Establishment and Application of Methods for the Detection of DNA and Protein Adducts from Tobacco-Specific Nitrosamines and Benzo[a]pyrene

Etablierung und Anwendung von Methoden zur Bestimmung von DNA und Protein Addukten von Taback-Rauch-Spezifischen Nitrosamines und Benzo[a]pyrene

  • Der durch Rauchen hervorgerufene Lungenkrebs ist eine der häufigsten Krebserkrankungen. Während der 70er und 80er Jahr wurden vielfältige Bemühungen die Raucherquoten zu reduziern erfolgreich durchgeführet. Im letzten Jahrzehnt sind die Raucherquoten jedoch unverändert, und es wird vermutet, dass die verbleibenden 25% der Bevölkerung nikotinabhänig sind und auch mit nikotinersatzmittel (Nikotinkaugummi, Nikotinpflaster) das Rauchen nicht aufgeben können. Eine Alternative um die durch Lungenkrebs hervorgerufenen Sterberaten zu reduzieren, wäre die Anwendung von chemischen Mixturen, die das Krebsrisiko in Risikogruppen (z.B. Raucher und Ex-Rauchern) vermindern. Bevor solche Mixturen allerdings Anwendung finden können, muss die Wirksamkeit, Toxizität und die molekularen Wirkmechanismen der einzelnen aktiven Verbindungen verstanden sein. 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK), N-Nitrosonornicotine (NNN) und Benzo[a]pyrene (B[a]P) sind einige der carcinogensten Verbindungen im Zigarettenrauch und werden häufig als Testcarcinogene verwendet. Es wird heutzutage allgemein akzeptiert, dass die kovalente Bindung von Karzinogenen entweder direkt oder nach metabolischer Aktivierung einen entscheidenen Schritt in der Kanzinogenese darstellt. In Tierversuchen hat sich gezeigt, dass Isothiocyanate (ITC) effektiv die Krebsentstehung von NNK, NNN und/oder B[a]P hemmen können. In der vorliegenden Arbeit wurde daher der Einfluss von verschiedenen ITCs auf die Adduktbildung von NNK, NNN und B[a]P untersucht. Zu Beginn wurden HPLC-FD und GC-NICI-MS Methoden zur Bestimmung von DNA- und Proteinaddukten von NNK, NNN und B[a]P im Labor etabliert. Diese Methoden wurden dann in verschiedenen Tierstudien angewendet. Erstens wurde gezeigt, dass die Adduktbildungen von NNK und B[a]P sich nicht gegenseitig beeinflussen. Die Werte von HPB-freilassenden, O6-mG und B[a]P-Tetraolfreilassenden Addukten waren gleich, unabhängig ob NNK und B[a]P zusammen oder einzelnd verabreicht wurden. Die selben Behandlungen wurden dann verwendet, um den Einfluss von verschidenen Mixturen von PEITC und BITC auf die Adduktbildung in mit NNK und B[a]P behandelten Mäusen und Ratten zu untersuchen. PEITC reduziertet die HPB-freilassenden-DNA Adduktwerte um 40-50%. Dies war signifikant, wenn PEITC im Futter gemischt verabreicht wurde, jedoch nicht, wenn ITCs einmal in der Woche per orale Intubation verabreicht wurden. Vorher wurde gezeigt, dass die verwendetet ITC Behandlungen die Lungentumore um ebenfalls 40% reduziert. Die O6-mG-Werte waren nur gering beeinflusst durch die untersuchten ITCBehandlung. B[a]P-Tetraol-freilassenden Adduktwerte waren 120 Stunden nach der letzten Behandlung mit NNK plus B[a]P reduziert. In der Rattenstudie wurde NNK im Trinkwasser und B[a]P, PEITC und BITC im Futter verabreicht. PEICT reduzierte die HPB-freilassenden DNA Addukte um 50% in der Lunge und war wirkungslos in der Leber. Intressanterweise wurde eine Reduktion der HPB-freilassenden Adduktwerte in den Mäusebehandlungen nur dann beobachtet, wenn die Kontrollen einen Adduktwert von grösser als 1 fmol/µg DNA hatten. In den Ratten waren die reduzierten Adduktwerte in der Lunge ähnlich zu den Werten in der Leber. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass in Mäusen und Ratten mindestens zwei Aktivierungssysteme für NNK vorhanden sind. Das eine ist PEITC-sensitiv und vermutlich verantwortlich für die grösseren Adduktwerte und Tumorzahlen in der Lunge. Das andere ist PEITC-unsensitiv und verursacht vermutlich die nach PEITC Behandlung verbleibenden Adduktwerte und Tumore hervor. In der letzten Tierstudie wurden der Einfluss von PEITC, PPITC und ihren NACKonjugaten auf HPB-freilassende DNA- und Globinaddukte von NNN in der Ratte untersucht. Keine der untersuchten Behandlungen hatte einen Einfluss auf die Bildung von Addukten, auch wenn vorher gezeigt wurde, dass die verwendeten Behandlungen eine starke Reduzierung von Speiseröhrentumoren bewirkt. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass die Verminderung von DNA Addukten nur teilweise den krebsvorbeugende Mechanismus von ITCs darstellt und andere Mechanismen ebenfalls beteiligt sind. Neuere Erkenntnisse lassen vermuten, dass die Aktivierung von Apoptosis programmierter Zelltod möglicherweise für die krebsvorbeugende Wirkung von ITCs verantwortich ist. Dies muss jedoch durch zusätzliche Studien bewiesen werden.
