Charakterisierung der DNA-schädigenden Wirkung von Acrylamid in Lebensmitteln am Modell der Ratte

Characterization of the DNA-damaging impact of food-borne acrylamide in vivo

  • Die alpha,beta-ungesättigte Carbonylverbindung Acrylamid entsteht beim Erhitzen von kohlenhydratreichen Lebensmitteln aus der Reaktion von Aminosäuren (hauptsächlich Asparagin) und reduzierenden Zuckern als Nebenprodukt der Maillard-Reaktion. In Langzeitstudien an Ratten wurde ein kanzerogenes Potential von Acrylamid nachgewiesen, was zu seiner Klassifizierung als „wahrscheinlich kanzerogen am Menschen“ (Kategorie 2a) durch die International Agency for Research on Cancer führte. Als Auslöser der Kanzerogenität von Acrylamid wird ein genotoxischer Mechanismus vermutet, der auf der Reaktion von Glycidamid mit der DNA unter Ausbildung des Hauptadduktes N7-Glycidamid-Guanin (N7-GA-Guanin) basiert. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der genotoxischen Wirkung von Acrylamid in vivo anhand des modifizierten Comet Assays sowie der massenspektrometrischen Untersuchung von N7-GA-Guanin-Addukten. Die Problematik wurde in zwei Teilprojekten bearbeitet. Zum einen wurde die Auswirkung verschiedener Lebensmittelmatrices auf die genotoxische Wirkung von Acrylamid in der Ratte im Vergleich zur Acrylamid-Aufnahme über Trinkwasser per Schlundsonde untersucht. Dazu wurden jeweils drei Ratten über maximal neun Tage mit Acrylamid-Dosen von 50 µg/kg KG/d in Trinkwasser oder Brotkruste bzw. 100 µg/kg KG/d in Trinkwasser (Schlundsonde), geschnittenen und rekonstituierten Pommes Frites sowie Lebkuchen behandelt. Zusätzlich wurde jeweils drei Tiere einmalig eine Dosis von 450 µg bzw. 900 µg Acrylamid/kg KG in Trinkwasser mittels Schlundsonde verabreicht, was der maximalen Aufnahmemenge über neun Tage entspricht. Außerdem wurde zwei Tieren einmalig 10 mg Acrylamid/kg KG in Trinkwasser per Schlundsonde gegeben. Die Tötung der Tiere sowie Blut- und Organentnahme erfolgten 24 Stunden nach der letzten Acrylamid-Gabe. Die Untersuchung der Blut- und Leberzellen mittels modifiziertem Comet Assay ließ auf keine signifikante DNA-Schädigung der mit 50 oder 100 µg Acrylamid/kg KG behandelten Tiere schließen. Auch die einmalige Verabreichung von 450 µg bzw. 900 µg Acrylamid/kg KG im Trinkwasser führte zu keiner signifikanten Erhöhung der DNA-Schädigung. Lediglich nach der Gabe von 10 mg Acrylamid/kg KG wurden DNA-Schäden in Blut und Leber detektiert. In den Geweben der für maximal neun Tage mit 50 oder 100 µg Acrylamid/kg KG im Trinkwasser oder Lebensmittel behandelten Ratten wurden keine N7-GA-Guanin-Addukte detektiert und lagen somit unterhalb der Nachweisgrenze von 1 Addukt/10E8 Nukleotide. Nach einmaliger Verabreichung von 450 µg Acrylamid/kg KG wurden in allen Organen der behandelten Tiere N7-GA-Guanin-Addukte detektiert, die allerdings unterhalb der Bestimmungsgrenze von 3 Addukten/10E8 Nukleotide lagen. Die einmalige Gabe von 900 µg und 10 mg Acrylamid/kg KG führte zu quantifizierbaren Addukten in allen untersuchten Organen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die zeit- und dosisabhängige Bildung von N7-GA-Guanin-Addukten in der DNA aus Leber, Niere und Lunge weiblicher Sprague-Dawley Ratten untersucht. Dazu wurden die Ratten zunächst einmalig mit 1 mg oder 10 mg Acrylamid/kg KG per Schlundsonde behandelt und die Gewebeproben nach 8, 16 oder 24 Stunden entnommen und untersucht. Nach Ermittlung des Zeitpunktes der maximalen N7-GA-Guanin-Adduktbildung wurden weitere Ratten einmalig mit 0,1 mg, 0,5 mg, 3 mg oder 6 mg Acrylamid/kg KG behandelt. Neben der N7-GA-Guanin-Adduktbildung wurde die Bildung der Mercaptursäuren von Acrylamid und Glycidamid mittels HPLC-MS/MS untersucht. Die Mercaptursäuren AAMA und GAMA entstehen als Abbauprodukte der Glutathionkonjugate von Acrylamid und Glycidamid und werden über den Urin ausgeschieden. Die dosisabhängige Bildung von N7-GA-Guanin-Addukten wurde 16 Stunden nach Verabreichung von Acrylamiddosen zwischen 0,1 mg und 10 mg/kg KG untersucht. Die N7-GA-Guanin-Addukte konnten erst ab einer Dosis von 1 mg Acrylamid/kg KG in der DNA der Tiere quantifiziert werden. Die Adduktbildung in der 0,1 mg Acrylamid/kg KG-Gruppe lag unterhalb der Nachweisgrenze, während die Addukte in der 0,5 mg Acrylamid/kg KG-Gruppe zwar nachweisbar, aber nicht quantifizierbar waren. Im Bereich von 1 bis 10 mg Acrylamid/kg KG wurde ein dosisabhängiger Anstieg der N7-GA-Guanin-Addukte beobachtet. Die Ergebnisse der gemessenen Mercaptursäuren zeigen insgesamt, dass 53-55 % der Acrylamid-Dosis von 1 und 10 mg/kg KG innerhalb von 24 Stunden als Mercaptursäuren ausgeschieden werden und dadurch eine effektive Entgiftung von Acrylamid gewährleistet ist. Anhand der ausgeschiedenen GAMA-Menge lässt sich rückschließen, dass 14-18 % der verabreichten 1 und 10 mg Acrylamid/kg KG innerhalb von 24 Stunden zu Glycidamid metabolisiert werden. Die Untersuchung der Mercaptursäuren im 16-Stunden-Sammelurin nach Gabe von 0,1 bis 10 mg Acrylamid/kg KG zeigte, dass die absolute Ausscheidung von AAMA und GAMA linear mit der Dosis ansteigt.
