Entwicklung und Anwendung von Optimierungsstrategien in der Marinen Biotechnologie unter besonderer Berücksichtigung der Charakterisierung einer Tryptophan-5-Halogenase

  • Die enorme Nachfrage nach neuartigen Naturstoffen sowie Leitstrukturen für die (Teil-) Synthese pharmazeutischer Produkte verlangt ständig nach neuen Innovationen. Ein bedeutender Impuls ist dabei von der Marinen Biotechnologie zu erwarten, die seit einigen Jahren versucht, die sich bietenden medizinischen Potentiale auszuschöpfen. So können neuartige Wirkstoffe bzw. die für deren Produktion verantwortlichen Organismen und Enzyme isoliert und bereitgestellt werden. Häufig ist das Wachstum der Organismen jedoch stark limitiert sowie eine Produktion der Ziel-Metabolite nur unter bestimmten Bedingungen möglich, weshalb ein enormes Interesse an neuen Optimiermethoden zur Lösung des Problems besteht. Neuartige Lösungsansätze sollten daher im Rahmen dieser Arbeit verfolgt werden. Untersucht wurde eine „biochemische“ Wachstums- und Produktionsoptimierung mariner Bakterien durch einen Zusatz von Homoserinlactonen zum Kultivierungsmedium. Dabei konnte neben einem verbesserten Wachstum diverser Prokaryonten eine leichte Variation im Metabolitspektrum ermittelt sowie eine geringfügig erhöhte Produktion biologisch aktiver Substanzen detektiert werden. Soll das Wachstum von (marinen) Mikroorganismen optimiert werden, wird vom Anwender häufig eine unstrukturierte one-factor-at-a-time-Methode angewendet. Da diese in der Regel keine Beeinflussung der zu optimierenden variablen Parameter beachtet, wurden in dieser Arbeit alternativ rechnergestützte Optimierungen zur Umgehung dieses Problems durchgeführt. Zum Einsatz kam dabei eine Kombination aus einem Genetischen Algorithmus, welcher die Identifikation des globalen Optimums erlaubt und einem Simplex-Algorithmus, der zur Verfeinerung des bereits aufgefundenen Optimums dient. Hiermit konnte die Produktion einer marinen L-Serindehydratase im Rahmen einer Nährmediumsoptimierung um mehr als 50 % im Vergleich zum Referenzmedium gesteigert werden. Des Weiteren wurde ein im Polyketidscreening positiv aufgefallenes Bakterium (Halomonas marina) als Modellorganismus für ein neuartiges rechnergestütztes Verfahren eingesetzt, welches eine schnelle Identifizierung der Güte von Wachstumsparametern erlaubt und dabei eine repetitiv geführte Batch-Betriebsweise von Bioreaktoren nutzt. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit ist die Charakterisierung einer rekombinant exprimierten Tryptophan-5-Halogenase. Hierbei konnte nach der Identifizierung des Aktivitätsoptimums hinsichtlich des einzustellenden pH-Werts sowie der Temperatur die Halbwertszeit des Enzyms bei verschiedenen Temperaturen bestimmt und mittels 2 D-Gelelektrophorese der pI-Wert des Enzyms erstmalig determiniert werden. Ein Fokus dieser Untersuchungen lag auf der Optimierung der Enzymkinetik. Dabei konnte insgesamt eine Verbesserung der Ausbeute um den Faktor 1,6 erzielt werden.
  • Pharmaceutical research programms demand for new pharmaceutical leads as well as novel biologically active natural products and enzymes which are responsible for their production. Hereby, marine biotechnology can act as supplying technology platform to fulfill these special requirements. However, a couple of organisms, enzymes and pharmaceutically interesting secondary metabolites can be supplied by marine biotechnologists. Unfortunately, rates of growth and production are usually low. Therefore an increasing request for new techniques and methods exists to circumvent this situation. One part of this work focuses on a “biochemical” optimization of growth and active natural metabolite production by supplementation of well known autoinducer substances (different homoserine lactones) to the fermentation medium. By this, some prokaryotes were cultivated with increased growth rates and additionally a variation in natural product synthesis was detected. The provided optimization techniques and methods by process engineers are manifold. Nevertheless the frequently applied procedure for optimization is the classical one-factor-at-a-time-method with all its taints. Meaningful is the non-observance of influences which different parameters can have on each other in relation to the target function. To accomplish a more structured process this work focuses on computer aided methods as well. For this strategy a combination of two algorithms was used, during the first step an identification of the global optimum is intended to be accomplished by a genetic algorithm and the subsequently application of a simplex algorithm is meant to refine the already found conditions. By such an approach the composition of the fermentation medium for production of a L-serine dehydratase was optimized and the objective function could be enhanced of more than 50 % compared to the reference composition. Furthermore, a marine bacterium Halomonas marina, which was formerly identified as a potential producing organism of a polyketide synthase, was used as a test organism in a novel computer-aided fermentation approach. By this repetitive fermentation modus of a batch reactor the assessment of the adjusted cultivation parameters could be performed within a minimum of time. Another central aspect of this work deals with the characterization of a recombinantly produced FADH2-dependent tryptophan-5-halogenase. In the first instance the optimal pH and temperature were identified, thus the half-time of the enzyme could be determined for different temperatures. The application of a two-dimensional SDS-PAGE allowed the determination of the enzyme´s pI for the first time. A focal point was the optimization of the enzyme´s kinetic. In comparison with formerly studies the product formation was enhanced by the factor 1.6.

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Metadaten
Author:Kai Muffler
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-21226
Advisor:Roland Ulber
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2007
Year of Publication:2007
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2007/07/11
Tag:Genetische Algorithmen; Halogenasen; Marine Biotechnologie; Quorum Sensing; Repeated-Batch; Simplex-Algorithmus
genetic algorithms; halogenases; marine biotechnology; quorum sensing; repeated batch cultivation; simplex algorithm
GND-Keyword:Biokatalyse; Biotechnologie ; Kultivierung ; Optimierung ; Tryptophan-Halogenasen
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Maschinenbau und Verfahrenstechnik
DDC-Cassification:620 Ingenieurwissenschaften und zugeordnete Tätigkeiten

$Rev: 12793 $