Synthese von Derivaten des Indirubins und Untersuchungen zur Mechanismusaufklärung ihrer antineoplastischen Wirkung

  • Indirubin ist als antileukämischer Inhaltsstoff in Zubereitungen der traditionellen chinesischen Medizin erkannt und seine antineoplastische Wirkung in einer klinischen Studie an Patienten mit chronisch myeloischer Leukämie gezeigt worden. Ziel dieser Arbeit war es, bekannte und neue Indirubinderivate zu synthetisieren und Indizien für den Wirkmechanismus indigoider Bisindole zu finden. Ein Schwerpunkt sollte dabei in der Darstellung von in 5- und 3'-Stellung substituierten Indirubinderivaten liegen. Unter den 19 synthetisierten Indirubinderivaten sind die zehn neuen Verbindungen 5-Fluorindirubin, 5-Nitroindirubin, 5,5'-Dibromindirubin, das Natriumsalz der 5'-Bromindirubin-5-sulfonsäure, 5-Iodindirubin-3'-oxim sowie fünf Indirubin-5-sulfonsäureamidderivate. An der Verbindungsklasse werden detaillierte NMR-spektroskopische Untersuchungen vorgenommen. Außerdem werden Isoindigo und die beiden Bisindolderivate 2,2'-Bisindol sowie 3,3'-Diphenyl-2,2'-bisindol dargestellt. Identität und Reinheit der synthetisierten Verbindungen werden mittels Dünnschichtchromatographie, Elementaranalyse, Massenspektroskopie, Gaschromatograhie/Massenspektroskopie, UV-Spektroskopie sowie 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektroskopie nachgewiesen. Ergänzt durch kommerziell erhältliche Indigoderivate steht damit eine Auswahl an 2',3-, 2,2'- und 3,3'-Bisindolderivaten zur Verfügung. Bei cyclovoltammetrischen Untersuchungen an Indirubin und 5-Iodindirubin werden im beobachteten Spannungsbereich bei beiden Derivaten eine im Sinne der Cyclovoltammetrie irreversible Oxidation und zwei reversible Reduktionen registriert. Die Höhe der Wellen deutet darauf hin, daß das Indirubinsystem bei den beiden Reduktionen jeweils ein Elektron aufnimmt und bei der Oxidation zwei Elektronen abgibt. Zumindest die erste Reduktion liegt mit einem Halbwellenpotential von -0,8 V in einem Bereich, der physiologisch zugänglich sein sollte. Eine Überführung in eine der vorgeschlagenen oxidierten oder reduzierten Strukturen hätte mit großer Wahrscheinlichkeit eine bessere Löslichkeit und damit eine erhöhte Transportfähigkeit der Indirubinderivate in wäßrigen Systemen zur Folge. Die Ergebnisse des Ethidiumbromidverdrängungsassays deuten darauf hin, daß einige Indirubinderivate interkalative Wechselwirkungen mit der DNA eingehen können. Bei 5-Fluorindirubin, Indirubin-3'-oxim und Indirubin-5-sulfonamid kann ein ED50-Wert bestimmt werden, der fast in der Größenordnung des starken Interkalators Doxorubicin liegt. Eine Beteiligung der Interkalation am Wirkmechanismus scheint bei 5-Fluorindirubin und Indirubin-3'-oxim möglich, denn beide hemmen im gleichen Konzentrationsbereich das Wachstum im Sulforhodamin B-Assay und im Colony-Forming-Assay. Im Colony-Forming-Assay ist Isoindigo die aktivste Substanz. Indirubinderivate haben durchschnittliche IC70-Werte, die eine Größenordnung höher liegen. Die drei Indirubinderivate mit einer freien Sulfonsäuregruppe sowie Indigo sind kaum wirksam. Die sulfonierten Indigoderivate sind inaktiv. Die beiden Melanomzellinien MEXF 989 und MEXF 515LX zeichnen sich gegenüber einigen Verbindungen durch eine bis um den Faktor 75 