Charakterisierung und Bedeutung von ausgewählten Transportproteinen für die Virulenz von phytopathogenen Bakterien und Pilzen

  • Durch vorangegangene Arbeiten wurden transgene Kartoffelpflanzen erzeugt, die eine verringerte Aktivität des plastidären ATP/ADP Transporters aufweisen (NTT-antisense). Die Knollen dieser Pflanzen zeigen nicht nur veränderte Gehalte an Primärmetaboliten sondern auch eine erhöhte Pathogen-Resistenz, zum Beispiel gegen den bakteriellen Krankheitserreger Erwinia carotovora ssp. atroseptica (Eca). In diesem Zusammenhang deuten neuere Veröffentlichungen auf eine Bedeutung von Transportproteinen für Wirt-Pathogen Wechselwirkungen hin. Im Zuge dieser Arbeit konnte durch die Herstellung eines Systems zur gezielten Erzeugung von Eca „K.O.“-Mutanten die Bedeutung von ausgewählten Sequenzen, welche für Transportproteine kodieren, analysiert werden. Hierbei zeigte sich, dass im Bezug auf die Virulenz von Eca, sowohl der Prolin- als auch der d-Galaktonattransport nur von untergeordneter Bedeutung ist. In weiteren Untersuchungen wurde allerdings der Karbonsäuremetabolismus und -transport von Eca als zentrales Element in der Entfaltung maximaler bakterieller Virulenz erkannt. Hierbei wurde das Cit1-Protein als hoch-affiner Citrattransporter, welcher über die bakterielle pmf energetisiert wird, identifiziert. Dieses Protein ist für ein Wachstum von Eca auf Citrat als einziger Kohlenstoffquelle notwendig und essentiell zur Etablierung einer vollständigen Pathogenese auf Kartoffelknollenscheibchen. So weisen Eca cit1 „K.O.“-Mutanten im Vergleich zu Wildtyp Zellen nicht nur eine geringere pektolytische Aktivität und Gewebemazeration, sondern auch ein reduziertes in planta Wachstum, auf. Des Weiteren wurde ermittelt, dass sich NTT-antisense Gewebe nicht nur durch eine erhöhte Pathogen-Resistenz auszeichnet, sondern auch erniedrigte Citratgehalte aufweist. Analog führte eine artifizielle Erhöhung des Citratgehaltes durch Infiltration von Knollengewebe zu einer deutlich erhöhten Gewebemazeration durch Eca sowie einer verringerten Akkumulation von Abwehrrelevanten pflanzlichen Gentranskripten (PR-Gene). Weitere untersuchte Eca-Mutanten belegten, dass im gemeinsamen Wirken mit anderen enzymatischen Komponenten, Citrat ein ambivalentes Molekül für pflanzliche Resistenz und bakterielle Virulenz ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Transportproteine nicht nur für die Virulenz von Eca, sondern auch für phytopathogene Pilze wie Magnaporthe grisea, von Bedeutung sind. So konnte durch die Kooperation mit der AG Thines (IBWF) das Genprodukt eines bei Pathogenese induzierten Genes (rig2), biochemisch charakterisiert werden. Hierbei wurde mittels Komplementation einer Hefemutante (22∆8AA) nachgewiesen, dass es sich bei diesem Protein um einen Prolin-Transporter handelt. Diese Arbeit zeigt, dass Transportproteine als ein wichtiges Element in Wirt-Pathogen Beziehungen wirken können und eine Charakterisierung solcher Proteine zum Verständnis dieser Wechselwirkungen unerlässlich ist.
  • Transgenic potato tubers exhibiting reduced levels of the plastidic ATP/ADP transporter (NTT antisense) show altered primary metabolite levels and substantially increased resistance against the necrotrophic plant pathogen Erwinia carotovora ssp. atroseptica (Eca). Investigations by several research groups on erwinial gene transcription identified transportproteins as putative virulence factors. Analysis of specific Eca carriers by means of targeted mutagenesis relying on a newly developed knock-out system (this work) led to the conclusion that both proline and d-galactonate uptake are not essential for erwinial virulence on potato tuber discs. In similiar experiments Eca virulence seemed to depend on a functional carboxylate metabolism and uptake. Further investigations showed that citrate uptake plays a crucial role for Eca in establishing tissue maceration. To analyse the effect of citrate import into Eca cells on the bacterial virulence we studied the function of various carboxylate-carrier proteins. One of the corresponding, ECA3984, encodes a highly specific citrate transporter (EcaCit1) energised by the proton-motive force. Knock-out mutants lacking the functional EcaCit1 protein did not grow in medium containing citrate as the sole carbon source and showed a substantially reduced ability to macerate potato tuber tissue and a reduced in-planta growth. Furthermore we discovered that NTT-antisense tubers do not only display a enhanced pathogen resistance but also markedly decreased levels of citrate. Citrate feeding into both, Eca resistant (NTT-antisense) and wild type tuber tissue resulted in an increased maceration efficiency. In addition citrate feeding into wild type and NTT-antisense tuber tissue decreased the expression of pathogen related genes upon challenging the tuber tissue with elicitors of plant resistance. Therefore citrate uptake into Eca is critical for full bacterial virulence and low citrate levels in potato tuber tissue contribute to the resistance against this pathogen. The impact of transportproteins on virulence is not restricted to Eca but was also demonstrated for Magnaporthe grisea, the rice blast fungus. Specific genes of M. grisea induced upon pathogenesis and coding for transporters were characterised on the molecular and phytopathogenic level by the research group Thines (IBWF). In this work the biochemical characterisation of one of these carriers was achieved. By complementation studies on yeast mutants the Rig2 of M. grisea protein was identified to be a proline-carrier. The results of this work show that some transportproteins can be considered as virulence factors and that the characterisation of such proteins allows a deeper understanding of host-pathogen interactions and the involved key-metabolites.

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Metadaten
Author:Claude Urbany
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-20858
Advisor:H. Ekkehard Neuhaus
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2006
Year of Publication:2006
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2006/12/01
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Biologie
DDC-Cassification:570 Biowissenschaften; Biologie

$Rev: 12793 $