PBP2x-Mutationen in Streptococcus pneumoniae: Auswirkungen auf beta-Laktam-Resistenz und Zellphysiologie

  • Die Entwicklung von beta-Laktam-Resistenz in dem Pathogen Streptococcus pneumoniae (S. pneu-moniae) stellt einen komplexen Prozess dar, welcher auf einer Modifikation der Penicillin-Bindeproteine (PBP), der Targetstrukturen von beta-Laktam-Antibiotika beruht. PBP sind Membran-gebundene Enzyme, welche essentielle Reaktionen bei der bakteriellen Zellwand-Synthese katalysieren. Diese Proteine werden im Zuge der Resistenzentstehung so verändert, dass beta-Laktame nicht mehr oder nur noch mit geringer Affinität gebunden werden, das physiologische Substrat aber noch erkannt werden muß. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem PBP2x von S. pneumoniae, das als essentielles PBP und wichtigste primäre Resistenzdeterminante einen hohen Stellenwert bei der Entstehung von beta-Laktam-Resistenz in diesem Organismus einnimmt. Obwohl dieses PBP zu den am besten untersuchten PBP gehört, bleiben die Resistenzrelevanz einzelner Punktmutationen und die mit der Veränderung des Proteins einhergehenden physiologischen Folgen für die Zelle weitgehend unklar. Zentraler Inhalt dieser Arbeit war die Untersuchung des Effekts von PBP2x-Mutationen auf die Resistenz, Funktionalität von PBP2x und Zellphysiologie im Kontext mit der sekundären Resistenzdeterminante PBP1a und den beiden Zwei-Komponenten-Systemen CiaRH, welches in die Cefotaxim-Resistenz, genetische Kompetenz und Virulenz involviert ist und ComDE, das die genetische Kompetenz reguliert. Besonderes Interesse galt dabei der Position Thr338, welche sich unmittelbar benachbart zum aktiven Serin befindet und in den meisten resistenten klinischen Isolaten zu Alanin, Prolin oder Glycin mutiert ist. Durch eine gerichtete Mutagenese dieser Position im Wildtyp R6 konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass eine Thr338-Punktmutation einen selektionierbaren Resistenz-Phänotyp in vivo vermittelt, wobei abhängig von dem jeweiligen Austausch unterschiedliche Resistenzniveaus und Kreuzresistenzspektren zu beobachten waren. Abgesehen von einem nur moderaten Beitrag zur Resistenz, betraf eine solche Substitution offenbar auch die Funktionalität von PBP2x, was sich auf dramatische Art und Weise in Abwesenheit eines intakten CiaRH-Regulationssystems äußerte: Es kam zu Wachstumsdefekten, insbesondere einer verfrühten und verstärkten Autolyse, morphologischen Aberrationen und einer verminderten Lebensfähigkeit. Entgegen aller Erwartungen führte die Präsens eines Mosaik-PBP1a in dem genetischen Hintergrund der Thr338-Mutation nicht zu einem weiteren Anstieg der Resistenz, sondern bewirkte sogar einen leichten Abfall. Dennoch komplementierte das Mosaik-PBP1a die durch das Fehlen eines funktionsfähigen CiaRH-Systems hervorgerufenen Wachstumsdefizienzen. Der Vergleich zwischen dem PBP2x mit Thr338-Punktmutation und einem Mosaik-PBP2x deckte gravierende Unterschiede im Hinblick auf das Resistenzpotential und die physiologischen Auswirkungen auf. Anders als bei der PBP2x-Punktmutation waren bei dem Mosaik-PBP2x fast keine Wachstumseinbußen zu verzeichnen, wenn es mit einem inaktiven Zwei-Komponenten-System CiaRH kombiniert wurde, und die Anwesenheit eines Mosaik-PBP1a brachte eine starke Erhöhung der Cefotaxim-Resistenz mit sich. Beiden pbp2x-Allelen war jedoch gemeinsam, dass die Abwesenheit eines PBP1a massive Defekte im Wachstum zur Folge hatte. Alle diese Beobachtungen deuteten auf eine mögliche Interaktion zwischen PBP2x und PBP1a hin. Die Analyse der Zellwand einer Mutante mit zwei PBP2x-Aminosäureaustauschen, von denen einer in resistenten klinischen Stämmen anzutreffen ist, ergab eine biochemisch