Synthese und in vitro Metabolisierung von Indirubinen mit verbesserter Wasserlöslichkeit und erhöhter metabolischer Stabilität

Synthesis and in vitro metabolism of indirubin with improved water-solubility and enhanced metabolic stability

  • Das aktuelle Design von Wirkstoffen ist fokussiert auf die Entwicklung von Molekülen, die das Tumorzellwachstum durch Inhibition mehrerer Signalwege unterdrücken können. Indirubin wurde als Hauptwirkstoff von Dangui Longhui Wan, einem Mittel der Traditionellen Chinesischen Medizin identifiziert, welches in China zur Behandlung vieler Krankheiten wie Leukämie benutzt wurde. Indirubine wurden als potente ATP-kompetitive CDK-Inhibitoren identifiziert, die in der ATP-Bindungstasche binden, Apoptose induzieren und das Wachstum von Tumorzellen effizient hemmen. Darüber hinaus zeigten Indirubin-Derivate Hemmwirkungen auf eine ganze Reihe anderer Kinasen wie z. B. GSK-3ß, VEGFR und c-Src, die beim Tumorzellwachstum eine entscheidende Rolle spielen. Ziel war es, Substituenten am Indirubingrundgerüst in die 5-, 5’- und 3’-Position einzuführen, um die Wasserlöslichkeit weiter zu verbessern, die metabolische Stabilität zu erhöhen, ohne jedoch Antitumorwirksamkeit abzuschwächen. Durch Einführung weiterer N-Atome in das Indirubingrundgerüst sollten CYP450-induzierte Hydroxylierungen am Kern vermieden werden, die zur Wirkungsabschwächung führten, wie frühere Arbeiten gezeigt haben. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 19 neue Indirubin-Derivate und 3 neue Aza- und Diazaindirubine hergestellt und mittels CHN-Analyse und NMR-spektroskopisch charakterisiert. Für das bei der Kondensation zu 7-Aza- und 7,7’-Diazaindirubin benötigte 7-Azaisatin wurde eine neue Synthesemethode entwickelt. Die Wasserlöslichkeit der neuen Indirubine wurde photometrisch und ihre Zytotoxizität mit Hilfe von SRB-Assays an LXFL529L-Tumorzellen bestimmt. Durch Inkubation mit Rinderlebermikrosomen wurde der Phase-I-Metabolismus von Indirubin-5- carboxamiden und Indirubin-3’-oximethern untersucht. Die Hauptmetaboliten von E748, E857, E857a, E860 und E860a wurden mittels HPLC, HPLC-NMR und LC-MS/MS identifiziert. Weitere Untersuchungen zum Wirkmechanismus ausgewählter neuer Verbindungen, wie z. B. die Hemmung von Topoisomerasen und die Erstellung eines Hemmprofils an 30 verschiedenen Kinasen wurden durch andere Institute durchgeführt. Im Vergleich zu Indirubin-5-carboxamiden zeigen Indirubin-5’-carboxamide mit gleichem Substituenten eine 2 – 15 fache schwächere Wachstumshemmung an LXFL529L-Zellen und trotz basischem Zentrums auch keine signifikant verbesserte Wasserlöslichkeit. 5,5’-Disubstituierte Indirubine mit Carboxyl- oder Carboxamid- Gruppe als Substituent zeigten sogar bis zu einer Konzentration von 100 &#956;M keine Hemmwirkung mehr. Eine Erklärung hierfür könnte der knapp bemessene Raum der ATP-Bindungstasche im Bereich der 5’-Position sein. Die Oximether E857 und E860, sowie die Hydrochloride E857a und E860a zeigten eine sehr potente Proliferationshemmung an LXFL529L-Zellen mit IC50-Werten von ca. 1 &#956;M. Die Hydrochloride wiesen hervorragende Werte für die Wasserlöslichkeit mit über 25000 mg/L auf, so dass in vivo Applikationen ohne weitere Formulierungen durchführbar sind. 7,7’-Diazaindirubin (E864) zeigte eine äußerst potente Wachstumshemmung von humanen Tumorzellen. Die IC50-Werte im SRB-Assay von E864 lagen im unteren nanomolaren Bereich an verschiedenen Tumorzellen. 7-Azaindirubin (E866) zeigte im Vergleich mit Indirubin eine erhöhte Wasserlöslichkeit und verbesserte antiproliferative Wirkung, insbesondere löst es sich in vielen organischen Lösungsmitteln. E865 ist das 7’-Aza-Analoge von E857, einem 3’-Oximether mit basischen Zentrum und zeigt 7-fach verbesserte Wasserlöslichkeit ohne Abschwächung der Hemmwirkung an der Tumorzelllinie LXFL529L. Ergebnisse des Kinaseprofilings ergaben jedoch, dass die ATP-Bindungsstelle von Proteinkinasen vermutlich nicht das Haupttarget dieser Wirkstoffe sind. Beim Testen von 277 Proteinkinasen konnte keine Proteinkinase als Target für E864, dem potentesten Inhibitor der Tumorzellproliferation, identifiziert werden. Bei Inkubationen mit Rinderlebermikrosomen von E748, einem Indirubin-5- carboxamid, fand eine Hydroxylierung an der 7’-Position statt. Weil eine Hydroxylierung an dieser Position eine Bindung des Moleküls in der ATP-Bindungstasche erschwert oder verhindert, ist der Metabolit vermutlich ein schwächerer Tumorzellwachstumsinhibitor. Zur Vermeidung einer derartigen Hydroxylierung erschien es sinnvoll, die Substituenten zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit in 3’-Position anzubringen, was die Ergebnisse der Metabolisierung von E857 und E857a bestätigten. Nach Inkubation mit Lebermikrosomen fanden die Metabolisierungen nicht am Indirubin-Gerundgerüst statt. Als Hauptmetaboliten konnten das N-oxid (E867) und ein Hydroxymethylpiperazin-Derivat identifiziert werden. Das Kinaseprofiling, das Rückschlüsse auf den Wirkmechanismus ermöglicht, zeigte, dass E857 nicht nur CDKs und GSK-3ß hemmt (IC50 = 1-10 &#956;M), sondern auch andere für eine Tumorentstehung relevante Targets wie z. B. FAK und IGF1-R (IC50 < 1 &#956;M). Damit scheinen E857 und E857a die bisher am besten geeigneten Indirubine für eine Weiterentwicklung zum Antitumortherapeutikum zu sein und weitere Untersuchungen sollen in vivo durchgeführt werden, um die Ergebnisse mit den in vitro-Daten zu vergleichen und abzusichern.

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Metadaten
Author:Cheng Xinlai
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-23853
Advisor:Gerhard Eisenbrand
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2009
Year of Publication:2009
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2009/09/07
Tag:Azaindirubin ; Proteinkinaseinhibitor
Azaindirubin ; Cytotoxicity ; Indirubin ; Metabolism ; solubility
GND-Keyword:Chemisc; Chemische Analyse ; Cytotoxizität ; Enzyminhibitor ; Indigorot ; Inhibitor ; Löslichkeit ; Stoffwechsel ; Tumorassoziierter Trypsininhibitor
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Patent Number:EP 08 022 288.8-2101
Patent Year applied:0000

$Rev: 12793 $