Charakterisierung DNA-schädigender Wirkungen mittels Comet Assay und hPRT-Genmutations-Assay: Ein Vergleich zwischen alpha, beta-ungesättigten Carbonylverbindungen, Epoxiden und N-Nitroso-verbindungen

Characterisation of DNA-damaging potential using comet assay and hPRT-genmutation assay: A comparison between alpha, beta-unsaturated carbonyl compounds, epoxides and N-nitroso compounds

  • Acrylamid (AA) ist ein Kanzerogen, das beim Braten, Backen und Frittieren stärkehaltiger Le-bensmittel im Wesentlichen aus dem Vorläufer Asparagin in Gegenwart reduzierender Zucker in substantiellen Mengen gebildet wird. AA wird im Organismus metabolisch zu Glycidamid (GA) umgewandelt. Für GA wurden DNA-Addukte insbesondere mit dem N7 des Guanins nachgewiesen. Von besonderem Interesse für die Risikobewertung von AA ist Aufklärung des kanzerogenen Wirkmechanismus sowie des genotoxischen Potentials im Vergleich zu anderen bekannten Kanzerogenen. Ziel der Arbeit war es daher, das genotoxische Potential von AA und seinen Metaboliten GA sowie deren genotoxischen Wirkmechanismus zu charakterisieren. AA wurde im Vergleich zu den alpha, beta-ungesättigten Carbonylverbindungen Acrolein (Ac) und Hexenal (Hex) getestet, GA vergleichend zu aktiven Formen der Kanzerogene Benzo[a]pyren (B[a]P) und N-Nitrosodiethanolamin (NDELA) sowie den N-Nitrosoharnstoffen MNU und HENU und ausgewählten N-Nitroso-oxazolidinonen, einer Gruppe von N-Nitrosaminen, welche möglicherweise endogen im Organismus gebildet und nach Hydrolyse in ihre biologisch aktive Form überführt werden. Humanes Vollblut, isolierte Lymphozyten sowie V79-Säugerzellen wurden als Testsysteme verwendet. Als Endpunkte der Genotoxizität wurde die Induktion und Kinetik der Abnahme von DNA-Strangbrüchen sowie der Einfluss von Glutathion auf die DNA-Strangbruchinduktion im Comet Assay bestimmt. Die Sensitivität und Selektivität des Comet Assays wurde durch zusätzliche Behandlung der DNA mit dem DNA-Reparaturenzym Formamido-pyrimidin-DNA-glykosylase (FPG) gesteigert. FPG erkennt AP Stellen, ring-geöffnete Pyrimidine sowie oxidierte Purine und überführt diese in zusätzliche DNA-Strangbrüche. Das mutagene Potential der Verbindungen nach 5-tägiger Expressionszeit wurde in V79 Zellen mittels hPRT-Genmutations-Assay untersucht. AA erwies sich in allen Testsystemen als nicht genotoxisch. Die im Vergleich getesteten alpha, beta-ungesättigten Carbonylverbindungen Ac und Hex waren ebenfalls in humanem Vollblut nicht genotoxisch, verursachten jedoch in isolierten Lymphozyten in hohen Konzentrationen(> 3000 µM) DNA-Strangbrüche. GA war in allen Testsystemen genotoxisch. Im Comet Assay ohne FPG zeigten sich DNA-Strangbrüche ab 300 µM (1h). Nach zusätzlicher Behandlung der DNA mit FPG wurden bereits ab 10 µM (4h) DNA-Strangbrüche detektiert. DNA-Schäden waren erst ab einer Inkubationszeit von einer Stunde signifikant und erreichten nach 24h ein Maximum. GA induzierte in V79 Zellen zudem erst in 80-fach höheren Konzentrationen hPRT-Mutationen (800 µM) als DNA-Strangbrüche. Zusätzlich zeigte sich, dass die Mutationsrate erst in Konzentrationen signifikant erhöht war, in denen eine Reduktion der DNA-Schäden nicht mehr effektiv