Untersuchungen zur antioxidativen Wirksamkeit von Apfelsäften und polyphenolischen Inhaltsstoffen in-vitro und an Ratten

Studies on the antioxidative effectiveness of apple juices and polyphenolic constituents in-vitro and in rats

  • Neben dem Verzehr von Obst und Gemüse wird auch Fruchtsäften eine Bedeutung für die Prävention chronisch entzündlicher Darmerkrankungen und Dickdarmkrebs beigemessen. Neben der direkten antioxidativen Kapazität polyphenolischer Inhaltstoffe spielt vermutlich auch deren Einfluss auf die Expression redoxsensitiver Gene, wie z.B. der gamma-Glutamylcystein-Ligase (g-GCL) eine protektive Rolle. Die in-vitro Arbeiten an den Kolontumorzelllinien verfolgten das Ziel die antioxidative Wirksamkeit verschiedener Apfelsaftextrakte zu charakterisieren. Hierbei wurde der Einfluss der Aglyka Quercetin und Phloretin, der Inhaltsstoffe Chlorogensäure und Kaffeesäure, sowie der Apfelsaftextrakte AE02 /03 und AE05 auf die Transkription redoxsensitiver Zielgene in HT-29 und Caco-2 Zellen nach 6- und 24h-Inkubation mittels Real Time TaqMan PCR untersucht. Als Referenzverbindungen wurden Sulforaphan und Menadion eingesetzt. Die für den Glutathion-Redoxstatus relevanten ARE-abhängigen Gene GPX2 und GSR, sowie die Nrf2 Genexpression wurden in die Untersuchungen miteinbezogen. Die Ergebnisse zeigen u.a. charakteristische, zellspezifische Unterschiede in der Modulation der antioxidativen Genexpression, bei der sich die HT-29 Zellen vor allem im Hinblick auf die gewählte Inkubationszeit und Konzentration der untersuchten Testmaterialien als sensitiver erwiesen. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung eines polyphenolreichen Smoothies im Hinblick auf Bioverfügbarkeit und antioxidative Wirksamkeit im menschlichen Darm. Die Interventionsstudie mit Ileostoma-Patienten ermöglichte es, Saftinhaltstoffe und Metabolite eines Smoothiees der Apfelsorte Winesap unmittelbar vor der Dickdarmpassage aus den Inhalten der Ileostomabeutel zu gewinnen und in-vitro auf antioxidative Wirksamkeit hin zu überprüfen. Hierbei konnten sowohl zellfrei (TEAC und ORAC Assay) als auch mit der humanen Kolonkarzinomzellinie HT29 ein antioxidatives Potenzial der Ileostoma-Beutelinhalte nachgewiesen werden. Die TEAC- und ORAC-Werte der Ileostoma-Proben zeigten einen deutlichen Anstieg mit einem Maximum bei 4h nach Saftverzehr. Im Vergleich zu den 0h- Ileostombeutel-Inhalten bewirkten die 2h- und 4h-Ileostoma-Beutelinhalte eine signifikanten Reduktion des TBH-induzierten ROS-Levels (DCF-Assay) nach 24h Inkubation in HT29-Zellen. Die Identifizierung als auch die quantitative Erfassung der in den Ileostoma-Proben enthaltenen polyphenolischen Inhaltsstoffe, sowie deren Abbauprodukte könnte Hinweise auf aktivitätsgeleitete Strukturen einzelner polyphenolischer Verbindungen geben. In einer Interventionsstudie an Ratten wurde der Einfluss unterschiedlich hergestellter Apfelsäfte (klarer/ trüber AS, Smoothie, im Vergleich zu einem polyphenolfreien Kontrollsaft) auf die Modulation ARE abhängiger Genexpression in Kolon und Leber männlicher SD-Ratten mittels duplex RT-PCR untersucht. Die aus der vorliegenden Interventionsstudie an Ratten gewonnen Ergebnisse, weisen auf eine Erhöhung der antioxidativen Abwehr durch polyphenolische Apfelsäfte hin. Die Induktion der redoxsensitiven Genexpression variierte hierbei in ihrer Stärke je nach Zielgewebe (Kolon > Leber) und Art des Saftes (trüber > klarer ~ Smoothie). Ergänzend zu den von Spormann et al. untersuchten Biomarkern wurden Genexpressionsuntersuchungen aus PBMCs von Hämodialyse-Patienten mittels Real Time TaqMan PCR durchgeführt. Hierbei wurde neben der Expression ausgewählter glutathionbezogener Gene (g-GCL, GPX1, GSR) auch die Nrf2 Transkription, sowie die Genexpression des inflammatorischen Enzyms COX-2 erfasst. Im Vergleich zur Woche 1 der run-in Phase zeigt sich nach Intervention mit rotem Mehrfruchtsaft ein deutlicher Anstieg der mRNA Expression in den meisten antioxidativen Zielgenen, die COX-2 Genexpression wurde dagegen während der Saftaufnahme leicht herunterreguliert.
