Evaluation of the short interfering RNA method as a tool in mechanistic toxicology

Untersuchungen zur Anwendbarkeit der siRNA-Methode in der mechanistischen Toxkologie

  • The RNAi method plays a great role in target validation in drug discovery. However its usage for toxicology has not been systematically investigated. The aim of this work was to evaluate the RNAi-method for toxicological mechanistic studies and to demonstrate the impact of gene-silencing on biochemical cellular endpoints. SiRNAs were selected by a computer-supported algorithm. Efficient and reproducible delivery of siRNAs to the target cells in vitro was achieved by electroporation. The molecular knockdown of the target was monitored by mRNA- and protein expression or protein activity between 24 and 144 hours after treatment. SiRNAs were tested in vitro before application in vivo. Intraperitoneal administration of siRNA was evaluated versus hydrodynamic injection into the tail vein as a method for in vivo targeting of the liver. The following enzymes were targeted by RNAi in cell culture: ATP synthase in HepG2, farnesylpyrophosphate-synthase (FPPS) in human kidney (HK-2) cells and caspase-3 in rat primary hepatocytes. In all experiments, RNAi decreased mRNA levels and protein expression or enzymatic activities, which demonstrates the successful gene silencing. The silencing of the mitochondrial F1-ATP synthase β-subunit had no significant influence on the survival and energy metabolism of HepG2-cells. Although Oligomycin B-treatment resulted in ATP depletion and loss of mitochondrial membrane potential, the silencing did not sensitise the cells towards Oligomycin B- or Diclofenac-induced alterations of mitochondrial functions and cytotoxicity. Silencing of ATP synthase in HepG2 cells resulted in a similar transcriptional signature as Diclofenac treatments in vivo, suggesting a potential link between ATP synthase and Hepcidin, BiP and ALAS-1 by co-regulation. The FPPS silencing resulted in tendentially increased cytotoxicity of Zoledronic Acid, but had no influence on the prenylation status of small GTPases. The caspase-3/-7 inhibitor Ac-DEVD-CHO inhibited SDZ-IMM 125-mediated apoptosis. Specific gene silencing of caspase-3 resulted in reduction of SDZ IMM125-induced caspase-activation, while silencing of caspase-7 had no influence in this regard. The threshold effect of gene silencing was assessed by comparing caspase-3 silencing with the chemical caspase-inhibitor Ac-DEVD-CHO on caspase-3 activities and potential cytoprotective effects. The effect of caspase-3 silencing was equivalent to the activity of 1 μM inhibitor. The inhibitor-mediated protection on SDZ-IMM125-induced cytotoxicity was exclusively achieved at higher inhibitor concentrations, indicating that the achieved silencing effect was not sufficient for cytoprotection. In general, siRNAs have higher specificity compared to enzyme inhibitors. Chemical inhibitors are less specific and can influence enzymatic activities quantitative, in many cases irreversible and fast, thus interfering directly with the targeted pathways. SiRNAs differ in this respect, since decreases in protein expression are incomplete, only transient and slow over a period, during which cells can adapt by compensatory mechanisms and by which primary effects can be masked. Gene silencing in the liver of CD-1-mice by means of hydrodynamic injection of non-complexed chemically stabilised siRNA was possible and decreased CYP2E1 protein expression significantly. Single or repeated high-dose intraperitoneal injection of siRNAs did not lead to significant effects on either mRNA- or protein level. Further research on stability and efficient delivery of siRNAs to the target cell is inevitable before in vivo gene silencing by means of siRNAs can be applied in mechanistic toxicology. In conclusion, in vitro siRNA application is a universal and suitable specific method, which can be used in many mechanistic toxicological studies as a tool for pathway analysis and target validation. The level of inhibition achieved by application of chemical inhibitors cannot be attained by means of siRNA-mediated gene silencing. In vivo gene silencing can be achieved, but the invasive hydrodynamic method of siRNA application is not suitable for animal toxicity testing. The delivery of siRNA to specific target organs needs significant improvement.