erfolgte. Die Genotoxizität von GA beruht vermutlich auf der präferentiellen Bindung an N7-Guanin. Die entstehenden N7-G-Addukte werden entweder spontan zur AP Stelle depuriniert oder zum Formamido-pyrimidin ring-geöffnet. Beide Arten von Folgeprodukten sind FPG-Substrate und werden vermutlich effizient repariert, sodass es erst bei hohen lokalen Konzentrationen (> 800 µM) zu einer signifikanten Ausprägung von Mutationen kommt. Die im Vergleich zu GA getesteten Kanzerogene (±)-BPDE und alpha-Acetoxy-NDELA waren im Comet Assay bei ähnlichen Konzentrationen genotoxisch (10-30 µM; 1h). Im Gegensatz zu GA induzierten beide allerdings hPRT-Mutationen (3-10 µM) im gleichen Konzentrationsbereich wie DNA-Strangbrüche. Ähnliche genotoxische Eigenschaften zeigten auch die im Vergleich zu GA getesteten N-Nitrosoverbindungen. Die Gruppe der N-Nitroso-oxazolidinone wurde erstmals im Hinblick auf Genotoxizität und Mutagenität geprüft. NOZ-2 induzierte in V79 Zellen bereits nach 15’ ab 3 µM maximal DNA-Strangbrüche. HENU induzierte DNA-Strangbrüche ab 100 µM (15’). In beiden Fällen hatte FPG keinen Einfluss auf die DNA-Strangbruchinduktion. Sowohl NOZ-2 als auch HENU sind hydroxyethylierend. Im Gegensatz dazu, waren das carboxymethylierende oder methylierende NOZ-5 und das methylierende MNU im Comet Assay ohne FPG nur gering aktiv (> 300 resp. 1000 µM; 15’), während nach FPG-Behandlung die Aktivität im Comet Assay (NOZ-5: >10µM; MNU: >100µM; 15’) deutlich gesteigert war. Die Kinetik der Abnahme von DNA-Strangbrüchen ist für die Verbindungen unterschiedlich. Während die NOZ-2-induzierten DNA-Läsionen (30µM) persistieren, wurden die durch NOZ-5 und HENU induzierten DNA-Schäden -vergleichbar mit GA- effektiv innerhalb einer 8-stündigen Nachbehandlungszeit reduziert. Für alle untersuchten N-Nitrosoverbindungen waren hPRT-Mutationen im gleichen Konzentrationsbereich wie DNA-Strangbrüche im Comet Assay mit FPG nachweisbar. Die N-Nitrosoverbindungen sind damit insgesamt deutlich potenter mutagen als GA. NOZ-2 und HENU führen vermutlich vergleichbar mit alpha-Acetoxy-NDELA zu einer Hydroxyethylierung der DNA-Phosphodiester. Die resultierenden Phosphotriester sind instabil und werden voraussichtlich schnell in DNA-Strangbrüche gespalten. Des Weiteren ist die Bildung instabiler N7-G- und promutagener O6-G-2-Hydroxyethyl-Addukte zu erwarten. Das potentiell DNA-carboxymethylierende/methylierende NOZ-5 und das DNA-methylierende MNU alkylieren ver-mutlich die gleichen Positionen in der DNA. Allerdings scheinen die gebildeten Methyl- oder Carboxymethyl-Phosphotriester stabil zu sein und werden nicht spontan in Strangbrüche überführt. Die gebildeten N7-G-Addukte sind FPG-Substrate, was sich am FPG-vermittelten Anstieg der DNA-Strangbruchrate zeigt. Dies steht im Gegensatz zu NOZ-2, bei welchem FPG keinen Einfluss auf die DNA-Strangbruchinduktion hatte. Vermutlich ist dies auf die Hydroxyethylierung der Phosphat-Gruppen durch NOZ-2 zurückzuführen, deren spontane DNA-Strangbruch-Induktion den Nachweis von N7-G-Addukten mittels FPG überlagert. Weiterhin zeigte sich, dass trotz vergleichbar hoher hPRT-Mutagenität, NOZ-5-induzierte DNA-Schäden deutlich geringer persistent als