Untersuchung des TRPV5 Kalziumkanals und daran assoziierter Proteine mittels Affinitätschromatographien

Investigation of the TRPV5 calcium channel and associated proteins using affinity chromatographies

  • Der TRPV5 Ionenkanal ist ein hoch selektiver Kalziumkanal, der in der Niere exprimiert wird und dort für den transzellulären Kalziumtransport im distalen Konvolut verantwortlich ist. TRPV5 Transkripte sind auch in anderen Geweben, wie z.B. der Plazenta, identifiziert worden. In dieser Arbeit wurde versucht, das TRPV5 Protein in verschiedenen Geweben nachzuweisen und den Kanal sowie eventuell daran assoziierte Proteine aus der Plazenta zu isolieren. Hierzu wurden verschiedene Strategien verfolgt. Zum einen wurden vier polyklonale Peptidantikörper generiert, einer gegen einen N- und drei gegen C-terminale Bereiche des humanen TRPV5 Proteins. Diese wurden eingehend mittels ELISA, Peptidblot-Analysen, Western Blot Analysen und immunhistochemischen Färbungen bezüglich ihrer Spezifität und Affinität charakterisiert. Alle generierten Antikörper erkennen spezifisch nur die antigenen Bindungsregionen in Glutathion-S-Transferase (GST)-TRPV5-Fusionsproteinen und detektieren das endogen in humaner Plazenta exprimierte Protein. Der Antikörper, der gegen den absoluten C-Terminus des TRPV5 Ionenkanals gerichtet ist (982/3), erwies sich zum Nachweis des TRPV5 Proteins im distalen Konvolut in Mausnieren als geeignet, allerdings zum Nachweis des TRPV5 Proteins im Synzytiotrophoblasten der humanen Plazenta, ist einer der anderen C-terminalen TRPV5 Antikörper besser geeignet. Der Antikörper 982/3 wurde auch in Immunpräzipitationen und Antikörper-Affinitäts-chromatographien eingesetzt. Mit diesen beiden Methoden konnte das TRPV5 zwar in kleinen Mengen aus humanem Plazentagewebe bzw. Mausnieregewebe angereichert und im anschließenden Western Blot detekiert werden, allerdings war die Menge des isolierten Proteins so gering, dass eine massenspektrometrische Identifikation nicht möglich war. Parallel wurden GST-Pulldown Versuche mit Fusionsproteinen, die den N- und C-Terminus des TRPV5 Proteins enthalten, mit Proteinextrakten der humanen Plazenta durchgeführt. Hierbei wurden insgesamt 38 Proteine als putative Interaktionspartner von TRPV5 identifiziert. Darunter befinden sich bereits in der Literatur beschriebene Interaktionspartner, wie NHERF2 und Galectin-1, und zahlreiche potentielle TRPV5 bindende Proteine. Zu den häufigsten identifizierten Proteinen zählen die Proteine 11ß-HSD2, Ku70 und Calpain-6. Ihre Bindung an N- und C-terminale Bereiche des Ionenkanals, nicht aber an GST konnte in weiteren GST-Pulldown-Experimenten und anschließender Identifikation im Western Blot bestätigt werden. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass das TRPV5 Protein in der humanen Plazenta an der Blut-Plazenta Schranke exprimiert wird. Aller Wahrscheinlichkeit nach ist dort das Protein mit anderen Proteinen assembliert. Inwiefern diese Interaktionen die Kanalaktivität beeinflussen müsste in weiteren Experimenten untersucht werden.

Volltext Dateien herunterladen

Metadaten exportieren

  • Export nach Bibtex
  • Export nach RIS

Weitere Dienste

Teilen auf Twitter Suche bei Google Scholar
Metadaten
Verfasserangaben:Janka Dörr
URN (Permalink):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-25495
Betreuer:Claudia Fecher-Trost
Dokumentart:Dissertation
Sprache der Veröffentlichung:Deutsch
Jahr der Fertigstellung:2010
Jahr der Veröffentlichung:2010
Veröffentlichende Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Titel verleihende Institution:Technische Universität Kaiserslautern
Datum der Annahme der Abschlussarbeit:13.08.2010
Datum der Publikation (Server):17.09.2010
Freies Schlagwort / Tag:Affinitätschromatographie; TRPV5
affinity chromatography; calcium channel ; placenta
GND-Schlagwort:Calciumkanal; Plazenta
Fachbereiche / Organisatorische Einheiten:Fachbereich Biologie
DDC-Sachgruppen:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Lizenz (Deutsch):Standard gemäß KLUEDO-Leitlinien vor dem 27.05.2011

$Rev: 13581 $