Inhibitoren der humanen induzierbaren NO-Synthase aus Pilzen - Einfluss der kleinen G-Proteine der Rho-Familie auf die Expression der humanen induzierbaren NO-Synthase

  • Das erste Ziel dieser Arbeit war es, Verbindungen aus imperfekten Pilzen zu selektieren und zu isolieren, die ueber die Hemmung des JAK2-STAT-1alpha-Signalweges die Induktion der iNOS-Expression in humanen A549/8-Zellen, humanen Lungen-Alveolarepithel-Karzinom-Zellen, negativ beeinflussen. Es konnten drei Verbindungen aus unterschiedlichen Penicillium-Staemmen isoliert werden, die durch Reportergen-Analysen betreffend der Wirkung der Rohfermentationsprodukte auf die iNOS-, eNOS-Promotor-Aktivitaet sowie der STAT-1alpha-abhaengigen Promotor-Aktivitaet selektiert wurden. Die Substanzen Sporogen-A01, S-Curvularin sowie S14-95 zeigten in den Reportergen-Analysen aehnliche Aktivitaeten, die sich nur in der Potenz unterschieden. Waehrend Sporogen-A01 und S-Curvularin eine, wenn auch konzentrationsunabhaengige, Hemmung auf die NF-kappaB-abhaengige Promotor-Aktivitaet in HeLa-S3-Zellen zeigten, so ergab sich fuer S14-95 kein Einfluss auf diesen Signaltransduktionsweg. Bei S14-95 scheint es sich um eine spezifisch die IFN-gamma-abhaengigen Wege der transkriptionellen Aktivierung der iNOS hemmende Verbindung zu handeln. Die Effekte dieser Substanz auf den humanen TNF-alpha-Promotor liegen wie auch fuer S-Curvularin bei 80% Hemmung und auch der humane COX-2-Promotor wurde durch alle drei Substanzen in Reportergen-Analysen stark gehemmt. In A549/8-Zellen zeigten die Substanzen keine (S14-95 und S-Curvularin) oder lediglich geringe (Sporogen-A01) Wirkung auf die Zellproliferation. Die Verbindungen stellen wichtige Strukturen dar, die bei der pharmakologischen Unterdrueckung der NO-Produktion in pathophysiologischen Situationen eine Rolle spielen koennten. Im zweiten Teil wurde in humanen DLD1-Zellen, Kolon-Adenokarzinom-Zellen, und A549/8-Zellen die Regulation der iNOS-Expression durch kleine G-Proteine der Rho-Familie, die bekanntermassen in den Signaltransduktionsweg von Cytokinen involviert sind, untersucht. Atorvastatin und Lovastatin (HMG-CoA-Reduktase-Hemmer), die Ras- und Rho-Proteine gleichermassen indirekt hemmen, indem sie ihre essentielle Membranverankerung verhindern, erhoehten die Cytokin-induzierte NO-Produktion und iNOS-mRNA-Expression in den untersuchten humanen Zellen auf das 2 bis 4-fache, ohne jedoch selbst die Expression der iNOS induzieren zu koennen. DLD1- und AKN1-Zellen, die stabil mit einem 16kb-Fragment des humanen iNOS-Promotors vor einem Luziferase-Reportergen transfiziert worden waren, zeigten in Gegenwart von Atorvastatin oder Lovastatin eine mehr als 2,5-fache Steigerung der Cytokin-induzierten Luziferaseaktivitaet, was fuer eine erhoehte Transkriptionsrate als Ursache der erhoehten iNOS-mRNA-Spiegel spricht. In A549/8piNOS(16)Luc-Zellen erhoehten die beiden Statine die Luziferaseaktivitaet dagegen in einem weitaus geringerem Masse, so dass in diesen Zellen eine Beteiligung posttranskriptioneller Mechanismen, im Sinne einer erhoehten iNOS-mRNA-Stabilitaet, anzunehmen ist. Die beobachtete Statin-vermittelte Verstaerkung der Cytokin-induzierten iNOS-mRNA-Expression und iNOS-Promotoraktivitaet konnte durch Substitution von Mevalonat und Geranylgeranylpyrophosphat wieder vollstaendig aufgehoben werden, waehrend die Koinkubation mit FPP nur eine geringfuegige Reduktion zur Folge hatte. Die Superinduktion war somit das Ergebnis einer spezifischen Hemmung der HMG-CoA-Reduktase und beruhte auf der Hemmung posttranslational geranylgeranylierter Proteine. Vor dem Hintergrund, dass die kleinen G-Proteine der Rho-Familie vorwiegend geranylgeranyliert und die der Ras-Familie hauptsaechlich farnesyliert werden, scheint die Cytokin-induzierte iNOS-Expression durch Rho-Proteine negativ reguliert zu werden. Diese Hypothese konnte dadurch verifiziert werden, dass auch Clostridium difficile Toxin B - das durch UDP-Glucosylierung saemtliche Rho-Proteine (Rho, Rac, Cdc42) direkt inaktiviert, Ras-Proteine jedoch unbeeinflusst laesst - die Cytokin-induzierte iNOS-mRNA-Expression in den humanen Zellen auf mehr als das Dreifache zu steigern vermochte.
