Die Regulation des Zweikomponentensystems CiaRH von Streptococcus pneumoniae und die phänotypischen Konsequenzen

  • Das Zweikomponentensystem CiaRH, bestehend aus der membranständigen Histidinkinase CiaH und dem cytoplasmatischen Responseregulator CiaR, wurde als erste nicht-PBP-Resistenzdeterminante in Streptococcus pneumoniae entdeckt. Es beeinflusst neben der β-Laktamresistenz noch weitere Phänotypen, darunter die genetische Kompetenz, die Autolyse und die Virulenz, was seine Bedeutung für die Physiologie der Zelle unterstreicht. Im Zuge dieser Arbeit wurden sieben verschiedene ciaH-Allele aus spontanen β laktamresistenten Labormutanten charakterisiert. Die Allele, deren eine bis zwei Punktmutationen sich über den gesamten Genbereich erstrecken, wurden mit Hilfe der Janus Kassette in den Wildtyp-Stamm R6 eingebracht und untersucht. Es konnte durch β Galaktosidaseassays von Promotor-lacZ-Fusionen gezeigt werden, dass alle ciaH-Allele eine Aktivierung des CiaRH-Systems vermitteln. Diese bewegt sich, bezogen auf den CiaR-regulierten Promotor PhtrA, je nach Allel zwischen dem 4- und dem 26-fachen im Vergleich zum Wildtyp. Phänotypische Studien konnten zeigen, dass die Aktivierung des CiaRH-Systems in allen Fällen zu einer Erhöhung der β-Laktamresistenz, sowie einer verzögerten Autolyse führt. Durch den neu hergestellten alternativen Rifampin-Resistenzmarker RKL222 konnte zudem der Kompetenzphänotyp der Stämme mit verändertem ciaH untersucht und ein Verlust der Kompetenz nachgewiesen werden. Die Ausprägung der Phänotypen korreliert dabei weitestgehend mit der Stärke der CiaRH-Aktivierung. Die abgestufte Aktivierungsstärke der unterschiedlichen ciaH-Allele könnte in Zukunft bei der Untersuchung verschiedener regulatorischer Aspekte von CiaRH von Nutzen sein. Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Frage, welches oder welche der 30 Gene des CiaR-Regulons die CiaRH-Abhängigkeit des Resistenz-, Kompetenz- und Autolysephänotyps von S. pneumoniae vermitteln. Dazu wurde die Bedeutung der stark regulierten Gene ccnA E und htrA phänotypisch näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die durch ccnA-E kodierten csRNAs die Haupteffektoren der genannten Phänotypen sind. Ihr Fehlen hebt den Kompetenzblock, die verzögerte Lyse und größtenteils auch die β Laktamresistenz eines aktivierten CiaRH-Systems auf. Die Serinprotease HtrA dagegen hat keinen deutlichen Effekt auf Resistenz und Autolyse, trägt aber zum Kompetenzblock, der bei aktiviertem CiaRH-System auftritt, bei. In dem kompetenzinhibierenden Medium BHI führt nur die gemeinsame Deletion von ccnA-E und htrA zur Wiederherstellung der Kompetenz, wie beim ciaR-Deletionsstamm, während in dem ebenfalls kompetenzinhibierenden Medium THB die Deletion von htrA dafür ausreicht. Die Identifizierung der csRNAs und HtrA als Effektoren der CiaRH-abhängigen Phänotypen stellt die Basis für weiterführende Analysen über die regulatorischen Zusammenhänge zwischen CiaRH und den Phänotypen dar. In dieser Arbeit konnte zudem erstmals gezeigt werden, dass unter den Genprodukten des CiaR-Regulons die Serinprotease HtrA, die csRNAs und das Mannose-Phosphotransferasesystem ManLMN einen regulatorischen Einfluss auf die Aktivität des CiaRH-Systems ausüben. Die Deletion ihrer Gene führte zu einer unterschiedlich starken Aktivierung der CiaR-abhängigen Genregulation. Da der stärkste aktivierende Effekt durch das Fehlen von HtrA vermittelt wurde, wurde die Art dieser Regulation im Rahmen der vorliegenden Arbeit näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass im Falle einer htrA-Deletion die Aktivierung von CiaR ohne Beteiligung der Histidinkinase CiaH geschieht. Zudem ist der regulatorische Effekt offenbar unabhängig vom Medium und wird nicht über Veränderungen der genetischen Kompetenz vermittelt. Im Zuge dieser Untersuchungen wurde zusätzlich festgestellt, dass die Deletion der Gene comAB und comDE, die für die Kompetenzinduktion essentiell sind, einen inhibitorischen Effekt auf die CiaRH-Aktivität hat. Damit konnten in dieser Arbeit zwei bislang unbekannte Regulationswege identifiziert werden, die die Aktivität des CiaRH-Systems beeinflussen. Im Gegensatz zur Mehrzahl der Zweikomponentensysteme ist CiaRH offensichtlich nicht darauf ausgelegt, starke Änderungen der Genexpression zu vermitteln. Die CiaRH-Aktivität befindet sich vielmehr unter den verschiedensten physiologischen Bedingungen auf einem recht konstanten mittleren Aktivierungsniveau. Stärkere Abweichungen von diesem Niveau führen zur deutlichen Beeinträchtigung der Zellfitness. Die Homöostase der CiaRH-Aktivität ist folglich für S. pneumoniae von großer Bedeutung und muss durch Regulationsmechanismen sichergestellt werden. Regelkreise, wie die in dieser Arbeit identifizierten Regulationswege, stellen dabei eine Möglichkeit dar. Insbesondere die gegenseitige Beeinflussung von CiaRH und den Komponenten des eigenen Regulons kann zur Aufrechterhaltung eines gleichbleibenden Aktivitätsniveaus von CiaRH beitragen. Es zeigt sich mehr und mehr, dass es sich bei CiaRH um ein für die Zellphysiologie bedeutendes System handelt, dessen Aktivität durch ein regulatorisches Zusammenspiel von äußeren und inneren Faktoren gesteuert wird.

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Metadaten
Author:Miriam Müller
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-26426
Advisor:Regine Hakenbeck
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Publication Date:2011/06/15
Year of Publication:2011
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2011/06/10
Number of page:170
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Biologie
DDC-Cassification:570 Biowissenschaften; Biologie

$Rev: 12793 $