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Comparative genome analysis of Streptococcus pneumoniae and its close relatives

  • The number of sequenced genomes increases rapidly due to the development of faster, better and new technologies. Thus, there is a great interest in automation, and standardization of the subsequent processing and analysis stages of the generated enormous amount of data. In the current work, genomes of clones, strains and species of Streptococcus were compared, which were sequenced, annotated and analysed with several technologies and methods. For sequencing, the 454- and Illumina-technology were used. The assembly of the genomes mainly was performed by the gsAssembler (Newbler) of Roche, the annotation was performed by the annotation pipeline RAST, the transfer tool RATT or manually. Concerning analysis, sets of deduced proteins of several genomes were compared to each other and common components, the so-called core-genome, of the used genomes of one or closely related species determined. Detailed comparative analysis was performed for the genomes of isolates of two clones to gather single nucleotide variants (SNV) within genes. This work focusses on the pathogenic organism Streptococcus pneumoniae. This species is a paradigm for transformability, virulence and pathogenicity as well as resistance mechanisms against antibiotics. Its close relatives S. mitis, S. pseudopneumoniae and S. oralis have no pathogenicity potential as high as S. pneumoniae available and are thus of high interest to understand the evolution of S. pneumoniae. Strains of two S. pneumoniae clones were chosen. One is the ST10523 clone, which is associated with patients with cystic fibrosis and is characterized by long-term persistence. This clone is lacking an active hyaluronidase, which is one of the main virulence factors. The lack of two phage clusters possibly contributed to the long persistence in the human host. The clone ST226 shows a high penicillin resistance but interestingly one strain is sensitive against penicillin. Here it could be seen that the penicillin resistance mainly arose from the presence of mosaic-PBPs, while special alleles of MurM and CiaH - both genes are associated with penicillin-resistance – were present in resistant and sensitive strains as well. Penicillin resistance of S. pneumoniae is the result of horizontal gene transfer, where DNA of closely related species, mainly S. mitis or S. oralis, served as donor. The transfer of DNA from the high-level penicillin-resistant strain S. oralis Uo5 to the sensitive strain S. pneumoniae R6 was intentioned to reveal the amount of transferred DNA and whether it is possible to reach the high resistance level of S. oralis Uo5. Altogether, about 19kb of S. oralis DNA were transferred after three successive transformation steps, about 10-fold less than during transfer from S. mitis, which is more closely related to S. pneumoniae, as donor. MurE was identified as new resistance determinant. Since the resistance level of the donor strain could not be reached, it is assumed, that further unknown factors are present which contribute to penicillin resistance. The comparison of S. pneumoniae and its close relatives was performed using deduced protein sequences. 1.041 homologous proteins are common to the four complete genomes of S. pneumoniae R6, S. pseudopneumoniae IS7493, S. mitis B6 and S. oralis Uo5. Most of the virulence and pathogenicity factors described for S. pneumoniae could also be found in commensal species. These observations were confirmed by further investigations by Kilian et al. (Kilian, et al., 2019). After adding 26 complete S. pneumoniae genomes to the analysis, only 104 gene products could be identified as specific for this species. Investigations of a larger number of related streptococci, which were isolated from human and several primates, confirmed the presence of most of the virulence factors of human pneumococci in S. oralis and S. mitis strains from primates. While NanBC is common among S. pneumoniae and is missing in all S. oralis, all S. oralis contain a ß-N-acetyl-hexosaminidase which vice versa is missing in S. pneumoniae. The occurrence of S. oralis also in free-living chimpanzees suggests the assumption, that this species is part of the commensal flora of these Old-World monkeys unlike S. pneumoniae which has evolved with its human host. Compared to S. pneumoniae, S. oralis shows an amazing variability in factors important for biosynthesis of peptidoglycan and teichoic acid (PBP, MurMN, lic-cluster). Some streptococci contain a second PGP3 homologue. Additional analyses with further isolates, especially of wild animals, are necessary to determine host-specific components.
