Struktur und Wirkung von Metaboliten indigoider Bisindole, neuartiger Hemmstoffe von Cyclin-abhängigen Kinasen

  • Die Substanzklasse der Indirubine stellen u.a. potente Hemmstoffe der Cyclin-abhängigen Kinasen dar, die eine Schlüsselfunktion in der Regulation des Zellzyklus besitzen. In Vitro zeigen sie eine Wachstumshemmung am isolierten CDK-Enzym und in verschiedenen Tumorzelllinien. In einem ersten in vivo-Versuch an athymen Nacktmäusen, mit subkutan implantiertem Tumorxenograft des Lungenkarzinoms LXFL529, bewirkte 5-Methylindirubin 6 einen Stillstand des Tumorwachstums. Als Konsequenz zum in vivo Versuch wurde in dieser Arbeit der in vitro Metabolismus von 5-Methylindirubin 6 durch Inkubation mit verschiedenen tierischen Lebermikrosomen untersucht. Anschließende Identifizierung, Synthese und biologische Tests der Metaboliten sollen Aufschluss über ihr Wirkpotential geben. Hierzu wurde eine HPLC-MS-Methode entwickelt, mit der es gelang entstandene Metaboliten zu trennen und gleichzeitig strukturelle bzw. Massen-Veränderungen der Ausgangsverbindung zu erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass 5-Methylindirubin durch Inkubation mit 6 Rinderlebermikrosomen zu fünf Metaboliten umgesetzt wurde, von denen vier identisch mit den Metaboliten aus den Inkubationen mit Schweinelebermikrosomen- und Aroclor-induzierten Rattenlebermikrosomen sind. Aus den aufgenommen Massenspektren wurden zwei generierte Metaboliten als mögliche mono-hydroxylierte Strukturisomere der Ausgangsverbindung und ein Metabolit als mögliche Di-Hydroxy-Verbindung von 5-Methylindirubin 6 identifiziert. Des Weiteren wurden 5-Bromindirubin 39, 5-Methoxyindirubin 40 und Indirubin-3’-(2-hydroxyethyl)oximether 10 als nicht-glycosodische Indirubin-Derivate und die glycosidischen Verbindungen Indirubin-3’-(2-β-D-glucopyranosylethyl)oximether 15, sowie die zu 15 entsprechenden 5-Iod und 5-Methyl-Verbindung (41 und 16) in Inkubationen mit Aroclor-induzierten Rattenlebermikrosomen untersucht. Für sämtliche Verbindungen konnte die Bildung mehrerer Metaboliten nachgewiesen werden, wobei die zugehörigen MS-Daten, wie bei 5-Methylindirubin 6, Hinweise auf eine Mono- bzw. Di-Hydroxylierung des Grundgerüsts der Ausgangsverbindung lieferten. Zusätzlich konnte aus den Daten der Inkubation mit Aroclor-induzierten Rattenlebermikrosomen einen Hinweis auf die Umsatzgeschwindigkeit der getesteten Indirubine erhalten werden. Es ergab sich folgende Reihenfolge der Umsatzgeschwindigkeit: 5-Methylindirubin 6 > 5-Methoxyindirubin 40 >> 5-Bromindirubin 39 > 5-Iodindirubin-3’-(2-β-D-glucopyranosylethyl)oximether 41 > Indirubin-3’-(2-β-D-glucopyranosylethyl)oximether 15 > 5-Methylindirubin-3’-(2-β-D-glucopyranosylethyl)oximether 16. In einem zweiten Teil der Arbeit wurde durch spezielle dünnschichtchromatographische Trennung die Inkubation von 5-Methylindirubin und Aroclor-induzierten Rattenlebermikrosomen aufgearbeitet. Die so isolierten Metaboliten M2 und M3 wurden mittels 1H-NMR als 6-Hydroxy-5-methylindirubin 74 = M2 und 6,7’-Dihydroxy-5-methyl-indirubin 75 = M3 identifiziert. Um eine Aussage über das biologische Wirkpotential der beiden Metaboliten zu erhalten, wurden diese synthetisiert und anschließend einem ersten biologischen Tests unterworfen. Zur Darstellung von M2 wurde käufliches Indoxyl-3-acetat mit 6-Hydroxy-5-methylisatin nach einer modifizierten Methode von Russell und Kaupp umgesetzt. Das benötigte Isatin wurde aus einem geeigneten acylierten Anilin mittels regiospezifischer Metallierung (DOM-Reaktion) und anschließender Umsetzung mit Diethyloxalat selbst hergestellt. Für die Synthese des zweiten Metaboliten M3 wurde ein Syntheseweg erstellt indem aus einer geeigneten N-Phenyl-glycin-o-carbonsäure 103 ein Diacetylindoxyl 104 erzeugt wurde, das selektiv in ein N-Acetylindoxyl 106 überführt wurde. Anschließend wurde durch saure Kondensation mit 6-Hydroxy-5-methyl-isatin 76 das gewünschte 6,7’-Dihydroxy-5-methyl-indirubin 75 erzeugt. Die beiden so erhaltenen Metaboliten M2=74 und M3=75 wurden schlussendlich auf ihre Hemmwirkung im SRB-Test an den beiden Zelllinien LXFL529L (humaner grosszelliger Lungentumor) und C6 (Rattenglioblastom) getestet. Es zeigte sich, dass die erzeugten Metaboliten das Wachstum der Tumorzelllinie LXFL529L deutlich weniger hemmt als die Ausgangsverbindung 5-Methylindirubin 6. Offenbar stellen die von 5-Methylindirubin 6 durch Mikrosomeninkubation generierten Metaboliten M2 und M3 in den getesteten Tumorzelllinien keine aktivere Wirkform dar.

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Metadaten
Author:Frankie Hippe
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-21112
Advisor:Gerhard Eisenbrand
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2006
Year of Publication:2006
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2006/01/19
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften

$Rev: 12793 $