modifizierte Zellwand, in der bei einem fast gleichbleibenden Anteil an verzweigten Dimeren, Monomere erhöht, und lineare Dimere und Trimere reduziert waren. Diese Befunde ließen auf eine enzymatische Beeinträchtigung dieses PBP2x schließen. Ein von CiaRH ausgehender Effekt konnte nicht festgestellt werden. Eine Inaktivierung des für den Export des Kompetenz-stimulierenden Peptids CSP verantwortlichen ABC-Transporters ComAB in Kombination mit einem nicht-funktionellen CiaRH-System bewirkte im Wildtyp eine vollständige, in PBP2x-Punktmutanten eine nur teilweise Aufhebung der vorzeitigen stationären Phase-Autolyse. Darüber hinaus machte sich bei einem der PBP2x-Derivate, welches zusätzlich über eine Cefotaxim-Resistenz-vermittelnde Aminosäuresubstitution in CiaH verfügte, bei ciaR-Inaktivierung sowohl ein Verlust der CiaH- als auch eine partielle Einbuße der PBP2x-Resistenz bemerkbar, bei comAB-Inaktivierung hingegen aber ausschließlich ersteres. Hieraus konnte zum einen auf einen direkten Bezug des Lyse-Phänotyps zu der Kompetenz und der CiaRH-Resistenz zu ComAB geschlossen werden, zum anderen auf einen CiaRH-unabhängigen Einfluss von PBP2x auf die Kompetenz und Autolyse. Tatsächlich bestätigte eine Bestimmung der Transformationseffizienz von Mutanten mit verschiedenen Konstellationen aus niederaffinen und unmodifizierten PBP, dass das Kompetenzmuster bzw. -ausmaß von der jeweiligen PBP-Ausstattung moduliert wird. Auch eine Microarray-basierte globale Transkriptomanalyse dieser Mutanten sowie spontan resistenter Labormutanten mit PBP2x- und CiaH-Mutationen suggerierte eine von CiaRH-entkoppelte Einflussnahme der PBP auf die Kompetenz. Zudem zeugten die Transkriptionsmuster von einem vielschichtigen Regulationsnetzwerk der Resistenzentwicklung unter Beteiligung von Kompetenz, Bakteriocinproduktion, Virulenz, Metabolismus, Transportprozessen und Energiestatus, was möglicherweise eine indirekte Folge einer gestörten Zellwand- und Membranintegrität darstellt. Durch die Extraktion von intergenen Bereichen, sowie potentiellen neuen Resistenzdeterminanten bzw. Resistenz-unterstützenden Genen, wie den Gen-Clustern spr1545-spr1549 und spr0096-spr0110 oder den Genen des Purinstoffwechsels wurde die Basis für weiterführende Untersuchungen geschaffen. Die hier vorgestellten Daten demonstrieren, dass der Erwerb von beta-Laktam-Resistenz nicht nur von Vorteil ist, sondern auch physiologische Konsequenzen für die Zelle hat, die sie kompensiert, um ein möglichst stabiles Wachstum zu gewährleisten. Über die Zellwand-Zusammensetzung und Kompetenz konnte erstmalig eine Verbindung von PBP2x zu CiaRH hergestellt werden. Eine konkrete kompensatorische Wirkung dieses Regulons hinsichtlich PBP2x-Mutationen wurde mit der Repression der Kompetenzlyse ausfindig gemacht. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde basierend auf einer früheren Veröffentlichung, in der eine Inaktivierung des Gens für das PBP2b von S. pneumoniae erfolglos blieb, erneut versucht, eine solche Mutante herzustellen. Obwohl lebensfähige Transformanten generiert werden konnten, war es nicht möglich eine pbp2b-Inaktivierungs- bzw. Deletionsmutante zu isolieren, sodass PBP2b in diesem Organismus weiterhin als essentielles Protein angesehen werden kann.

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Metadaten
Author:Ilka Zerfaß
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-24872
Advisor:Regine Hakenbeck
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2010
Year of Publication:2010
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2010/03/31
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Biologie
DDC-Cassification:570 Biowissenschaften; Biologie

$Rev: 12793 $