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Transgene und endogene Reportersysteme in vitro zur Erfassung endokriner Effekte

  • Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Etablierung und Validierung transgener und endogener Reporter zur Erfassung und Charakterisierung estrogenartiger Fremdstoffe. Für den Aufbau transgener Reportergensysteme sollten eigene Reportergenplasmide konstruiert werden. Als transgene Reporter wurden die sekretierbare Alkalische Phosphatase sowie das Luciferase Enzym ausgewählt. Die Expression der Reportergene sollte unter der Kontrolle des estrogenrezeptorinduzierbaren Wildtyp Promotors Vitellogenin A2, der im Gegensatz zu synthetischen Tandemkopien alle Vorteile eines natürlichen Promotors aufweist, stehen. Dazu wurde der Vitellogenin A2 Promotor in die Multiple Cloning Site des Reportergenvektors vor die codierende Sequenz des Reportergens kloniert. Es gelang die Konstruktion beider Reportergenplasmide mit Hilfe zweier unterschiedlicher Verfahren. Die Zwischenschritte der Konstruktion wurden jeweils überprüft. Die abschließende Funktionsprüfung der Plasmide nach Transfektion in geeignete estrogenrezeptorpositive Zellinien durch entsprechende Inkubation der Zellen und Nachweis der Reportergene mittels spezifischer enzymatischer Reaktion war erfolgreich. Für den Aufbau eines neuen Reportergensystems wurde die humane Mammacarcinomzellinie MCF-7 mit dem Reportergenkonstrukt pSEAP2/VITA2 transfiziert. Die Etablierung und Validierung erfolgte mit bekannten Estrogenrezeptoragonisten und Antagonisten. Exemplarisch wurden zwei Estrogenrezeptoragonisten, Diethylstilbestrol (DES) und b-Sitosterol geprüft. Der nach DES-Inkubation aus den erhaltenen Kurven berechnete RE-Wert (RE=Relative Effektivität) lag, wie in der Literatur beschrieben, in der gleichen Größenordnung wie der von Estradiol. Zusätzlich gelang die Cotransfektion der Plasmide pSEAP2/VITA2 und pSV2neo in MCF-7 Zellen und die Selektion der transfizierten Zellen mit Geneticinsulfat (G418). Untersuchungen der Alkalischen Phosphatase Aktivität der Zellen nach entsprechender Substanzinkubation ergaben, daß die Zellen bis zu einem halben Jahr beide Plasmide integriert haben und zur Charakterisierung potentiell hormonaktiver Verbindungen verwendet werden können. Danach ist eine erneute Transfektion erforderlich. Die Entdeckung eines zweiten Estrogenrezeptors, ERb, in Ratte, Maus und Mensch verdeutlicht, daß estrogenrezeptorvermittelte Mechanismen sehr komplex sind. Da beide Subtypen eine unterschiedliche Gewebeverteilung aufweisen, wird ein Zusammenhang mit den selektiven Wirkungen der Estrogene auf deren Zielgewebe diskutiert. Durch den Einsatz spezifischer Primer für ERa und ERb konnte mittels RT-PCR gezeigt werden, daß in der humanen Mammacarcinomzellinie MCF-7 beide Subtypen exprimiert werden, was mit den Literaturergebnissen übereinstimmt. Aus diesem Grund sollten Reportergensysteme mit dem jeweiligen Estrogenrezeptorsubtyp in geeigneten Zellinien etabliert werden, um potentielle estrogenaktive Fremdstoffe am entsprechenden Subtyp getrennt zu untersuchen und so mögliche Unterschiede bezüglich der Genaktivierung zu erkennen. Es wurden verschiedene Zellinien, die endogen keinen Estrogenrezeptor exprimieren, mit den Rezeptorexpressionsplasmiden und den Reportergenplasmiden mit Hilfe unterschiedlicher Transfektionsmethoden transfiziert. Als geeignetste Zellinie erwies sich hierbei die embryonale Nierenzellinie HEK 293, als effektive und daneben auch kostengünstigste Transfektionsmethode wurde die Elektroporation gewählt. Die Etablierung und Validierung dieser Systeme konnte sowohl für Alkalische Phosphatase als auch für Luciferase erfolgreich abgeschlossen werden. Erste Substanzen wurden an beiden Subtypen durch