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Produktion von pharmakologischen Sekundärmetabolite - Am Beispiel von mikrobiellen β-Lactam-Antibiotika und pflanzlichen Triterpenen

  • Durch das Entstehen von neuen Infektionskrankheiten und das Auftreten von Resistenzen können bisher verwendete Medikamente ihren pharmazeutischen Nutzen verlieren. Daher ist eine konstante Weiterentwicklung von bioaktiven Pharmazeutika lebensrettend. Viele pflanzli-che und mikrobielle Sekundärmetabolite besitzen gesundheitsfördernde Wirkungen und kön-nen als Ressourcen für die Entwicklung neuer Arzneimittel herangezogen werden. Da Pflan-zen und Mikroorganismen ein sehr umfangreiches Repertoire an pharmazeutisch-interessanten Intermediaten besitzen, soll im Rahmen dieser Arbeit die Produktbildung von pflanzlichen und mikrobiellen Sekundärmetaboliten vorgestellt werden, die für weiterführende medizinische Studien von Interesse sind. Die in dieser Arbeit präsentierten mikrobiellen Sekundärmetabolite sind β-Lactam Antibiotika der Gruppe der OA-6129 und besitzen antibakterielle Eigenschaften gegen grampositive als auch gramnegative Mikroorganismen. Durch die Kultivierung des filamentösen Actinobakteri-ums Streptomyces fulvoviridis A933 17M9 1501 können diese sehr wirksamen Antibiotika gebildet werden. Für eine erfolgreiche Produktbildung wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zweistufiger Prozess im Bioreaktor etabliert, der sich über einen Zeitraum von neun Tagen erstreckt. Durch Optimierung und Variation des Mediums, sowie durch die Veränderung der Rührergeometrie, kann die maximale Antibiotikakonzentration um 385 % gesteigert werden. Neben der zu optimierenden Produktbildung ist auch die Stabilität der Antibiotika im wässrigen Milieu von Interesse. Die Untersuchungen erfolgten am Produktanalogon Imipenem. Es zeig-te sich, dass durch Interaktionen der Imipenemmoleküle der Zerfall mit steigender Antibiotik-akonzentration beschleunigt wird. Ein dazugehöriger Zerfallsweg des Imipenems in deionisie-rem Wasser bei pH 7 konnte durch die Auswertung der HPLC und Massenspektrometrie-Analytik beschrieben werden. Bioaktive Zerfallsprodukte, wie das sehr aktive β-Lactam Thienamycin, können aus dieser Zerfallsreaktion resultieren. Auch im Fermenta¬tionsmedium kann ein konzentrationsabhängiger Zerfall nachgewiesen werden, was für eine wirtschaftli-che, fermentative Herstellung problematisch wäre. Durch die Verwendung von Morpholino-sulfonsäurepuffern ist eine Stabilisierung des Antibiotikums im Wasser und im Fermentati-onsmedium realisierbar. Eine Steigerung der Halbwertszeit von über dem 10fachen gegen-über einer reinen Imipenemlösung im Wasser kann durch die Verwendung dieser Puffersub-stanzen erzielt werden. Bei den zweiten, in dieser Arbeit behandelten Sekundärmetaboliten, handelt es sich um die pflanzlichen Triterpene Oleanol- und Ursolsäure, von denen antibakterielle, antivirale, entzün-dungshemmende und Krebs vorbeugende Aktivitäten bekannt sind. Neben anderen Pflanzen bilden Spezies von Salbei und Basilikum diese interessanten Sekundärmetabolite. Da