Differenzierung adulter Stammzellen nach Transplantation in die Leber immundefizienter Mäuse

  • Der Bedarf an Spenderlebern für die Behandlung akuter und chronischer Lebererkrankungen kann zurzeit nicht gedeckt werden. Insbesondere für metabolische Lebererkrankungen hat sich die Transplantation von Hepatozyten als Alternative zur Lebertransplantation erwiesen. Diese Therapie wird wegen Mangel an Hepatozyten ausreichender Qualität nicht flächendeckend eingesetzt. Falls es möglich wäre, Stammzellen zu Hepatozyten zu differen-zieren, könnte dies für die Behandlung von Lebererkrankungen einen erheblichen Fortschritt bedeuten. Eine von vielen Arbeitsgruppen verfolgte Strategie zur Beurteilung des Differenzie-rungspotentials hepatischer Vorläuferzellen ist die Transplantation in die Leber immundefi-zienter Mäuse. Die in der vorliegenden Arbeit verfolgte Strategie bestand darin, zunächst 750.000 zu beurteilende Zellen entweder direkt in das Parenchym des linken Leberlappens oder in die Milz zu injizieren. Die anschließende Analytik verfolgte folgende Ziele: i) Identi-fikation der transplantierten Zellen. Dies wurde durch den kombinierten Einsatz von CM-DiI und Sonden gegen humane Alu-Sequenzen erreicht. Hierbei markierte CM-DiI lediglich grob die Areale, in die transplantiert wurde. Die in situ Hybridisierung mit Alu-Sonden ermöglichte die konkrete Identifikation humaner Kerne. ii) Analyse der Expression hepatischer Faktoren, die von den ursprünglichen Stammzellen nicht gebildet wurden. Hierzu wurde ein für huma-nes Albumin spezifischer Antikörper eingesetzt. iii) Überprüfung, ob die human Albumin-positiven Zellen menschlichen Ursprungs sind. Hierzu wurde eine Kombination aus in situ Hybridisierung mit Alu-Sonden und Immunhistochemie gegen humanes Albumin etabliert. Als Positivkontrolle dienten in der vorliegenden Arbeit primäre humane Hepatozyten. Das Ergebnis nach Transplantation humaner Hepatozyten wurde mit dem Ergebnis nach Trans-plantation adhärent proliferierender Nabelschnurblutzellen, hepatopankreatischen Vorläufer-zellen und aus peripheren humanen Blutmonozyten in vitro ausdifferenzierten Neohepatozy-ten verglichen. Anhand positiver Rotfluoreszenz wurden bereits im paraffinisierten Schnitt die Be-reiche der transplantierten CM-DiI-markierten Stammzellen identifiziert. Durch die in situ Hybridisierung mit Mensch-spezifischen Alu-Sonden wurden in den CM-DiI-positiven Area-len Menschkerne nachgewiesen. Immunhistochemisch wurde in diesen Bereichen eine Ex-pression humanen Albumins gezeigt. Vom umgebenden Gewebe waren die identifizierten Zellen durch einen kleinen dezentral gelegenen Zellkern, geringe Zellgröße und einer Hepato-zyten unähnlichen Morphologie zu unterschieden. Diese Zellen traten in der Regel als kleine-re Zellagglomerate auf, die entweder in Gefäßen oder ohne Endothelabgrenzung im Gewebe zu finden waren. Bei der Auswertung weiterer auf humanes Albumin untersuchter Gewebe-schnitte wurde ein zweiter morphologisch unterschiedlicher Typ humanes Albumin-exprimierender Zellen gefunden. Dieser war durch eine perfekte Hepatozytenmorphologie mit großem, zentral gelegenem Kern und polygonaler Form der Zelle charakterisiert. Im Gewebe lagen diese Zellen vereinzelt, ohne immunhistochemische Detektion wäre eine Unterschei-dung von Maushepatozyten nicht möglich gewesen. Mit der in situ Hybridisierung wurde für diese Zellen ein Mauskern nachgewiesen. Der seltener auftretende Zelltyp mit perfekter He-patozytenmorphologie wurde als Typ I und der kleinzellige Zelltyp als Typ II bezeichnet. Bemerkenswert hierbei ist, dass die beobachteten Typen human Albumin-positiver Zellen nach Transplantation aller drei miteinander verglichenen Zelltypen nachweisbar waren. Eine mögliche Erklärung des Befundes der Typ II-Zellen besteht in einer teilweisen Differenzie-rung in Richtung Hepatozyte. Die menschlichen Zellen exprimieren zwar Albumin, nicht aber andere Faktoren wie CYP3A4, und nehmen keine hepatozelluläre Morphologie an. Ein über-raschender Befund war die Typ I-Zelle. Der Mechanismus, der in diesen Zellen zur Expressi-on humanen Albumins führt, ist zurzeit ungeklärt. Mithilfe des EROD-Assays wurde die metabolische Aktivität der CYP1A-Isoenzyme bei in vitro differenzierten Neohepatozyten bestimmt. Hierbei wurde ein zeitabhängiger Um-satz von EROD zu Resorufin beobachtet, der aber nicht durch 3-Methylcholanthren induzier-bar war. Damit fehlt den Neohepatozyten in diesem Punkt eine wichtige Eigenschaft primärer Hepatozyten. Allerdings sind durch publizierte Untersuchungen an Neohepatozyten weitere Hepatozyten-spezifische Parameter wie Harnstoffzyklus und Albuminproduktion belegt. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass nach Transplantation humaner Vor-läuferzellen verschiedenen Ursprungs ein qualitativ ähnliches Ergebnis mit zwei unterschied-lichen Typen human Albumin-positiver Zellen beobachtet wurde. Ob diese Zelltypen thera-peutisch nutzbar sind, bedarf weiterer Untersuchungen, beispielsweise mit Tiermodellen für menschliche Lebererkrankungen.

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Metadaten
Author:Marc Brulport
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-20441
Advisor:Gerhard Eisenbrand
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2006
Year of Publication:2006
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2006/09/07
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften

$Rev: 12793 $