Nachweis des Luciferasereportergens getestet. Signifikante Unterschiede wie von Kuiper et al [Kuiper et al, 1997] für die Phytoestrogene Coumestrol und Genistein beschrieben, konnte für die untersuchten Verbindungen (DES, Resveratrol und o,p'-DDT) nicht beobachtet werden. Neben transgenen Nachweismethoden sollte ein Verfahren zur Detektion eines endogenen Reporters etabliert und validiert werden. Dafür wurde das in der MCF-7 Zellinie estrogenabhängig exprimierte pS2 Protein als geeigneter Parameter ausgewählt. Zur Detektion des pS2-Proteins wurden zwei Nachweisverfahren eingesetzt. Auf Protein-Ebene ein immunradiometrischer Assay, auf mRNA-Ebene die RT-PCR. Der Nachweis des pS2-Proteins mittels immunradiometrischem Assay zeigte eine gute Sensitivität, der EC50-Wert von Estradiol lag im Vergleich zur stabilen MCF-7-Luc Zellinie eine Zehnerpotenz niedriger. Ergänzend wurden die Substanzen Bisphenol A, o,p'-DDT, Daidzein sowie p-tert.-Octyl- bzw. Nonylphenol untersucht. Der durch die jeweilige Verbindung hervorgerufene Verlauf der Proteininduktion ist mit den Ergebnissen des MCF-7-Luc-Systems vergleichbar. Im Vergleich zum MCF-7-Luc System konnte eine höhere intrinsische Potenz beobachtet werden. Die Etablierung der RT-PCR-Methode zum Nachweis der mRNA mit pS2 spezifischen Primern war erfolgreich. Weiterführende Untersuchungen zur Quantifizierung der pS2 mRNA mittels nicht-genomischem Standard wurden von Gensler durchgeführt. [Gensler, 1999] Verbindungen unterschiedlichster Herkunft wurden mit dem stabilen MCF-7-Luc System auf ein eventuell hormonelles Potential untersucht. Das Phytosterol b-Sitosterol (aus Soja und technisch erzeugtes) zeigte eine signifikante estrogene Wirkung, das als Negativkontrolle mitgeführte Cholesterol führte nicht zur Reportergeninduktion. Verschiedene Parabene wurden aufgrund der in der Literatur beschriebenen estrogenen Wirkung untersucht. Eine Expression der Luciferase durch die Parabene konnte im Transaktivierungsassay nicht nachgewiesen werden. Die Untersuchung verschiedener natürlich vorkommender Zimtsäureanaloga ergab, im Gegensatz zu Zimtsäuremethylester, keine Hinweise auf eine estrogene Aktivität. Neben der Prüfung von Einzelverbindungen kann dieses etablierte System auch zur Prüfung von Kombinationseffekten herangezogen werden. Kombinationen von Bisphenol A, o,p'-DDT, Daidzein, p-tert.-Octyl- oder Nonylphenol unterschiedlicher Konzentrationen mit Estradiol 1 nM ergaben hohe Reportergeninduktionen, die maximal bis zum Wirkungsplateau von Estradiol reichten. Zusätzliche Kombination mit ICI 182 780 1 microM führte zur Antagonisierung der beobachteten Effekte, was darauf hinweist, daß diese estrogenrezeptorvermittelt ablaufen. Es konnten neue funktionelle Testsysteme und Methoden zur effektiven Prüfung potentiell hormonell aktiver Verbindungen etabliert und validiert werden, die auf der Detektion transgener oder endogener Reporter beruhen. Diese können sowohl zur Wirkstofffindung als auch zur Erkennung und Charakterisierung möglicher toxikologisch relevanter Wirkungen dienen.

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Metadaten
Verfasserangaben:Daniela Seng
URN (Permalink):urn:nbn:de:bsz:386-kluedo-10397
Betreuer:G. Eisenbrand
Dokumentart:Dissertation
Sprache der Veröffentlichung:Deutsch
Jahr der Fertigstellung:2000
Jahr der Veröffentlichung:2000
Veröffentlichende Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Titel verleihende Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Datum der Annahme der Abschlussarbeit:15.05.2000
Datum der Publikation (Server):25.05.2000
Fachbereiche / Organisatorische Einheiten:Fachbereich Chemie
DDC-Sachgruppen:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie
Lizenz (Deutsch):Standard gemäß KLUEDO-Leitlinien vor dem 27.05.2011