  • The first objective was to find and to isolate compounds from imperfect fungi inhibiting the cytokine(IFN-gamma, IL-1beta and TNF-alpha)-induced iNOS expression via the JAK-STAT pathway in the human A549/8, a lung carcinoma cell line. Those were selected by means of a GAS/ISRE-dependent reporter gene assay. The selection has been accompanied by reporter gene assays with the human iNOS-(16 kb)promoter in A549/8 cells and the human eNOS-(3.5 kb)promoter in ECV304 cells to evaluate the iNOS-specific inhibition caused by the raw fungal products and the isolated compounds. There has been demonstrated that three compounds were able to inhibit the activity of the iNOS promoter, iNOS-mRNA expression and nitrite production. In addition, Sporogen-A01 and S-Curvularin revealed inhibition of NF-kappaB-dependent promoter activity, while S14-95 did not. Nevertheless, all three compounds have significantly diminished STAT-1alpha-dependent signal transduction in promoter assays. S14-95 seemed to be a specific inhibitor of iNOS expression acting via IFN-gamma-dependent activation of iNOS expression. The activity of the human COX-2 promoter also has been inhibited by all three compounds in transient reporter gene assays by using A549/8 cells. S14-95 and S-Curvularin didn’t show any and Sporogen-A01 significant inhibition of A549/8 cell proliferation and no significant inhibition of the human eNOS promoter activity compared to the effective inhibition of the human iNOS promoter activity. These compounds may be important structures helping to prevent iNOS-dependent overproduction of NO in pathophysiological situations. In the second part of the dissertation the negative regulation of iNOS-mRNA synthesis by small G proteins of the Rho family has been investigated. Atorvastatin and Lovastatin, both inhibitors of HMG-CoA-reductase and therefore inhibitors of small G protein activation, were able to super-induce cytokine-dependent (see above) iNOS Promoter (16kb)- and iNOS-mRNA-expression in human cell lines like DLD1 and AKN –1 by 2-4 fold. Though promoter activation could not be detected in human A549/8 cell line, iNOS-mRNA expression and NO production have been super-induced in cytokine-induced A549/8 cells. It may be assumed that in these cells posttranscriptional mechanisms may play a greater role in this cell line than in the others. Statin-dependent amplification of cytokine-induced iNOS-mRNA expression and –promoter activity could be completely neutralized by substitution using mevalonate or geranylgeranylphosphate (GGPP) but not by using farnesylpyrophosphate (FPP. INOS super-induction therefore is either the result of specific inhibition of HMG-CoA-reductase or of specific inhibition of posttranslationally geranylgeranylated G proteins. The specific Rho protein inhibitor Toxin B from Clostridium difficile inhibiting Ras but not Rho small G proteins was also able to super-induce iNOS expression, which leads to the conclusion that small G proteins of the Rho family negatively regulate cytokine-induced iNOS-mRNA expression.

Export metadata

  • Export Bibtex
  • Export RIS

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author:Michael Hausding
URN (permanent link):urn:nbn:de:bsz:386-kluedo-15494
Advisor:T. Anke
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2002
Year of Publication:2002
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2002/11/11
Tag:GGPP ; HMG-CoA-Reduktase; JAK-STAT-Weg ; NO-Synthase ; Wirkstoffe ; induzierbar
JAK-STAT-pathway ; Rho; cytokine ; expression ; iNOS
GND-Keyword:Clostridium difficile ; Cytokine ; Deuteromycetes ; Genregulation; Inhibitor ; Promotor ; Rho-Proteine ; Statine ; Stickstoffmonoxidradikal
Source:Mol Pharmacol 2003 Feb;63(2):383-391 ; Br J Pharmacol. 2000 Oct;131(3):553-561
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Biologie
DDC-Cassification:610 Medizin und Gesundheit
MSC-Classification (mathematics):92C37 Cell biology
92C40 Biochemistry, molecular biology
92D10 Genetics (For genetic algebras, see 17D92)

$Rev: 12793 $