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Function of two redox sensing kinases from the methanogenic archaeon Methanosarcina acetivorans

  • MsmS is a heme-based redox sensor kinase in Methanosarcina acetivorans consisting of alternating PAS and GAF domains connected to a C-terminal kinase domain. In addition to MsmS, M. acetivorans possesses a second kinase, MA0863 with high sequence similarity. Interestingly, MA0863 possesses an amber codon in its second GAF domain, encoding for the amino acid pyrrolysine. Thus far, no function of this residue has been resolved. In order to examine the heme iron coordination in both proteins, an improved method for the production of heme proteins was established using the Escherichia coli strain Nissle 1917. This method enables the complete reconstitution of a recombinant hemoprotein during protein production, thereby resulting in a native heme coordination. Analysis of the full-length MsmS and MA0863 confirmed a covalently bound heme cofactor, which is connected to one conserved cysteine residue in each protein. In order to identify the coordinating amino acid residues of the heme iron, UV/vis spectra of different variants were measured. These studies revealed His702 in MsmS and the corresponding His666 in MA0863 as the proximal heme ligands. MsmS has previously been described as a heme-based redox sensor. In order to examine whether the same is true for MA0863, redox dependent kinase assays were performed. MA0863 indeed displays redox dependent autophosphorylation activity, which is independent of heme ligands and only observed under oxidizing conditions. Interestingly, autophosphorylation was shown to be independent of the heme cofactor but rather relies on thiol oxidation. Therefore, MA0863 was renamed in RdmS (redox dependent methyltransferase-associated sensor). In order to identify the phosphorylation site of RdmS, thin layer chromatography was performed identifying a tyrosine as the putative phosphorylation site. This observation is in agreement with the lack of a so-called H-box in typical histidine kinases. Due to their genomic localization, MsmS and RdmS were postulated to form two-component systems (TCS) with vicinal encoded regulator proteins MsrG and MsrF. Therefore, protein-protein interaction studies using the bacterial adenylate two hybrid system were performed suggesting an interaction of RdmS and MsmS with the three regulators MsrG/F/C. Due to these multiple interactions these signal transduction pathways should rather be considered multicomponent system instead of two component systems.
  • MsmS ist eine Häm-basierte Redox-Sensorkinase aus Methanosarcina acetivorans. Sie besteht aus alternierenden PAS und GAF Domänen und einer C-terminalen Kinasedomäne. Zusätzlich zu MsmS, besitzt M. acetivorans eine zweite Kinase, MA0863, mit einer hohen Sequenzähnlichkeit zu MsmS. Interessanterweise enthält MA0863 ein Amber-Codon in der zweiten GAF Domäne, das für die Aminosäure Pyrrolysin kodiert. Bisher ist keine Funktion für diesen Aminosäurerest bekannt. Um die Koordination des Hämeisens in beiden Proteinen zu untersuchen, wurde eine verbesserte Methode zur Produktion von Hämproteinen entwickelt. Für diese wurde der Escherichia coli Stamm Nissle 1917 verwendet, der die vollständige Rekonstitution des rekombinanten Hämproteins während der Proteinproduktion ermöglicht. Dadurch kann eine native Hämkoordination erhalten werden. Analysen von MsmS und MA0863 als Volllängen-Protein bestätigten einen kovalent gebundenen Hämkofaktor, der über einen konservierten Cysteinrest in jedem Protein gebunden ist. Um die koordinierenden Aminosäurereste zu identifizieren, wurden UV/vis Spektren verschiedener Varianten gemessen. Diese ergaben, dass H702 in MsmS und das entsprechende H666 in MA0863 als proximale Hämliganden dienen. Im Vorfeld wurde MsmS als Häm-basierter Redoxsensor beschrieben. Um zu untersuchen, ob dies auch auf MA0863 zutrifft, wurden redox-abhängige Kinase-Assays durchgeführt. So konnte für MA0863 ebenfalls eine redox-abhängige Autophosphorylierungs-Aktivität festgestellt werden, die unabhängig von Hämliganden ist und nur unter oxidierenden Bedingungen auftritt. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass die Autophosphorylierung unabhängig vom Hämkofaktor ist, sondern auf die Oxidation von Thiolen zurückgeführt werden kann. Daher wurde MA0863 in RdmS (Redox dependent methyltransferase-associated Sensor) umbenannt. Um die Phosphorylierungsstelle in RdmS zu identifizieren, wurde eine Dünnschicht-Chromatographie durchgeführt, die Tyrosin als putative Phosphorylierungsstelle identifizierte. Diese Beobachtung steht im Einklang mit der nicht vorhandenen H-box in typischen Histidinkinasen. Auf Grund der genomischen Lokalisation wurde für MsmS und RdmS postuliert, dass sie Zwei-Komponenten Systeme (ZWS) mit den in unmittelbarerNähe kodierten Regulatorproteinen MsrG und MsrF bilden. Daher wurden Protein-Protein Interaktions-Analysen mittels dem Bacterial Two-Hybrid-System durchgeführt, die auf eine Interaktion von MsmS und RdmS mit den drei Regulatoren MsrG/F/C hindeuten. Infolge dieser mehrfachen Interaktionen dieser Signaltransduktionssysteme sollten sie eher als Multikomponenten System bezeichnet werden und nicht als Zwei-Komponenten System.

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Metadaten
Author:Kerstin FiegeORCiD
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-55919
Advisor:Nicole Frankenberg-Dinkel
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:English
Publication Date:2019/04/11
Year of Publication:2019
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2019/03/28
Date of the Publication (Server):2019/04/12
Number of page:V, 130
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Biologie
DDC-Cassification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften, Biologie
Licence (German):Creative Commons 4.0 - Namensnennung, nicht kommerziell, keine Bearbeitung (CC BY-NC-ND 4.0)