UNIVERSITÄTSBIBLIOTHEK

Towards standardized operating procedures for eDNA-based monitoring of marine coastal ecosystems

  • Marine coastal ecosystems are exposed to a variety of anthropogenic impacts, which often manifest themselves in the pollution of the surrounding ecosystem. Especially on densely populated coasts or in regions heavily used for aquaculture, changes in the natural marine habitat can be observed. In order to protect nature and thus its ecosystem services for humans, more and more environmental protection laws are coming into force. Exemplary, operators of facilities known to contribute to pollution are obliged to regularly monitor the condition of the surrounding environment. The purpose of such so-called compliance monitoring is to determine whether the prescribed regulations are being followed. The traditional routine involves sampling by ship, during which sediment samples are taken from the seabed below the aquaculture cages and all macrofauna organisms found, such as mussels or worms, are taxonomically determined and quantified by experts. Based on the community of organisms the ecological status of the sample can then be inferred. Since this method is very labor- and time-consuming, a reorientation of the scientific community towards alternative monitoring methods is currently taking place. A bacteria-based eDNA (environmental DNA) metabarcoding system in particular has proven to be a suitable monitoring tool. With this molecular method, the composition of the benthic bacterial community is determined using high-throughput sequencing. The great advantage of this method is that bacteria, due to their short generation times, react rapidly to various environmental influences. The composition of this community can then be used to infer the ecological status of the sample under investigation via sequencing without the need for laborious enumeration and identification of organisms. Additionally, sequencing costs are more and more decreasing, proposing eDNA metabarcoding-based monitoring as a faster and cheaper alternative to traditional monitoring. In order to implement the method in legislation in the long term, standard protocols need to be developed. Once these are sufficiently validated, the novel methodology can be incorporated into regulations to support or even replace traditional monitoring. However, some steps of the eDNA metabarcoding method, from sampling to ecosystem assessment, are not yet sufficiently standardized, which is why the development of this work was necessary. Since there is no consensus in the scientific community on (i) the preservation of environmental samples during transport, (ii) the reproducibility of ecosystem assessment among different laboratories, (iii) the most appropriate bioinformatic method for ecosystem assessment, and (iv) the minimum sequencing depth required to determine ecosystem status, these sub-steps were investigated. It was found that the most common methods currently used to preserve samples during transport had no discernible effect on the final ecosystem assessment. Furthermore, sample processing in independent laboratories allowed the same ecological interpretations based on the bacterial community, which resulted in concordant ecosystem assessments among laboratories. This indicates the overall reproducibility of the eDNA metabarcoding-based method, thus enabling its implementation in standard protocols. Furthermore, it was shown that corresponding ecosystem assessments can be obtained with the currently used methods for determining ecological status based on eDNA data. Critical to predictive accuracy is not the method itself, but a sufficient number of samples that accounts for the natural spatial and temporal variability of bacterial communities. It was demonstrated that a very shallow sequencing depth per sample can be sufficient to use machine learning to prediction the ecological status of the environmental sample. The quality of this classifications did not depend on the sequencing depth as assumed but was determined by the separability of individual categories. The results and recommendations of this work contribute directly to the standardization of ecological assessment of nearshore marine ecosystems. By establishing these standard protocols, it will be possible to integrate the eDNA metabarcoding-based method for monitoring compliance of coastal marine ecosystems into legislative regulations in the future.