  • Durch immer bessere, schnellere und auch neue Technologien steigt die Zahl der Genomsequenzierungen stetig und rapide an. Folglich besteht ein hoher Anspruch auf Automatisierung und Vereinheitlichung der nachgelagerten Verarbeitungs- und Analyseschritte der entstehenden enormen Datenmengen. In der vorliegenden Arbeit werden Genome verschiedener Streptokokken-Klone, -Stämme und -Arten miteinander verglichen, die mit verschiedenen Techniken und Methoden sequenziert, annotiert und analysiert wurden. Für die Sequenzierung wurden 454- und Illumina-Technologie verwendet. Die Assemblierung der Genome erfolgte hauptsächlich mit dem gsAssembler (Newbler) von Roche, die Annotation mit Hilfe der Annotations-Pipeline RAST, dem Transfertool RATT oder manuell. Hinsichtlich der Analysen wurden Sätze abgeleiteter Proteine verschiedener Genome miteinander verglichen und gemeinsame Komponenten, das sogenannte Core-Genom, der verwendeten Genome einer oder eng verwandter Spezies ermittelt. Für die Genome von Stämmen zweier Klone wurden detaillierte vergleichende Analysen zur Erfassung von „single nucleotide variants“ (SNV) in den Genen durchgeführt. Fokus dieser Arbeit ist der pathogene Organismus Streptococcus pneumoniae. Dieser ist ein Musterbeispiel für Transformierbarkeit, aber auch für Virulenz, Pathogenität und Resistenzmechanismen gegen Antibiotika. Seine nächsten Verwandten, S. mitis, S. pseudopneumoniae und S. oralis, besitzen nicht so ein hohes Pathogenitätspotential wie S. pneumoniae und sind daher von großem Interesse, um die Evolution von S. pneumoniae zu verstehen. Stämme zweier S. pneumoniae-Klone wurden herausgegriffen. In einem Fall handelt es sich um einen Klon ST10523, der außergewöhnlich lange mit Patienten assoziiert war, die an cystischer Fibrose erkrankt waren. Diesem Klon fehlte offenbar eine aktive Hyaluronidase, einer der Hauptvirulenzfaktoren. Das Fehlen zweier Prophagencluster trug möglicherweise ebenfalls zu dem langen Verbleiben im menschlichen Wirt bei. Der Klon ST226 weist eine hohe Penizillinresistenz auf, ein Stamm ist allerdings interessanterweise sensitiv gegenüber Penicillin. Hier zeigte sich, dass die Penizillinresistenz hauptsächlich vom Vorhandensein von Mosaik-PBPs herrührte, wobei spezielle Allele von MurM und CiaH, beides Gene, die mit Penizillinresistenz in Verbindung gebracht werden, sowohl in resistenten als auch in dem sensitiven Stamm vorhanden waren. Penizillinresistenz von S. pneumoniae ist das Resultat von inter-spezies Gentransfer, wobei DNS nahe verwandter Streptokokken, vor allem von S. mitis aber auch S. oralis, als Donor dient. Der Transfer von DNS vom hochgradig penizillinresistenten S. oralis-Stamm Uo5 auf den sensitiven S. pneumoniae-Stramm R6 sollte ermitteln, welche Mengen DNS dabei übertragen werden können und ob es möglich ist, das hohe Resistenzniveau des S. oralis-Stammes zu erreichen. Insgesamt wurde nach drei Transformationsschritten fast 19 kb S. oralis DNS übertragen, ungefähr 10fach weniger als im Falle von dem mit S. pneumoniae näher verwandten S. mitis als Donor. MurE wurde als neue Resistenzdeterminante identifiziert. Da das Resistenzniveau des Donorstammes in dem Rezipienten nicht erreicht werden konnte, besteht die Vermutung, dass es noch weitere, bislang unbekannte, Faktoren gibt, die zur Penizillinresistenz beitragen. Die Vergleiche von S. pneumoniae und seinen nahen Verwandten wurden auf Basis der abgeleiteten Proteinsequenzen durchgeführt. Den vier Genomen von S. pneumoniae R6, S. pseudopneumoniae IS7493, S. mitis B6 und S. oralis Uo5, die alle vollständig vorliegen, sind 1.041 homologe Proteine gemeinsam. Die meisten Virulenz- und Pathogenitätsfaktoren, die für S. pneumoniae beschrieben wurden, konnten auch in den kommensalen Spezies gefunden werden. Diese Beobachtungen wurden später durch Kilian et al. (Kilian, et al., 2019) durch weitere Untersuchungen bestätigt. Bei Hinzuziehen von allen 26 kompletten S. pneumoniae Genomen konnten nur 104 Genprodukte spezifisch für diese Spezies identifiziert werden. Untersuchungen einer größeren Anzahl verwandter Streptokokken, die aus Menschen und verschiedenen Primaten isoliert wurden, bestätigten, dass die meisten Virulenzfaktoren, die in menschlichen