bei ei-ner Freilandkultivierung die Produktkonzentrationen jährlichen Schwankungen durch abioti-schen und biotischen Faktoren unterliegen, kann durch eine in situ Kultivierung eine reprodu-zierbare Produktbildung erzielt werden. Im Zuge der Arbeit wurden Kalluskulturen von Salvia officinalis und Ocimum basilicum in verschiedenen Reaktortypen und mit verschiedenen Pro-zessstrategien eingesetzt und betreffend ihrer Produktbildung untersucht. Eine Oleanol- und Ursolsäurebildung durch eine Kalluskultur von Ocimum basilicum konnte durch diese Arbeit zum ersten Mal präsentiert werden. Im Vergleich zu Kultivierungen in Erlenmeyerkolben fördert eine Kultivierung im Wavebag-Reaktor das Wachstum und die Produktbildung, sodass die maximale Triterpenkonzentration um 210 % gesteigert werden kann. Durch Variation der batch-Prozessstrategie in ein repea-ted-batch-Verfahren kann eine signifikante Steigerung der Oleanolsäurebildung um das 16fache und der Ursolsäurebildung um das 35fache erzielt werden. Es wird angenommen, dass auftretende Substratlimitierung zu einer Steigerung der Produktbildung führt. Durch eine nachfolgende Biotransformation ist es möglich, die beiden Triterpene zu modifizie-ren. Eine Derivatisierung kann neben einer Verbesserung der Wasserlöslichkeit der Triterpene auch in einer Erhöhung der pharmazeutisch-interessanten Aktivitäten resultieren. Aus diesem Grunde wurden neun Organismen betreffend ihrer biokatalytischen Aktivität untersucht. Mit-tels des Actinobakteriums Nocardia iowensis werden die Oleanol- und Ursolsäure zunächst in ihre korrespondierenden Methylester transformiert. Des Weiteren entstehen bei der Biotrans-formation von Oleanolsäure zwei weitere, bisher unbekannter Derivate, welche durch HPLC, HPLC-ESI-MS und HPLC-1H-NMR charakterisiert werden konnten. Anhand dieser Resultate kann ein neuer Biosyntheseweg für eine Oleanolsäuretransformation mittels Nocardia iowen-sis beschrieben werden. Um die Abtrennung der Biotransformationskultur von Medium zu vereinfachen und die Wirt-schaftlichkeit zu fördern, kann N. iowensis in Natriumalginat immobilisiert werden. Während kein signifikanter Unterschied zwischen immobilisierten und freien Bakterienzellen betreffend der Substrataufnahme detektiert wird, wird durch die Immobilisierung die Produktbildung re-primiert. Dabei besitzt die Matrixdichte, die aus der Behandlung der Natriumalginatpartikel mit der Calciumchloridlösung resultiert, einen entscheidenden Einfluss auf die Biotransformati-onseffizienz. Auch eine Zusammenführung von Pflanzenzellkultivierung und Biotransformation in einem Gesamtprozess wurde im Rahmen dieser Arbeit etabliert. Durch den direkten Einsatz der immobilisierten Biotransformationskultur im verdünnten Zelllysat umgeht man eine Aufarbei-tung der Produkttriterpene aus dem Pflanzenzelllysat, was die Wirtschaftlichkeit des Prozes-ses erheblich verbessert. Bis zu einem Mischverhältnis von 50 % Referenzmedium und Zell-lysat kann keine Inhibierung oder Reprimierung der Biotransformation durch vorhandene Pflanzenzellbestandteile, wie z. B. Phenolen, detektiert werden.
