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From metagenomes to green algae – The biochemical variety of bilin biosynthesis enzymes

  • The screening of metagenomic datasets led to the identification of new phage-derived members of the heme oxygenase and the ferredoxin-dependent bilin reductase enzyme families. The novel bilin biosynthesis genes were shown to form mini-cassettes on metagenomic scaffolds and further form distinct clusters in phylogenetic analyses (Ledermann et al., 2016). In this project, it was demonstrated that the discovered sequences actually encode for active enzymes. The biochemical characterization of a member of the heme oxygenases (ΦHemO) revealed that it possesses a regiospecificity for the α-methine bridge in the cleavage of the heme macrocycle. The reaction product biliverdin IXα was shown to function as the substrate for the novel ferredoxin-dependent bilin reductases (PcyX reductases), which catalyze its reduction to PEB via the intermediate 15,16-DHBV. While it was demonstrated that ΦPcyX, a phage-derived member of the PcyX reductases, is an active enzyme, it also became clear that the rate of the reaction is highly dependent on the employed redox partner. It turned out that the ferredoxin from the cyanophage P-SSM2 is to date the most suitable redox partner for the reductases of the PcyX group. Furthermore, the solution of the ΦPcyX crystal structure revealed that it adopts an α/β/α-sandwich fold, typical for the FDBR-family. Activity assays and subsequent HPLC analyses with different variants of the ΦPcyX protein demonstrated that, despite their similarity, PcyX and PcyA reductases must act via different reaction mechanisms. Another part of this project focused on the biochemical characterization of the FDBR KflaHY2 from the streptophyte alga Klebsormidium flaccidum. Experiments with recombinant KflaHY2 showed that it is an active FDBR which produces 3(Z)-PCB as the main reaction product, like it can be found in reductases of the PcyA group. Moreover, it was shown that under the employed assay conditions the reaction of BV to PCB proceeds in two different ways: Both 3(Z)-PΦB and 18¹,18²-DHBV occur as intermediates. Activity assays with the purified intermediates yielded PCB. Hence, both compounds are suitable substrates for KflaHY2. The results of this work highlight the importance of the biochemical experiments, as catalytic activity cannot solely be predicted by sequence analysis.
  • Die Analyse metagnomischer Daten führte zur Entdeckung neuartiger Mitglieder der Enzymfamilien der Hämoxygenasen und der Ferredoxin-abhängigen Bilinreduktasen. In phylogenetischen Untersuchungen zeigte sich, dass diese Proteine abgegrenzte Cluster in phylogenetischen Stammbäumen formen. Im Laufe dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die entdeckten Sequenzen für funktionelle Enzyme codieren. Die biochemische Charakterisierung eines Mitglieds der neuen Hämoxygenasen (ΦHemO) ergab, dass das Enzym die Reaktion von Häm zu Biliverdin IXα katalysiert. Weiterhin fungiert Biliverdin IXα als Substrat für die neuen Ferredoxin-abhängigen Bilinreduktasen (PcyX-Reduktasen). Diese katalysieren die Umsetzung des Biliverdins in das pinke Pigment PEB (Phycoerythrobilin) über das Zwischenprodukt 15,16-Dihydrobiliverdin. Untersuchungen an einem Mitglied der PcyX-Reduktasen (ΦPcyX) zeigten, dass die Reaktionsgeschwindigkeit in großem Maße von dem verwendeten Redoxpartner abhängig ist. Es stellte sich heraus, dass das Ferredoxin aus dem Cyanophagen P-SSM2 der geeignetste Redoxpartner für ΦPcyX ist. Die Röntgenstrukturanalyse an ΦPcyX ergab, dass das Enzym eine α/β/α-Faltung einnimmt. Dieses Strukturmerkmal ist charakteristisch für alle Ferredoxin-abhängigen Bilinreduktasen. Mit Hilfe von ortsspezifischer Mutagenese wurden verschiedene Varianten des ΦPcyX-Proteins erzeugt. Untersuchungen bezüglich der Aktivität dieser Mutanten zeigten, dass die Reduktasen der PcyX- und PcyA-Gruppen verschiedene Reaktionsmechanismen aufweisen müssen. Dies war unerwartet, da die PcyA- und PcyX-Reduktasen eine große Ähnlichkeit innehaben. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Charakterisierung der Ferredoxin-abhängigen Bilinreduktase KflaHY2 aus der Alge Klebsormidium flaccidum. Experimente mit rekombinant produziertem Protein zeigten, dass das Enzym die Reaktion von Biliverdin IXα zu 3(Z)-Phycocyanobilin katalysiert. Untersuchungen zu den Zwischenprodukten ergaben, dass KflaHY2 unter den verwendeten Reaktionsbedingungen die Reaktion von Biliverdin IXα zu 3(Z)-Phycocyanobilin über zwei verschiedene Wege realisiert. Es konnten sowohl 18¹,18²-Dihydrobiliverdin, als auch 3(Z)-Phytochromobilin als Intermediate identifiziert werden. Weiterhin wurde mit Hilfe der isolierten Intermediate gezeigt, dass beide Verbindungen von KflaHY2 zu 3(Z)-PCB umgesetzt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeiten unterstreichen die Notwendigkeit der biochemischen Charakterisierung von putativen Enzymen aus Metagenomdaten, da Sequenzanalysen für eine genaue Vorhersage der Enzymaktivität nicht hinreichend sind.

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Metadaten
Verfasserangaben:Benjamin Ledermann
URN (Permalink):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-51532
Betreuer:Nicole Frankenberg-Dinkel
Dokumentart:Dissertation
Sprache der Veröffentlichung:Englisch
Veröffentlichungsdatum (online):01.02.2018
Jahr der Veröffentlichung:2018
Veröffentlichende Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Titel verleihende Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Datum der Annahme der Abschlussarbeit:26.01.2018
Datum der Publikation (Server):02.02.2018
Seitenzahl:XXX, 95
Fachbereiche / Organisatorische Einheiten:Fachbereich Biologie
DDC-Sachgruppen:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften, Biologie
Lizenz (Deutsch):Creative Commons 4.0 - Namensnennung, nicht kommerziell, keine Bearbeitung (CC BY-NC-ND 4.0)