  • Acrylamide is an alpha,beta-unsaturated carbonyl compound that is generated during the heating of carbohydrate-rich food. In long-term animal trials acrylamide was found to be carcinogenic. Therefore, it is classified by International Agency for Research on Cancer as probably carcinogenic to humans (group 2a). The biological activity of acrylamide is considered to be mainly determined by its metabolic activation into genotoxic glycidamide (GA). Glycidamide is able to react with DNA bases to form glycidamide-DNA adducts, especially with the N7 of guanine. The aim of this work was to investigate the genotoxicity of acrylamide in vivo using the modified Comet Assay to detect DNA damage and a HPLC-MS/MS method to determine N7-GA-guanine adducts. In the first part of this work the influence of food matrices on genotoxicity of acrylamide was investigated. Therefore, three Sprague-Dawley rats per group received acrylamide doses of 50 or 100 µg/kg bw/d in drinking water per gavage or in different food matrices for up to nine days. As food matrices bread crust, gingerbread and French fries (sliced from potatoes with normal plant texture or reconstituted from potato starch representing a dough-like texture) were chosen. In an additional trial, three rats received a single dose of 450 or 900 µg acrylamide/kg bw, respectively. These doses represent the maximum exposure against acrylamide over nine days. Furthermore, two rats received a single dose of 10 mg acrylamide/kg bw in drinking water. All animals were sacrificed 24 hours after the last dosing and blood and tissues (liver, kidney, lung, testes) were removed for testing. The results of the Comet Assay showed no significantly increased DNA damage in blood and liver cells after treatment of rats with 50 or 100 µg acrylamide/kg bw for up to nine days nor after application of a single dose of 450 or 900 µg acrylamide/kg bw. DNA damage was only increased in blood and liver cells of animals dosed with 10 mg acrylamide/kg bw. N7-GA guanine adducts were not detectable in tissues of animals treated for up to nine days with 50 or 100 µg acrylamide/kg bw/d (detection limit: 1 adduct/10E8 nucleotides). After a single dose of 450 µg acrylamide/kg bw N7-GA guanine adducts were detectable, but not quantifiable in all investigated tissues (quantification limit: 3 adducts/10E8 nucleotides). The single treatment of three rats with 900 µg and 10 mg acrylamide/kg bw leads to quantifiable adducts in DNA isolated from all investigated tissues. In the second part of this work the time- and dose-dependent formation of N7-GA guanine adducts was investigated. Additionally, the mercapturic acids of acrylamide and glycidamide, AAMA and GAMA, were determined in the urine of acrylamide-treated rats by HPLC-MS/MS. AAMA and GAMA are the degradation products of acrylamide and glycidamide glutathione conjugates and can be used as biomarkers of toxification and detoxification of acrylamide and glycidamide, respectively. First of all, Sprague-Dawley rats were treated with single doses of 1 or 10 mg acrylamide/kg bw in drinking water per gavage for 8, 16 or 24 hours to determine the best time point to investigate N7-GA guanine adducts. This investigation results in a slight maximum of N7-GA guanine adduct formation after 16 hours. Thereafter, further animals were dosed with 0.1-6 mg acrylamide/kg bw to investigate a dose-dependent formation of N7-GA guanine adducts 16 hours after the application. But even after 16 hours the N7-GA guanine adducts were only quantifiable in the groups dosed with 1 mg acrylamide/kg bw or higher. Within the range of 1 and 10 mg acrylamide/kg bw the N7-GA guanine adduct formation increased in dependence of dose. In contrast, mercapturic acids of acrylamide and glycidamide were detectable in the urine of all acrylamide-treated animals. Within 24 hours, 53-55 % of acrylamide dose were excreted with urine as AAMA and GAMA.

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Metadaten
Author:Julia Feld
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-25834
Advisor:Gerhard Eisenbrand
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2010
Year of Publication:2010
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2010/12/16
Tag:Acrylamid; DNA Addukte; Glycidamid; Mercaptursäuren; Ratte
acrylamide; dna adducts; glycidamide; mercapturic acids; rat
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften

$Rev: 12793 $