Pneumokokken vorhanden sind, auch in S. mitis und S. oralis aus Primaten vorkommen. Während in S. pneumoniae häufig NanBC vorkommt, die in allen S. oralis fehlt, besaßen alle S. oralis eine ß-N-Acetyl-Hexosaminidase, die wiederum in S. pneumoniae fehlt. Die Beobachtung, dass S. oralis auch in freilebenden Schimpansen gefunden werden konnte, legt die Vermutung nahe, dass diese Spezies Teil der kommensalen Flora dieser Altweltaffen ist und nicht, wie S. pneumoniae, mit dem Menschen evolviert ist. Verglichen mit S. pneumoniae zeigten S. oralis eine erstaunliche Variabilität in Faktoren, die für die Biosynthese von Peptidoglycan und Teichonsäure verantwortlich sind (PBP, MurMN und das lic-Cluster). Einige Streptokokken wiesen ein zweites Homolog von PBP3 auf. Weiterführende Studien mit mehr Isolaten, vor allem von von S. mitis aber auch S. oralis, als Donor dient. Der Transfer von DNS vom hochgradig penizillinresistenten S. oralis-Stamm Uo5 auf den sensitiven S. pneumoniae-Stramm R6 sollte ermitteln, welche Mengen DNS dabei übertragen werden können und ob es möglich ist, das hohe Resistenzniveau des S. oralis-Stammes zu erreichen. Insgesamt wurde nach drei Transformationsschritten fast 19 kb S. oralis DNS übertragen, ungefähr 10fach weniger als im Falle von dem mit S. pneumoniae näher verwandten S. mitis als Donor. MurE wurde als neue Resistenzdeterminante identifiziert. Da das Resistenzniveau des Donorstammes in dem Rezipienten nicht erreicht werden konnte, besteht die Vermutung, dass es noch weitere, bislang unbekannte, Faktoren gibt, die zur Penizillinresistenz beitragen. Die Vergleiche von S. pneumoniae und seinen nahen Verwandten wurden auf Basis der abgeleiteten Proteinsequenzen durchgeführt. Den vier Genomen von S. pneumoniae R6, S. pseudopneumoniae IS7493, S. mitis B6 und S. oralis Uo5, die alle vollständig vorliegen, sind 1.041 homologe Proteine gemeinsam. Die meisten Virulenz- und Pathogenitätsfaktoren, die für S. pneumoniae beschrieben wurden, konnten auch in den kommensalen Spezies gefunden werden. Diese Beobachtungen wurden später durch Kilian et al. (Kilian, et al., 2019) durch weitere Untersuchungen bestätigt. Bei Hinzuziehen von allen 26 kompletten S. pneumoniae Genomen konnten nur 104 Genprodukte spezifisch für diese Spezies identifiziert werden. Untersuchungen einer größeren Anzahl verwandter Streptokokken, die aus Menschen und verschiedenen Primaten isoliert wurden, bestätigten, dass die meisten Virulenzfaktoren, die in menschlichen Pneumokokken vorhanden sind, auch in S. mitis und S. oralis aus Primaten vorkommen. Während in S. pneumoniae häufig NanBC vorkommt, die in allen S. oralis fehlt, besaßen alle S. oralis eine ß-N-Acetyl-Hexosaminidase, die wiederum in S. pneumoniae fehlt. Die Beobachtung, dass S. oralis auch in freilebenden Schimpansen gefunden werden konnte, legt die Vermutung nahe, dass diese Spezies Teil der kommensalen Flora dieser Altweltaffen ist und nicht, wie S. pneumoniae, mit dem Menschen evolviert ist. Verglichen mit S. pneumoniae zeigten S. oralis eine erstaunliche Variabilität in Faktoren, die für die Biosynthese von Peptidoglycan und Teichonsäure verantwortlich sind (PBP, MurMN und das lic-Cluster). Einige Streptokokken wiesen ein zweites Homolog von PBP3 auf. Weiterführende Studien mit mehr Isolaten, vor allem von freilebenden Tieren, sind notwendig, um wirtsspezifische Komponenten aufzuzeigen.

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Metadaten
Author:Martin Rieger
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-61076
Advisor:Regine Hakenbeck
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:English
Publication Date:2020/10/09
Year of Publication:2020
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2020/09/04
Date of the Publication (Server):2020/10/12
Tag:Evolution; Genome analysis; Horizontal gene transfer; Mutation; Pathogen; Penicillin-resistance; Streptococcus; Streptococcus pneumoniae; Transformation; Virulence
Number of page:209
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Biologie
DDC-Cassification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften, Biologie
Licence (German):Creative Commons 4.0 - Namensnennung, nicht kommerziell, keine Bearbeitung (CC BY-NC-ND 4.0)