  • The risk of cancer and other degenerative diseases is inversely correlated with consumption of fruits and vegetables. This beneficial effect is mainly attributed to secondary plant constituents such as polyphenols, supposed to play a major role in protection against ROS (reactive oxygen species) associated toxicity. In addition to the direct antioxidative capacity of polyphenols, modulation of redox-sensitive gene expression, such as of gamma-glutamate-cysteine ligase (g-GCL), which catalyzes the rate-limiting step of glutathione synthesis, is of particular interest. Inter alia we investigated the modulation of antioxidant response element (ARE)- dependent genes (g-GCL: catalytic and modulatory subunits, glutathione peroxidase 2: GPX2, glutathione reductase: GSR and erythroid-derived 2-like 2: Nrf2) by phenolic juice extracts from table and cider apple varieties (AE02, AE03), known to elevate the glutathione level in HT-29 and Caco-2 cells. The aglyca quercetin (Qu) and phloretin (Ph), the constituents rutin (Ru), chlorogenic acid (ChA), caffeic acid (CA) and two known inducers of g-GCL (menadione, Mn; sulforaphane, Sul), were also studied. mRNA levels were quantified by Real Time TaqMan PCR after 6 and 24h incubation. In conclusion, modulation of gene expression by aglyca, rutin and AEs varied with cell type and structure of the compounds: Qu and AE03 (rich in quercetin glycosides) are most effective, elevating g-GCL transcription. A relation between g-GCL transcription and glutathione level was partially observed, e.g. with Qu and AE03 (both effective in Caco-2 cells) and AE02 (not effective in HT-29 cells). The results obtained with Su and Mn in HT-29 cells showed similar patterns for the ARE- dependent genes g-GCL, GPX2 and GSR. In an intervention study, 10 healthy probands with terminal ileostomy consumed 0.7L of a pulp enriched apple juice (Smoothie) and the ileostomy bags were collected at different time points (before juice consumption (0h) and after intervention: 1h, 2h, 4h, 6h and 8h). The aim of the study was to characterize the antioxidative effectiveness of the lyophilized ileostomy bag contents in-vitro after fermentation of the polyphenol-rich Smoothie in-vivo. The results show a distinct cell free antioxidant activity (TEAC and ORAC Assay) of the lyophilized samples, exhibiting a maximum by the samples at 4h after juice intervention. The tert-butyl hydroperoxide (TBH) induced reactive oxygen (ROS)-level (DCF-Assay) was significantly decreased in the HT-29 cell line by the 2h and 4h lyophilisate samples. Further, we studied the potential of differently manufactured apple juices (clear AJ/ cloudy AJ/ smoothie, in comparison to a polyphenol free control juice) to modulate expression of antioxidant response element (ARE)-dependent genes in male Sprague-Dawley rats. Expression of target genes (superoxide dismutase, SOD1/ SOD2; GPX1/ GPX2; g-GCL; GSR; catalase, CAT; NAD(P)H quinone oxidoreductase 1, NQO1 and transcription factor Nrf2, was quantified with duplex RT-PCR, using glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) as endogenous control. In colon and liver of rats consuming polyphenol-free control juice, rather similar basic expressions were observed (relative GAPDH ratios ranging from 2 - 0.7 and 2.5 - 0.3, respectively). In the distal colon, apple juice intervention slightly but significantly induced most genes (e.g. GPX2, GSR, CAT, Nrf2; p<0.001), whereas in the liver only GPX1 and NQO1 mRNA were up-regulated; other hepatic target genes were not affected or down-regulated (SOD1, SOD2, GCLC/M, GSR), concomitant with the absence of Nrf2 induction. Induction of antioxidant gene expression differed with juice type (cloudy AJ > clear AJ ~ smoothie). Taken together, the results underline the potential of polyphenol rich apple juice to increase the expression of ARE dependent antioxidant genes. Uptake of fruit juice with especially high flavonoid/polyphenol content has been shown to reduce oxidative cell damage in healthy probands (Weisel et al. 2006) and might also be utilized as preventive measure in hemodialysis (HD)-patients. An intervention study with patients on hemodialysis was performed by Spormann et al. with mixed fruit juice (Spormann et al. 2008) and from blood samples of 10 HD-patients of the aforementioned study we investigated the modulation of ARE dependent (g-GCL, GPX1, GSR, Nrf2), as well as inflammatory (Cyclooxygenase-2, Cox-2) gene expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). During the juice intervention phase a distinct increase in expression of most antioxidant genes was observed, whereas expression of the inflammatory Cox-2 gene was moderately down regulated. In conclusion, the red fruit juice clearly shows a marked potential to elevate antioxidant gene expression in HD-patients.

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Metadaten
Author:Bülent Soyalan
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-24865
Advisor:Gerhard Eisenbrand
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2010
Year of Publication:2010
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2010/03/31
Tag:Apfelsaftextrakte ; Nrf2 ; ROS; antioxidative Genexpression
Apple juice ; Nrf2; antioxidant gene expression ; apple polyphenols ; intervention study
GND-Keyword:Apfelsaft ; Darmkrebs ; Polyphenole
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften

$Rev: 12793 $