  • With the emergence of new infectious diseases and new resistance, applied drugs lose their pharmaceutical benefit. Therefore, a permanent development of bioactive pharmaceuticals is life saving. As a source of a development of new drugs, many plants and microbial secondary metabolites have several health beneficial effects. Because plants and microorganisms have a very extensive repertoire of pharmaceutically interesting intermediates, a product formation on basis of two groups of secondary metabolites, which are of interest for leading medical studies, will be presented in this work. The first presented secondary metabolites are β-lactam antibiotics of the group of OA-6129, which have antibacterial properties against gram-positive and gram-negative microorganisms. These very effective antibiotics can be produced by cultivating the filamentous actinobacteria Streptomyces fulvoviridis A933 17M9 1501. In this work, a two-step cultivation process was established over a period of nine days. The maximum antibiotic concentration was improved on 385 % by optimizing and variation of the culture media and variation of the stirrer geome-try. Besides, of the product formation the stability of antibiotics in an aqueous milieu is of particular interest. The tests were performed with the antibiotic analogue Imipenem. Interac-tions between molecules of Imipenem lead to a decay. Increasing the antibiotic concentration a decay will be accelerated. A corresponding decay pathway of Imipenem in water was de-termined by HPLC and mass spectrometry analysis. Bioactive products such as the very ac-tive β lactam Thienamycin can result from this decay. In addition, a concentration-dependent decay in the fermentation broth can be detected, which might be problematic for a produc-tion. A stabilization of Imipenem in water and in the fermentation broth can be implemented by using morpholino sulfonic acid buffers. These buffering agents can achieve an increase of the half-life by 10 times compared with a pure Imipenem solution in water. The second source of secondary metabolites dealt with in this in this work are the plant-derived triterpenes oleanolic and ursolic acid, which are known for their antibacterial, antiviral, anti-inflammatory and antitumor activities. Among other plant species, sage and basil are able to produce these interesting secondary metabolites. Because the production concentration of triterpenes by field-grown plants is liable to annual fluctuations by abiotic and biotic factors, a reproducible product formation can be achieved by an in situ cultivation. In this work callus cultures of Salvia officinalis sp. and Ocimum basilicum were used in various reactor types and with various process strategies and investigated for their product formation. The formation of ursolic and oleanolic acid by callus cultures of Ocimum basilicum is presented by this work for the first time. In comparison to a cultivation in shake flasks, a cultivation in a Wavebag bioreactor promotes the growth and product formation, so the final triterpene concentration can be increased by 210 %. Through varying the batch process strategy to a repeated-batch process a 16-fold increase of oleanolic acid and 35-fold increase of ursolic acid concentrations were detected. It is assumed that a substrate limitation resulted in an increase of productivity. By a subsequent biotransformation, it is possible to modify triterpenes acids. A modification can result in an improvement of water solubility of the triterpenes and an increase of the pharmaceutical-interesting activities. Therefore, nine microorganisms were tested for their biocatalytic activity. The actinobacteria Nocardia iowensis foremost transformed oleanolic and ursolic acid to their corresponding methyl esters. Furthermore, a biotransformation of oleanolic acid resulted in two unknown derivates, which were characterized by HPLC, HPLC-ESI-MS and HPLC-1H-NMR. Based on these results, a new biosynthetic pathway of oleanolic acid by Nocardia iowensis is proposed. To simplify a separation of the biotransformation culture and media and to improve economic efficiency, an immobilization of N. iowensis in sodium alginate was established. The sub-strate-uptake of free and immobilized cells was similar, whereas the relative concentration of the products of the immobilized cells was repressed by the immobilization. It could be shown that the matrix density, which resulted by treating sodium alginate with a calcium chloride so-lution, has a large influence on a loss of productivity. A pooling of plant cell cultivation and biotransformation into a single process was investigated in this work, too. Through a direct use of a immobilized culture in the diluted cell lysate a puri-fication of the products from the plant cell lysate can be avoided, which improve the econom-ic viability of the process. Up to a mixing ratio of 50 % of the reference medium and the cell lysate no inhibition or repression by existing plant constituents, such as phenols, are detected.

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Metadaten
Author:Benjamin Ludwig
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-39812
Advisor:Roland Ulber
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Publication Date:2015/02/01
Year of Publication:2015
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2014/11/25
Date of the Publication (Server):2015/02/03
Tag:Biotransformation; Fermentation; Nocardia; Pflanzenzellkultivierung; Streptomyces; Triterpene; beta-Lactame
Number of page:IV, 221
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Maschinenbau und Verfahrenstechnik
DDC-Cassification:6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 620 Ingenieurwissenschaften und Maschinenbau
Licence (German):Standard gemäß KLUEDO-Leitlinien vom 28.10.2014