Untersuchung von Markern für oxidativen Streß nach Ozonexposition

Investigation of markers for oxidative stress after ozone exposure

  • Marker für oxidativen Streß in unterschiedlichen Testsystemen wurden etabliert bzw. entwickelt, um eine Schädigung durch Ozon in vitro und in vivo zu untersuchen. Durch den Plasmid-Relaxations-Assay wurde an isolierter Plasmid-DNA eine zeitabhängige Schädigung durch Ozon nachgewiesen. Das durch zusätzliche Inkubation mit Reparaturenzymen erhaltene Schadensprofil unterscheidet sich von bisher beschriebenen Profilen dahingehend, daß es überwiegend zur Induktion von FPG- und Endonuklease III sensitiven Läsionen kommt. Dies deutet auf eine Reaktion von Ozon per se in diesem Testsystem hin. An isolierten HL-60 Zellen, die gegenüber 8 mg/m³ Ozon für 30 min exponiert waren, wurde die Induktion von Strangbrüchen und FPG-sensitiven Läsionen mittels eines mit Reparaturenzymen modifizierten Comet-Assays nachgewiesen. Das Verhältnis zwischen Strangbrüchen und FPG-sensitven Läsionen betrug 1 : 2, was auch in diesem Testsystem auf die Reaktion von Ozon per se hindeutet. Zur Messung von 8-oxodG im Urin wurde eine Methode mit hoher Präzision (VK 3,5 % für Wiederholanalysen) entwickelt, welche auf Immunoaffinitätschromatographie am bisher für diesen Einsatz nicht beschriebenen Antikörper 1F7 kombiniert mit HPLC-ECD (Gradientenelution) basiert. Zur Validierung der Methode wurden Vergleichsmessungen im Rahmen eines internationalen Ringversuchs durchgeführt. Die Ergebnisse belegen die prinzipielle Vergleichbarkeit des hier beschriebenen Verfahrens mit LC-MS-MS, Carbon Column HPLC-ECD und ELISA, wobei es mit ELISA zu einer bis zu fünffachen Überschätzung der Meßwerte kam, die jedoch gut mit den anderen Methoden korrelierten. Zum Nachweis von 8-oxodG in DNA wurde eine Methode entwickelt, welche die Artefakt-bildung während der DNA-Isolierung mittels Isopropanolfraktionierung in Anwesenheit von NaI sowie während der DNA-Hydrolyse minimiert und die Quantifizierung mittels HPLC-ECD erlaubt. Die für humane Kontrollproben (Blut) erhaltenen Werte lagen in einer Größenordnung, welche auf Basis eines Vergleichs mit Daten aus einem internationalen Ringversuch die Richtigkeit der Werte belegt. Die Richtigkeit der chromatographischen Analysenergebnisse für 8-oxodG wurde durch Teil-nahme an einem internationalen Ringversuch mit Vergleichsmessungen von Standards gezeigt. Zum Nachweis von Malondialdehyd im Blutplasma wurde ein spezifisches Verfahren entwic-kelt, welches die Messung durch HPLC-FlD nach Derivatisierung mit Thiobarbitur-säure erlaubt. Um die Induktion von oxidativem Streß durch Ozon in vivo zu untersuchen, wurde ein Tierexperiment an Ratten durchgeführt, welche gegenüber unterschiedlichen Ozonkonzentrationen für max. 12 Wochen exponiert wurden. Für die Ausscheidung von 8-oxodG im wöchentlich gewonnen 24-Stundenurin konnte kein Unterschied zwischen den verschiedenen Expositionsgruppen nachgewiesen werden. Dies ist möglicherweise auch auf die hohe Streuung der Einzelwerte zurückzuführen, die nicht methodisch begründet ist. Der Nachweis von 8-oxodG in lymphozytärer DNA schlug fehl, was auf die schlechte Qualität der Blutproben zurückzuführen ist. Im terminal gewonnen Lungengewebe wurde ein dosisabhängiger Anstieg der 8-oxodG Konzentration ab einer Ozonkonzentration von 500 µg/m³ beobachtet, der für eine Expositionskonzentration von 1000 µg/m³ gegenüber Raumluft und 200 µg/m³ statistisch signifikant war (p < 0,05). Für Malondialdehyd im Blutplasma konnte keine dosisabhängige Zunahme durch Ozonexposition nachgewiesen werden. Die gegenüber 1000 µg/m³ Ozon exponierten Tiere zeigten jedoch eine gegenüber den anderen Gruppen signifikant niedrigere Malondialdehydkonzentration im Plasma (p < 0,05). Dies ist vermutlich auf die Induktion der antioxidativen Abwehr zurückzuführen, wie sie für ozonexponierte Ratten bereits beschrieben wurde. Die Induktion von Nitrotyrosin im Lungengewebe ozonexponierter Tier konnte nicht nachgewiesen werden. Dies ist auf die Abwesenheit der Entzündungsreaktion, die für akute Ozon-exposition beschrieben ist, zurückzuführen. Der nicht- oder minimal-invasive Nachweis dieser Effekte in vivo in Körperflüs-sigkeiten war mit den untersuchten Biomarkern nicht möglich.

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Metadaten
Author:Frank Reetz
URN (permanent link):urn:nbn:de:bsz:386-kluedo-16004
Advisor:Gerhard Eisenbrand
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2003
Year of Publication:2003
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2003/07/31
Tag:Sommersmog
summer smog
GND-Keyword:Biomarker ; DNS ; Lipidperoxidation; Oxidativer Stress ; Ozon ; Photochemischer Smog
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften

$Rev: 12793 $