entsprechende NOZ-2-Läsionen sind. Das mutagene Potential von NOZ-5 ist daher vermutlich, neben anderen nicht reparierten DNA-Schäden, auf promutagene O6-G-Addukte zurückzuführen, welche in MGMT-defizienten V79 Zellen nicht repariert werden. Orientierend wurde der Einfluss detoxifizierender Makromoleküle auf die Genotoxizität von GA und alpha, beta-ungesättigten Carbonylverbindungen durch Vergleich der Aktivitäten in humanem Vollblut und isolierten Lymphozyten sowie durch Co-Inkubation mit Glutathion (GSH) in V79 Zellen untersucht. Während Ac und Hex in isolierten Lymphozyten deutlich potenter DNA-schädigend als in humanem Vollblut sind, ist GA in beiden Systemen vergleichbar genotoxisch. Offensichtlich wird in humanem Vollblut die Aktivität von GA durch detoxifizierende Blutbestandteile nur unwesentlich beeinflusst. Ein entsprechender Effekt zeigt sich auch bei der Co-Inkubation von V79 Zellen. Während GSH die DNA-schädigende Wirkung von Ac und Hex in V79 Zellen deutlich reduzierte, war für GA kein signifikanter Unterschied zur DNA-Strangbruchrate in ausschließlich GA-behandelten Zellen nachzuweisen. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass AA selbst nicht genotoxisch bzw. mutagen ist; Ac und Hex in humanem Vollblut ebenfalls nicht genotoxisch sind, allerdings in isolierten Lymphozyten bei hohen Konzentrationen (> 3000 µM) Genotoxizität induzieren; die genotoxische/ mutagene Wirkung von AA durch GA vermittelt wird; GA im Vergleich zu anderen potenten Kanzerogenen Genotoxizität nur sehr langsam induziert (signifikant nach 1h) und eher schwach mutagen ist; GA-induzierte DNA-Läsionen schnell (innerhalb von 8h) repariert werden;die physiologische Umgebung in Humanblut nur geringen Einfluss auf die biologische Aktivität von GA hat; NOZ-2 vergleichbar mit HENU mit und ohne FPG-Behandlung signifikant DNA-Strangbrüche erzeugt. Vermutlich führt die Hydroxylierung am Phosphat-Rückgrad zu spontanen Strangbrüchen, die den FPG-Effekt überlagern; NOZ-5 (vermutlich methylierend oder carboxymethylierend im Comet Assay) im Gegensatz dazu ohne FPG-Behandlung im Comet Assay nur schwach aktiv ist, während nach FPG-Behandlung offenbar die vermutete Bildung von N7-G-Addukten zum Tragen kommt; NOZ’s in V79-Zellen potente Mutagene sind; dies vermutlich in Folge von O6-Guanin-Addukt-Bildung, welche in MGMT-defizienten V79 Zellen nicht repariert werden; durch Kombination unterschiedlicher Protokolle des Comet-Genotoxizitäts- und hPRT-Mutagenitätstests orientierende Aussagen über den Zusammenhang zwischen DNA-Alkylierung, Detoxifizierung, DNA-Reparatur und der Entstehung von Mutationen gemacht werden können.

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Metadaten
Author:Silke Thielen
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-21561
Advisor:Gerhard Eisenbrand
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2007
Year of Publication:2007
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2007/12/13
Tag:DNA-Schädigung; Epoxide; N-Nitroso-verbindungen; alpha; beta-ungesättigte Carbonylverbindungen; hPRT-Genmutations-Assay
GND-Keyword:Acrylamid; Comet Assay
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften

$Rev: 12793 $