  • Die RNAi–Methode spielt eine grosse Rolle in der Wirkstoffentwicklung bei der Validierung eines pharmakologischen Ziels. Die Anwendbarkeit in der Toxikologie wurde noch nicht systematisch untersucht. Das Ziel dieser Arbeit ist die Evaluierung der RNAi-Methode für mechanistisch-toxikologische Studien und den Einfluss von posttranskriptioneller Genunterdrückung auf biochemisch-zelluläre Endpunkte zu zeigen. Die siRNAs wurden mit Hilfe eines computerunterstützten Algorithmus ausgewählt. Effiziente und reproduzierbare Einschleusung der siRNA in vitro wurde durch Elektroporation erreicht. Die molekulare Reduktion der Expression des Zielgens wurde auf mRNA- und Proteinexpressionslevel oder auf Proteinaktivitätsebene zwischen 24 und 144 Stunden nach Behandlung überwacht. Die siRNAs wurden in vitro getestet bevor sie in vivo angewandt wurden. Als Methode zum Erreichen der Leber in vivo wurde die intraperitoneale Gabe von siRNAs gegenüber hydrodynamischer Injektion in die Schwanzvene evaluiert. Auf folgenden Enzyme wurde mit RNAi in der Zellkultur abgezielt: ATP-Synthase in HepG2, Farnesylpyrophosphat-Synthase (FPPS) in humanen Nierenzellen (HK-2) und Caspase-3 in Primärhepatozyten der Ratte. In allen Experimenten war RNAi in der Lage, das mRNA- und Proteinexpressions- oder Proteinaktivitäts-Niveau zu reduzieren, wodurch die erfolgreiche Genunterdrückung gezeigt werden konnte. Die Unterdrückung der mitochondrialen ATP- Synthase β-Untereinheit hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Überlebensrate und den Energiestoffwechsel von HepG2-Zellen. Obwohl Oligomycin B-Behandlung zu ATP- Depletion und Verlust des mitochondiralen Membranpotentials führte, war keine Sensitivierung der Zellen gegenüber Oligomycin B- oder Diclofenac-induzierten Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials oder Zytotoxizität zu beobachten. Die Genunterdrückung der ATP-Synthase in HepG2-Zellen führte zu einer ähnlichen transkriptionellen Signatur wie Diclofenac-Behandlung in vivo, so dass eine mögliche Verbindung zwischen ATP-Synthase und Hepcidin, BiP und ALAS-1 durch Koregulation nahegelegt wird. Die Genunterdrückung von FPPS führte zu tendenziell erhöhter Zytotoxizität von Zoledronsäure, hatte aber keinen Einfluss auf den Prenylierungsstatus der kleinen GTPasen. Der Caspase-3/7-Inhibitor Ac-DEVD-CHO verhinderte SDZ IMM125-vermittelte Apoptose. Spezifische Genunterdrückung von Caspase-3 führte zur Reduktion der SDZ IMM125-induzierten Caspaseaktivität, während die Unterdrückung von Caspase-7 in dieser Hinsicht keinen Einfluss hatte. Die Effektschwelle des Genunterdrückung wurde durch Vergleich zwischen Caspase-3-silencing und Behandlung mit dem chemischen Caspase-Inhibitor Ac-DEVD-CHO auf Ebene der Caspase-3-Aktivität und der zytoprotektiven Wirksamkeit bestimmt. Der Effekt von Caspase-3-Unterdrückung war equivalent zur Wirkung von 1 μM Inhibitor. Die inhibitorvermittelte Schutzwirkung im Hinblick auf die Zytotoxizität wurde ausschliesslich bei höheren Inhibitorkonzentrationen erreicht, wodurch gezeigt wurde, dass die erreichte Genunterdrückung für zytoprotektive Wirkungen nicht ausreichend war. SiRNAs haben verglichen mit Enzyminhibitoren generell eine höhere Spezifität. Chemische Inhibitoren sind weniger spezifisch und können enzymatische Aktivitäten vollständig, in manchen Fällen irreversibel und schnell beeinflussen, so dass sie direkten Einfluss auf die zu untersuchenden Signalwege haben. SiRNAs unterscheiden sich in dieser Hinsicht, da die Abnahme des Proteins nicht vollständig, nur transient und langsam über eine Periode hinweg erfolgt, innerhalb welcher sich die Zellen durch kompensatorische Mechanismen anpassen und Primäreffekte maskiert werden können. Hydrodynamische Einschleusung von nicht-komplexierter siRNA in die Leber von CD-1-Mäusen war möglich und reduzierte die CYP2E1-Proteinexpression signifikant. Ein- oder mehrfache hochdosierte intraperitoneale Gabe von siRNA führte weder auf mRNA- noch auf Proteinebene zu signifikanten Effekten. Weitere Untersuchungen im Hinblick auf Stabilität und effiziente Einschleusung von siRNAs ist unvermeidlich, bevor siRNAs in vivo in der mechanistischen Toxikologie angewandt werden können. Zusammenfassend kann ausgesagt werden, dass die Anwendung von siRNAs in vitro eine universelle und spezifische Methode darstellt, welche in vielen mechanistisch-toxikologischen Studien als Werkzeug zur Signalweganalyse und zur Validierung von Zielproteinen eingesetzt werden kann. Die Stärke der enzymatischen Inhibition, die mit Hilfe eines chemischen Inhibitors erreicht werden kann, ist durch siRNA-vermittelte Genunterdrückung nicht zu erreichen. Genunterdrückung in vivo kann erreicht werden, doch die invasive hydrodynamische Methode ist nicht geeignet für Toxizitätsprüfungen im Tier. Die Einschleusung von siRNA in spezifische Zielorgane benötigt signifikante Verbesserung.

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Metadaten
Author:Christian Strupp
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-20916
Advisor:Armin Wolf
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2007
Year of Publication:2007
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2007/04/27
Tag:Caspase; Farnesylpyrophosphat-Synthase; RNAi; SDZ IMM125; hydrodynamische Injektion
electroporation; gene silencing; siRNA; transfection; zoledronic acid
GND-Keyword:Apoptosis ; Diclofenac ; Hepatotoxizität ; In vitro ; In vivo ; Leberepithelzelle ; Nephrotoxizit; RNS-Interferenz ; Toxikologie ; Wasserstoff-ATPase
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften

$Rev: 12793 $