  • Lung cancer, mainly caused by tobacco smoke, is the leading cause of cancer mortality. Large efforts in prevention and cessation have reduced smoking rates in the U.S. and other countries. Nevertheless, since 1990, rates have remained constant and it is believed that most of those currently smoking (~25%) are addicted to nicotine, and therefore are unable to stop smoking. An alternative strategy to reduce lung cancer mortality is the development of chemopreventive mixtures used to reduce cancer risk. Before entering clinical trails, it is crucial to know the efficacy, toxicity and the molecular mechanism by which the active compounds prevent carcinogenesis. 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK), N-nitrosonornicotine (NNN) and benzo[a]pyrene (B[a]P) are among the most carcinogenic compounds in tobacco smoke. All have been widely used as model carcinogens and their tumorigenic activities are well established. It is believed that formation of DNA adducts is a crucial step in carcinogenesis. NNK and NNN form 4-hydroxy-1-(3-pyridyl)-1-butanone releasing and methylating adducts, while B[a]P forms B[a]P-tetraol-releasing adducts. Different isothiocyanates (ITCs) are able to prevent NNK-, NNN- or B[a]P-induced tumor formation, but relative little is know about the mechanism of these preventive effects. In this thesis, the influence of different ITCs on adduct formation from NNK plus B[a]P and NNN were evaluated. Using an A/J mouse lung tumor model, it was first shown that the formation of HPB-releasing, O6-mG and B[a]P-tetraol-releasing adducts were not affected when NNK and B[a]P were given individually or in combination, of by gavage. Using the same model, the effects of different mixtures of PEITC and BITC, given by gavage or in the diet, on DNA adduct formation were evaluated. Dietary treatment with phenethyl isothiocyanate (PEITC) or PEITC plus benzyl isothiocyanate (BITC) reduced levels of HPB-releasing adducts by 40*50%. This is consistent with a previously shown 40% inhibition of tumor multiplicity for the same treatment. In the gavage treatments with ITCs it seemed that PEITC reduced HPB-releasing DNA adducts, while levels of BITC counteracted these effects. Levels of O6-mG were minimally affected by any of the treatments. Levels of B[a]P-tetraol releasing adducts were reduced by gavaged PEITC Summary Page XII and BITC, 120 h after the last carcinogen treatment, while dietary treatment had no effects. We then extended our investigation to F-344 rats by using a similar ITC treatment protocol as in the mouse model. NNK was given in the drinking water and B[a]P in diet. Dietary PEITC reduced the formation of HPB-releasing globin and DNA adducts in lung but not in liver, while levels of B[a]P-tetraol-releasing adducts were unaffected. Additionally, the effects of PEITC, 3-phenlypropyl isothiocyanate, and their N-acetylcystein conjugates in diet on adducts from NNN in drinking water were evaluated in rat esophageal DNA and globin. Using a protocol known to inhibit NNNinduced esophageal tumorigenesis, the levels of HPB-releasing adduct levels were unaffected by the ITCs treatment. The observations that dietary PEITC inhibited the formation of HPB-releasing DNA adducts only in mice where the control levels were above 1 fmol/µg DNA and adduct levels in rat lung were reduced to levels seen in liver, lead to the conclusion that in mice and rats, there are at least two activation pathway of NNK. One is PEITC-sensitive and responsible for the high adduct levels in lung and presumably also for higher carcinogenicity of NNK in lung. The other is PEITC-insensitive and responsible for the remaining adduct levels and tumorigenicity. In conclusion, our results demonstrated that the preventive mechanism by which ITCs inhibit carcinogenesis is only in part due to inhibition of DNA adduct formation and that other mechanisms are involved. There is a large body of evidence indicating that induction of apoptosis may be a mechanism by which ITCs prevent tumor formation, but further studies are required.

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Metadaten
Author:Gunnar Boysen
URN (permanent link):urn:nbn:de:bsz:386-kluedo-15131
Advisor:G. Eisenbrand
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:English
Year of Completion:2002
Year of Publication:2002
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2002/06/26
Tag:DNA adducts; NNK ; benzo[a]pyrene ; chemoprevention ; lung cancer
GND-Keyword:Lungenkrebs ; Nichtrauchen ; Nitrosamine; Passivrauchen ; Rauchen ; Raucherentwöhnung ; Zigarettenrauchen ; Zigarrenrauchen
Source:http://www.unc.edu/~gboysen/thesis/PhDthesis.pdf
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften

$Rev: 12793 $