  • Marine Küstenökosysteme sind einer Vielzahl von durch den Menschen verursachten Einflüssen ausgesetzt. Diese äußern sich häufig in einer Verschmutzung des umgebenden Ökosystems. Vor allem an dicht besiedelten Küsten oder in stark für die Aquakultur genutzten Regionen ist eine Veränderung des natürlichen Lebensraums zu beobachten. Um die Natur und damit ihre Ökosystemleistungen für den Menschen zu schützen, treten immer mehr Naturschutzgesetze in Kraft. Beispielsweise sind Betreiber von Aquakulturanlagen dazu verpflichtet, den Zustand der Umgebung regelmäßig zu prüfen. Dieses so genannte Compliance Monitoring hat den Zweck, festzustellen, ob die geltenden Vorschriften eingehalten werden. Die traditionelle Art dieser Überwachung ist sehr arbeits- und zeitintensiv. Mit Hilfe eines Schiffes werden Sedimentproben unterhalb der Aquakulturkäfige entnommen und alle darin vorkommenden Makrofauna-Organismen, wie Muscheln oder Würmer, von Experten bestimmt und quantifiziert. Anhand der Organismengemeinschaft kann dann auf den ökologischen Zustand der Probe geschlossen werden. Da dieses Verfahren sehr zeitaufwendig ist, findet derzeit eine Umorientierung der wissenschaftlichen Gemeinschaft hin zu alternativen Überwachungsmethoden statt. In der Zwischenzeit hat sich ein auf bakterieller DNA basierendes eDNA (engl. environmental DNA, Umwelt-DNA) Metabarcoding-System als besonders nützliches Instrument erwiesen. Bei dieser molekularen Methode kann die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft mit Hilfe von Hochdurchsatz-Sequenzierung bestimmt werden. Aus der Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft kann dann auf den ökologischen Status der untersuchten Probe geschlossen werden, ohne dass eine aufwändige Auszählung und Identifizierung der größeren Organismen erforderlich ist. Da Bakterien eine deutlich kürzere Generationszeit als die bisher untersuchten Organismen besitzen, können auch kurzfristige Änderungen von Umwelteinflüssen anhand der Bakterienzusammensetzung detektiert werden. Des Weiteren wird die Anwendung von eDNA Metabarcodingbasiertem Monitoring stetig preiswerter, da die Sequenzierungskosten immer weiter sinken. Um die Methode jedoch langfristig in der Gesetzgebung zu etablieren, müssen zunächst Standardprotokolle entwickelt werden. Sobald diese ausreichend validiert sind, können sie in die Gesetzgebung aufgenommen werden und die herkömmliche Überwachung ergänzen oder sogar ersetzen. Einige Schritte der eDNA-basierten Methode, von der Probenahme bis zur Ökosystembewertung, sind jedoch noch nicht ausreichend standardisiert, weshalb die Ausarbeitung dieser Arbeit notwendig war. Da es in der wissenschaftlichen Gemeinschaft noch keinen Konsens über (i) die Konservierung von Umweltproben während des Transports, (ii) die Reproduzierbarkeit der Ökosystembewertung durch verschiedene Labore, (iii) die am besten geeignete Methode zur Ableitung der eDNA Daten zur Bewertung von Ökosystemen, und (iv) die für die Bestimmung des Ökosystemstatus erforderliche Mindestsequenziertiefe gibt, wurden diese Teilschritte untersucht. Es wurde gezeigt, dass die derzeit am häufigsten verwendeten Methoden zur Probenkonservierung während des Transports keinen erkennbaren Einfluss auf die endgültige Ökosystembewertung haben. Darüber hinaus ermöglichten unabhängigen Labore die gleiche Interpretation der Bakteriengemeinschaft, was ebenfalls zu einer übereinstimmenden Bewertung des Ökosystems führte. Dies deutet auf die Reproduzierbarkeit der eDNA Metabarcoding-basierenden Methode hin, und erlaubt somit die Implementierung in Standardprotokolle. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass mit den derzeit verwendeten Methoden zur Bestimmung des ökologischen Zustands auf der Grundlage von eDNA-Daten die gleichen Ökosystembewertungen erzielt werden können. Entscheidend für die Vorhersagegenauigkeit ist jedoch nicht die Methode selbst, sondern eine ausreichende Anzahl von Proben, die die natürliche räumliche und zeitliche Variabilität von Bakteriengemeinschaften berücksichtigt. Es konnte gezeigt werden, dass eine geringe Sequenziertiefe pro Probe bereits ausreichend war, um mit Hilfe des maschinellen Lernens eine Aussage über den ökologischen Status der Umweltprobe zu treffen. Die Qualität dieser Klassifizierung hing nicht, wie angenommen, von der Sequenzierungstiefe ab, sondern wurde durch die Auftrennbarkeit einzelner Kategorien vorgegeben. Die Ergebnisse und Empfehlungen dieser Arbeit tragen direkt zur Standardisierung der ökologischen Bewertung von küstennahen Meeresökosystemen anhand von eDNA Metabarcoding bei. Durch die Etablierung dieser Standardprotokolle wird es möglich sein, die auf eDNA Metabarcoding basierende Methode zur Überwachung der Einhaltung der Vorschriften für marine Küstenökosysteme in Zukunft in die Gesetzgebung zu integrieren.

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Metadaten
Author:Verena RubelORCiD
URN:urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-68765
DOI:https://doi.org/10.26204/KLUEDO/6876
Advisor:Thorsten Stoeck
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:English
Publication Date:2022/07/08
Year of Publication:2022
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2022/06/24
Date of the Publication (Server):2022/07/11
Number of page:281
Source:https://doi.org/10.1016/j.marpolbul.2021.113129
Source:https://doi.org/10.1016/j.ecolind.2020.107049
Source:https://doi.org/10.1016/j.csbj.2021.04.005
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Biologie
DDC-Cassification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften, Biologie
Licence (German):Zweitveröffentlichung