Ermittlung und Charakterisierung neuer DNA-Bindungselemente des Glucocorticoidrezeptors in Glucocorticoid-reprimierten Zielgenen

  • Der Glucocorticoid-Rezeptor (GR), der zu den Steroidhormon-Rezeptoren zählt, reguliert physiologische Prozesse durch Aktivierung und Repression spezifischer Zielgene. Der ligandengebundene Rezeptor aktiviert die Genexpression, indem er als Dimer an spezifische DNA-Sequenzen (glucocorticoid response element, GRE) bindet. Der GR reprimiert seine Zielgene entweder durch Bindung an negative GREs (nGREs, Cis-Repression) oder durch DNA-unabhängige Bindung an andere Transkriptionsfaktoren wie AP-1 oder NF-(kappa)B (Trans-Repression). Glucocorticoide sind sehr effektive Medikamente für die Behandlung entzündlicher Erkrankungen. Langzeittherapie mit Glucocorticoiden ist jedoch problematisch wegen der auftretenden Nebenwirkungen. Bisher ging man davon aus, dass die anti-inflammatorischen Wirkungen der Glucocorticoide weitgehend über den Mechanismus der Trans-Repression reguliert werden, wohingegen die Nebenwirkungen vor allem durch DNA-bindungsabhängige Aktivierung (GRE) und Repression (nGRE) von Zielgenen vermittelt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die DNA-bindungsabhängige Cis-Repression untersucht. Dabei wurden sowohl neue nGRE-Bindungselemente identifiziert, als auch bereits bekannte Elemente hinsichtlich der involvierten Kofaktoren näher charakterisiert. Es wurde mit Hilfe des ABCD-Bindungstests die Affinität des GR zum DNA-Element in Abhängigkeit vom Ligandenbindungsstatus (Agonist, Antagonist, ohne Ligand) des Rezeptors untersucht. Der Rezeptor bindet das Konsensus-DNA-Element in vitro weitgehend unabhängig von dem eingesetzten Liganden. Der ABCD-Bindungstest wurde außerdem eingesetzt, um GR-Kofaktoren mittels Western Blot und Massenspektrometrie zu identifizieren. Der Korepressor N-CoR (nuclear receptor corepressor) bindet den GR-DNA-Komplex in vitro in Abhängigkeit vom Ligandenbindungsstatus. Massenspektrometrisch konnten mit dieser Methode Proteine wie Hsp90, Hsp70 und (beta)-Tubulin identifiziert werden. Die Konsensussequenz von nGREs weist erhebliche Unterschiede zu der klassischen GRE-Sequenz auf. Es konnte in vitro gezeigt werden, dass der GR zu nGREs eine deutlich niedrigere Bindungsaffinität hat als zu GREs. Derzeit geht man davon aus, dass die DNA die Konformation des Rezeptors durch allosterische Effekte moduliert. Mit Hilfe des partiellen Proteaseverdaus konnte ein Hinweis dafür erbracht werden, dass der Glucocorticoid-Rezeptor auf einem positive GRE in einer anderen Konformation vorliegt als auf einem negativen GRE, was in einem unterschiedlichen Bandenmuster resultiert. Die mRNA-Expressionsanalyse (Affimetrix) von T-Zellen aus GRwt- bzw. GRdim/dim-Mäusen ergab eine bisher unerwartete Rolle der DNA-abhängigen GR-Genregulation in der inflammatorischen Immunantwort (G. Schütz und P. Krammer, DKFZ). In der vorliegenden Arbeit wurden die Gene FasLigand (CD95L) und SOCS-3 bezüglich vorhandener nGREs sowohl in silico als auch in vitro analysiert. Die GR-vermittelte Repression des FasL spielt bei dem aktivierungs-induzierten Zelltod (AICD) eine Rolle. SOCS-3 blockiert die Wirkung von Zytokinen durch Inhibierung des JAK/STAT-Signaltransduktionsweges und ist in die Regulation der HPA-(hypothalamic-pituitary-adrenal) Achse eingebunden. Um die Hinweise der mRNA-Expressionsanalyse zu bestätigen, wurden Luciferase-Reportergentests mit FasL- bzw. SOCS-3-Promotorkonstrukten bei Kotransfektion von GRwt oder GRdim durchgeführt. Im Vergleich mit bereits charakterisierten Promotoren konnte sowohl für FasL als auch für SOCS-3 der Mechanismus der Cis-Repression nachgewiesen werden. Negative GREs zeigen im Gegensatz zu positiven GREs keine gute Konservierung der DNA-Sequenz. Um potenzielle nGREs in den neuen Zielgenen in silico zu charakterisieren, wurde durch Analyse bereits charakterisierter nGREs ein Suchmuster entwickelt. Die ermittelten DNA-Bereiche wurden im ABCD-Bindungstest auf ihre Affinität zum GR überprüft. Für den FasL-Promotor konnten drei potenzielle GR-Bindungselemente ermittelt werden. Zwei dieser Bindungsstellen binden den GR im Kontext der Zelle (Chromatin-Immunpräzipitation, N. Novac, AG Heinzel). Für den SOCS-3-Promotor wurden zwei GR-Bindungsstellen charakterisiert. In der vorliegenden Arbeit konnte durch die Ermittlung neuer negativer Bindungselemente des GR ein Hinweis dafür erbracht werden, dass nGREs auch im Kontext der Immunsuppression eine Rolle spielen, und dass der Korepressor N-CoR möglicherweise bei der Cis-Repression von Bedeutung ist.

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Metadaten
Author:Anja Dostert
URN (permanent link):urn:nbn:de:hbz:386-kluedo-17788
Advisor:Dieter Schrenk
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2004
Year of Publication:2004
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2004/09/15
Tag:FasLigand; Glucocorticoidrezeptor; Repression; Socs-3; Transkription
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften

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