophic plant pathogen able to infect many hundreds of plant species. It kills host tissue rapidly by secretion of lytic enzymes and necrosis-inducing metabolites and proteins. The sensory mucin Msb2 in B. cinerea, like in other pathogenic fungi, is important for hard surface sensing, appressoria differentiation and penetration of plant tissue by acting upstream of the pathogenicity related MAPK cascade BMP1. In this study an interaction between Msb2 and BMP1 could be identified, and a physical interaction between the two sensor proteins Msb2 and Sho1 could be shown. Nevertheless, sho1 deletion mutants revealed only slight defects in growth, hyphal differentiation and formation of infection structures, and revealed a minor role of Sho1 in activation of BMP1. While lack of Sho1 did not result in virulence defects, msb2/sho1 double mutants showed more strongly reduced lesion expansion compared to the msb2 mutant. The function of several germination induced and BMP1 regulated genes were investigated by mutant analysis. None of the genes encoding lytic enzymes or putative effector proteins were found to be required for infection. Mutants lacking arp1, encoding an ankyrin-repeat containing protein, revealed surface sensing defects and strongly impaired growth and virulence. B. cinerea VELVET mutants show disturbed light dependent development and are impaired in virulence. In this study characterization of several mutants enabled a better understanding how the VELVET complex controls major aspects of pathogenic development. Quantitative comparison of in planta fungal transcriptomes defined a common set of genes encoding proteases, carbohydrate-active enzymes and virulence-associated proteins, which were downregulated in three different VELVET mutants. Most of these genes were induced in planta in the wild type strain, emphasizing their putative impact on virulence. Drastic downregulation of proteases in the mutants was correlated with lower protease activity and incomplete degradation of host proteins at the infection site. A newly established quantitative comparison of on planta secretomes of wild type and VELVET mutants by 15N-metabolic labelling revealed high correlation with transcriptome data, indicating that protein abundance is strongly determined by mRNA levels. Loss of acidification ability, and instead alkalization of their surroundings, was one of the most interesting phenotypic aspects of VELVET mutants. The mutants produced much lower amounts of citric acid, the dominating organic acid found to be secreted by B. cinerea. A major role of oxalic or gluconic acid during infection could not be confirmed. Lesion expansion by the mutants could be stimulated by providing rich medium or maintaining infection sites at acidic pH, whereas constant neutral pH values suppressed expansion of the wild type. These data demonstrate that the ability to acidify tomato leaf tissue is a significant virulence mechanism of B. cinerea, possibly by supporting the necrotizing activity of secreted proteins. Surprisingly, acidification of host tissue seems to be dispensable for infection of the broad bean Vicia faba. Neither B. cinerea nor its closest relative Botrytis fabae, which is highly aggressive on broad bean, acidified the tissue during successful infection. B. fabae is restricted on a limited set of host plants, all belonging to the Fabaceae. The molecular basis of host-specificity is yet unclear. Comparative transcriptome and secretome analyses of B. cinerea and B. fabae provided evidences for the molecular basis of their differences in host range. Failure of lesion formation by B. fabae on tomato leaves could be correlated with much lower secreted protease activity, while maintaining a low pH did not improve lesion expansion. However, protease activity in secretomes of both species was much lower on broad bean than on tomato leaves. These data indicate dissimilar infection strategies of the two Botrytis species, which seem to be additionally modulated by the infected host tissue.

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Metadaten
Verfasserangaben:Nathalie Müller
URN (Permalink):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-51273
Betreuer:Matthias Hahn
Dokumentart:Dissertation
Sprache der Veröffentlichung:Deutsch
Veröffentlichungsdatum (online):12.01.2018
Jahr der Veröffentlichung:2018
Veröffentlichende Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Titel verleihende Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Datum der Annahme der Abschlussarbeit:19.12.2017
Datum der Publikation (Server):16.01.2018
Freies Schlagwort / Tag:Azidifizierung; BMP1 MAP-Kinase; Infektionsmechanismus; Sekretomanalyse; VELVET; sho1
GND-Schlagwort:Botrytis cinerea; Botrytis fabae; Pathogenese; Transkriptomanalyse; Virulenzfaktor; Wasserstoffionenkonzentration
Seitenzahl:III, 126
Fachbereiche / Organisatorische Einheiten:Fachbereich Biologie
CCS-Klassifikation (Informatik):J. Computer Applications
DDC-Sachgruppen:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 500 Naturwissenschaften
MSC-Klassifikation (Mathematik):92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES
PACS-Klassifikation (Physik):80.00.00 INTERDISCIPLINARY PHYSICS AND RELATED AREAS OF SCIENCE AND TECHNOLOGY / 87.00.00 Biological and medical physics
Lizenz (Deutsch):Creative Commons 4.0 - Namensnennung, nicht kommerziell, keine Bearbeitung (CC BY-NC-ND 4.0)