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Spektroskopische und elektrochemische Studien der neuartigen Clusterkoordination in Proteinen mit C-terminaler Thioredoxin-Ferredoxin-Domäne

  • Eisen-Schwefel-Cluster bilden eine Klasse der vielseitigsten anorganischen Cofaktoren in der Natur und sind in allen Domänen des Lebens zu finden. Sie erfüllen vielfältige Aufgaben in verschiedensten Bereichen, wie beispielsweise Elektronentransport, regulatorische Funktionen oder enzymatische Aktivität. Da verschiedene Krankheiten auf Defekte von Eisen-Schwefel-Proteinen oder deren Biogenese zurückgeführt werden können, ist es von größtem Interesse unbekannte Fe/S Proteine zu charakterisieren und ihre Wirkungsweisen zu erforschen. In den beiden häufigsten Clustertypen (der rhombische [2Fe-2S]- und der kubische [4Fe 4S] Cluster) werden zur Koordination der Eisenionen neben anorganischen Sulfidionen in der Regel vier Cysteine des Proteins verwendet. Daneben existieren jedoch auch Proteine, in denen andere Aminosäuren als Liganden fungieren. Für das Rieske-Protein, welches in dieser Arbeit als Referenzprotein fungierte, wurden Mössbauerspektren bei drei passenden pH-Werten aufgenommen. Dadurch konnten zum ersten Mal die drei verschiedenen Zustände des Clusters mit diprotonierten, monoprotonierten bzw. deprotonierten Histidinen mittels Mössbauerspektroskopie untersucht und die entsprechenden Parameter ermittelt werden. Im Hauptteil dieser Arbeit wurden die beiden weitgehend unerforschten Proteine Apd1 und Aim32 aus Saccharomyces cerevisiae kloniert, heterolog in E. coli exprimiert und isoliert. Durch eine anschließende Charakterisierung mittels UV/Vis-, ESR- und Mössbauerspektroskopie konnte der enthaltene [2Fe 2S] Cluster identifiziert und eine Koordination durch zwei Cysteine und zwei Histidine festgestellt werden, wobei die Proteine keine Rieske-Faltung besitzen. Nach Entdeckung des hochkonservierten HXGGH-Motivs, welches an ähnlicher Stelle zum dritten und vierten Cystein in der Primärstruktur von TLF´s (thioredoxin-like ferredoxins) vorliegt, wurden Mutationen dieser Histidine durchgeführt. In Untersuchungen an diesen Mutanten konnten Änderungen in den UV/Vis , ESR- und Mössbauerspektren der variierten Fe/S Cluster beobachtet werden. Bei der pKS-Wert-Bestimmung wurde nach jeder Mutation der vorhandenen Histidine zu Cysteinen, jeweils ein (De-)Protonierungsschritt weniger detektiert. Ebenso zeigten die Mutanten niedrigere Redoxpotentiale als der Wildtyp, dessen Redoxpotential pH-abhängig ist. Es handelt sich hierbei also um eine neuartige Klasse von Proteinen, die eine C-terminale Domäne mit einer Faltung ähnlich zu TLF´s besitzt, die aber gleichzeitig ein Rieske-artiges Zentrum beinhaltet. Eine Funktion bei Elektronentransfers liegt deshalb nahe, allerdings ist dazu noch nichts genaueres bekannt. Die Identifikation der genauen Wirkweise sowie der Reaktionspartner der beiden Proteine ist also weiterhin ein spannendes Forschungsgebiet. Ebenso wird der Nachweis über die Art der Bindung der Histidine durch eine Kristallstruktur wichtige Erkenntnisse über die Proteinklasse liefern.

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Metadaten
Author:Kathrin Stegmaier
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-50867
Advisor:Antonio Pierik
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Publication Date:2017/12/05
Year of Publication:2017
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2017/11/16
Date of the Publication (Server):2019/07/30
Number of page:XIII, 143
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie
Licence (German):Creative Commons 4.0 - Namensnennung, nicht kommerziell, keine Bearbeitung (CC BY-NC-ND 4.0)