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Transcriptional and posttranscriptional regulation of the c-di-GMP modulating phosphodiesterase NbdA of Pseudomonas aeruginosa

  • Like many other bacteria, the opportunistic pathogen P. aeruginosa encodes a broad network of enzymes that regulate the intracellular concentration of the second messenger c-di-GMP. One of these enzymes is the phosphodiesterase NbdA that consists of three domains: a membrane anchored, putative sensory MHYT domain, a non-functional diguanylate cyclase domain with degenerated GGDEF motif and an active PDE domain with EAL motif. Analysis of the nbdA open reading frame by 5’-RACE PCR revealed an erroneous annotation of nbdA in the Pseudomonas database with the ORF 170 bp shorter than previously predicted. The newly defined promoter region of nbdA contains recognition sites for the alternative sigma-factor RpoS as well as the transcription factor AmrZ. Promoter analysis within PAO1 wt as well as rpoS and amrZ mutant strains utilizing transcriptional fusions of the nbdA promoter to the reporter gene lacZ revealed transcriptional activation of nbdA by RpoS in stationary growth phase and transcriptional repression by AmrZ. Additionally, no influence of nitrite and neither exogenous nor endogenous NO on nbdA transcription could be shown in this study. However, deletion of the nitrite reductase gene nirS led to a strong increase of nbdA promoter activity which needs to be characterized further. Predicted secondary structures of the 5’-UTR of the nbdA mRNA indicated either an RNA thermometer function of the mRNA or post-transcriptional regulation of nbdA by the RNA binding proteins RsmA and RsmF. Nevertheless, translational studies using fusions of the 5’ UTR of nbdA to the reporter gene bgaB did not verify either of these hypotheses. In general, nbdA translational levels were very low and neither the production of the reporter BgaB nor genomically encoded NbdA could be detected on a western blot. Overproduction of NbdA variants induced many phenotypic changes in motility and biofilm formation. But strains overproducing variants containing the MHYT domain revealed greatly elongated cells and were impaired in surface growth, indicating a misbalance in the membrane protein homeostasis. Therefore, these phenotypes have to be interpreted very critically. Microscopic studies with fluorescently tagged NbdA revealed either a diffuse fluorescent signal of NbdA or the formation of fluorescent foci which were located mainly at the cell poles. Co-localization studies with the polar flagellum and the chemotaxis protein CheA showed that NbdA is not generally localizing to the flagellated cell pole. NbdA localization indicates the control of a specific local c-di-GMP pool in the cell which is most likely involved in MapZ mediated chemotactic flagellar motor switching.
  • Wie viele andere Bakterien, verfügt auch das opportunistische Pathogen Pseudomonas aeruginosa über ein großes Netzwerk an Enzymen die die intrazelluläre Konzentration des sekundären Botenstoffes c-di-GMP regulieren. Eines dieser 40 Enzyme ist die Phosphodiesterase NbdA welche aus drei Domänen besteht: Einer Membran verankerten, putativen MHYT Sensordomäne, einer nicht funktionellen Diguanylatzyklase Domäne mit degeneriertem GGDEF Motiv und einer aktiven PDE Domäne mit EAL Motiv. Eine 5‘-RACE PCR Analyse des offenen Leserahmens von nbdA ergab eine fehlerhafte Annotation von nbdA in der Pseudomonas Datenbank. Der neu bestimmte Promotor des um 170 bp kürzeren Leserahmens enthält Bindestellen für den alternativen Sigmafaktor RpoS sowie den Transkriptionsfaktor AmrZ. Mittels transkriptioneller Fusionen konnte gezeigt werden, dass die Transkription von nbdA in der stationären Wachstumsphase durch RpoS aktiviert wird und nbdA generell von AmrZ reprimiert wird. Ein Einfluss von Nitrit sowie endogenem oder exogenem NO konnte nicht gezeigt werden, jedoch führte die Deletion der Nitritreduktase NirS zu einem deutlichen Anstieg der nbdA Promotoraktivität, welcher noch näher untersucht werden muss. Vorhersagen der Sekundärstruktur der 5‘-UTR der nbdA mRNA deuten entweder eine Funktion als RNA Thermometer oder eine post-transkriptionelle Regulation von nbdA durch die RNA-bindenden Proteine RsmA und RsmF an. Keine der beiden Hypothesen ließ sich in Analysen mit translationalen Fusionen der nbdA 5‘-UTR an ein Reportergen bestätigen. Generell war das Translationslevel von nbdA sehr niedrig und weder die Bildung des Reporters BgaB noch genomisch codiertes NbdA waren mittels Western Blot nachweisbar. Eine Überproduktion verschiedener NbdA Varianten induzierte phänotypische Veränderungen der Motilität sowie Biofilmbildung. Allerdings zeigten Zellen, welche die MHYT Domäne überproduzieren auch eine stark verlängerte Zellmorphologie und eine Beeinträchtigung im Wachstum auf Oberflächen. Dies deutet auf eine Störung der Membranproteinhomöostase hin und macht deutlich, dass die Ergebnisse der Überexpressionsanalysen nur mit Vorsicht zu interpretieren sind. Mikroskopische Untersuchungen mit Fluoreszenztag tragendem NbdA zeigten entweder eine diffuse Fluoreszenz von NbdA oder die Bildung fluoreszenter Foki, die überwiegend an den Zellpolen lokalisiert sind. Kolokalisationsstudien mit der polaren Flagelle und dem Chemotaxis Protein CheA zeigten, dass sich NbdA nicht generell am flagellierten Zellpol befindet. Die Lokalisation von NbdA deutet darauf hin, dass die PDE nur einen lokalen c-di-GMP Pool in der Zelle reguliert, welcher wahrscheinlich am MapZ vermittelten Flagellen-Motor Richtungswechsel beteiligt ist.

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Metadaten
Author:Katrin Gerbracht
URN:urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-67115
DOI:https://doi.org/10.26204/KLUEDO/6711
Advisor:Nicole Frankenberg-Dinkel
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:English
Publication Date:2022/01/12
Year of Publication:2022
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2021/12/03
Date of the Publication (Server):2022/01/13
Number of page:IX, 149
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Biologie
DDC-Cassification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften, Biologie
Licence (German):Creative Commons 4.0 - Namensnennung, nicht kommerziell, keine Bearbeitung (CC BY-NC-ND 4.0)