Molekulare, biochemische und physiologische Eigenschaften von Transportproteinen der MCF (mitochondrial carrier family) aus Pflanzen und Protisten

Molecular, biochemical and physiological analysis of transport proteins belonging to the MCF (Mitochondrial Carrier Family) of plants and protists

  • Die Transportproteine AtER-ANT1 und OsER-ANT1 sind Vertreter der MCF (mitochondrial carrier family) und werden phylogenetisch in die Gruppe der klassischen mitochondrialen ADP/ATP-Transporter (AACs) eingegliedert. Unter Verwendung des heterologen E. coli-Expressionssystems konnte gezeigt werden, dass es sich bei AtER-ANT1 und OsER-ANT1 um spezifische ADP/ATP-Transporter handelt. Der Transport dieser Substrate verläuft in Form eines Gegentausches, entsprechend den klassischen mitochondrialen AACs. Sowohl AtER-ANT1 als auch OsER-ANT1 sind hochgradig insensitiv gegen die Hemmstoffe BKA und CAT der klassischen mitochondrialen AACs. Dagegen konnte für diese Transportproteine NEM (N-ethylmaleimid) als spezifischer Hemmstoff identifiziert werden, der interessanterweise auch eine inhibierende Wirkung auf den Nukleotidtransport ber die ER-Membran besitzt. Der Transport der klassischen mitochondrialen AACs wird dagegen nicht beeinflusst. Untersuchungen zur subzellulären Lokalisierung von AtER-ANT1 mittels GFP-Fusion ergaben, dass dieses Protein in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums lokalisiert ist. Weiter wurde eine Methode etabliert, die Lokalisierung des AtER-ANT1 in planta zu untersuchen. Durch Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation in Abhängigkeit der An- bzw. Abwesenheit von Mg2+ konnte die Lokalisierung des AtER-ANT1 im ER bestätigt werden. Weiter konnte mit diesem Gradienten auch eine Kolokalisierung des AtER-ANT1 mit dem ER-spezifischen Marker-Protein Calretikulin gezeigt werden. Eine Analyse der gewebespezifischen Expression offenbarte eine starke Expression des AtERANT1 in Geweben, die eine hohe ER-Aktivität aufweisen, u.a. die Wurzelspitze, die Leitgefäße, die Samen und die Pollengewebe. Desweiteren wurde die physiologische Rolle des AtER-ANT1 anhand von zwei unabhängigen Knockout-Linien bezüglich dieses Gens umfassend untersucht. Es konnte dabei gezeigt werden, dass der dramatisch im Wachstum retardierte Phänotyp der Knockout-Pflanzen unter ambienten Wachstumsbedingungen mit einer enormen Veränderung des gesamten Stoffwechsels einhergeht. Detaillierte Metabolit-Analysen zeigten außerdem, dass die Deletion des AtER-ANT1 Gens besonders starke pleiotrope Effekte auf den Photorespirationsstoffwechsel hat. Diese Beobachtungen wurden durch Analysen der Knockout-Pflanzen unter hoch CO2-Bedingungen bestätigt. Die hoch CO2-Bedingungen bewirkten sowohl eine Verbesserung des gesamten Stoffwechsels als auch der morphologischen phänotypischen Erscheinung der Knockout-Pflanzen. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit der Redundanz verschiedener AACIsoformen in Arabidopsis thaliana, die auf biochemischer Ebene sehr ähnliche Eigenschaften besitzen. Knockout-Analysen zeigten, dass AtAAC1 für den pflanzlichen Stoffwechsel essentiell ist, da das Ausschalten eine Letalität der Pflanzen hervorruft. Für AtAAC2 und AtAAC3 kann dahingegen eine physiologische Bedeutung in späten Entwicklungsstadien der Pflanze angenommen werden. Neben der Charakterisierung pflanzlicher Transportproteine wurde zudem ein mitosomaler Adeninnukleotid-Transporter aus dem Protisten Entamoeba histolytica biochemisch unter Verwendung des heterologen E. coli-Expressionssystems charakterisiert. Die Analysen ergaben, dass es sich bei diesem Adeninnukleotid-Transporter um ein zu den klassischen mitochondrialen AACs alternatives Transportprotein handelt, das sich sowohl im Substratspektrum als auch in Inhibitorstudien von bereits charakterisierten mitochondrialen und hydrogenosomalen ATP/ADP-Transportern unterscheidet. Mitosomen benötigen Energie u.a. zur Bildung von Fe-S-Clustern. Da diese Organellform im Gegensatz zu Mitochondrien und Hydrogenosomen nicht zu einer ATP-Synthese fähig sind, indizieren die ermittelten Daten eine physiologische Funktion dieses Proteins in der Versorgung der Mitosomen mit ATP.

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Metadaten
Author:Michaela Leroch
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-19771
Advisor:Horst Ekkehard Neuhaus
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2006
Year of Publication:2006
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2006/07/14
Tag:MCF ; Transport
MCF ; Transport
GND-Keyword:ATP ; ATP-Stoffwechsel; Endoplasmatisches Retikulum
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Biologie
DDC-Cassification:570 Biowissenschaften; Biologie

$Rev: 12793 $