unterschiedliche Sensitivität aus. Die Mammakarzinomzellinie MCF 7 wird von den meisten der Indirubinderivaten sowie von den beiden 2,2'-Bisindolderivaten stärker gehemmt als der Durchschnitt. Im Luciferase-Assay an transfizierten MCF 7-Zellen kann kein Hinweis auf eine hormonrezeptorgekoppelte Wirkung gefunden werden. Im Sulforhodamin B-Assay sind Isoindigo und Indirubin-3'-oxim die wirksamsten Substanzen. Dies bestätigt das Ergebnis der durchschnittlichen Wirksamkeit in den Colony-Forming-Assays. Die geringe absolute Löslichkeit sowohl in der lipophilen als auch in der hydrophilen Phase verhindert bei etwa der Hälfte der Verbindungen eine exakte Bestimmung des Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten (log POW). Dennoch wird für die restlichen Indirubinderivate eine gute Korrelation zwischen dem durchschnittlichen IC70-Wert im Colony-Forming-Assay und der Lipophilie der Substanzen gefunden. Das Optimum des log POW bewegt sich für Indirubinderivate in Bezug auf die Wachstumshemmung im Colony-Forming-Assay in einem Bereich von 3 bis 4. In ersten, orientierenden in vivo-Versuchen an thymusaplastischen Nacktmäusen, die das großzellige Lungenkarzinom LXFL 529 tragen, können Indirubin und 5-Chlorindirubin das Tumorwachstum verzögern aber nicht stoppen. 5-Methylindirubin, das schneller als die beiden anderen Derivate aus dem Injektionsbereich transportiert wird, kann ab etwa dem zehnten Tag der Behandlung das Tumorwachstum stoppen. Das Gesamtgewicht der Versuchstiere bleibt dabei konstant oder steigt leicht an. 5-Methylindirubin ist somit ein aussichtsreicher Kandidat für eine Weiterentwicklung in Richtung eines antineoplastischen Medikaments. Ausgehend von Indirubin kann durch die Variation der Substituenten eine Steigerung der Hemmwirkung am isolierten Enzymkomplex CDK1/Cyclin B um den Faktor 1200 erreicht werden. Das Natriumsalz der 3'-Hydroxyiminoindirubin-5-sulfonsäure hat einen IC50-Wert von 0,0083 microM. Die Substanzklasse besitzt außerdem eine hohe Selektivität gegenüber anderen Kinasen und übertrifft somit in Wirksamkeit und Selektivität die meisten bekannten CDK-Hemmstoffe. Für Isoindigo kann keine Hypothese zum Wirkmechanismus aufgestellt werden. Seiner hohen Aktivität im Colony-Forming-Assay und im Sulforhodamin B-Assay steht eine nur äußerst geringe Interkalationsfähigkeit sowie eine kaum vorhandene Fähigkeit zur Hemmung des Enzymkomplexes CDK1/Cyclin B gegenüber. In einer Röntgenstrukturanalyse von humaner CDK2 im Komplex mit Indirubin-5-sulfonat bzw. Indirubin-3'-oxim wird deutlich, daß sich die Inhibitoren in die ATP-Bindungstasche einlagern. Im Bereich der Aminosäuren Phe80 bis His84 ist die Form der Indirubinmoleküle komplementär zu der gekrümmten Form der ATP-Bindungstasche, ein Effekt wie er auch bei anderen CDK-Hemmstoffen beobachtet wurde. Die Ausbildung von drei Wasserstoffbrückenbindungen sowie lipophile Wechselwirkungen sind essentiell für die starke Bindung beider Derivate. Anhand der gemessenen Struktur wird deutlich, daß die 5-Position die ideale Substitutionsposition an den Benzolkernen darstellt. Indirubin-5-sulfonat bildet durch die Sulfonatgruppe ionische Wechselwirkungen mit einer Lysinseitenkette (Lys33) des Enzyms aus, die zu einer weiteren Affinitätssteigerung führen. Die Oximgruppe in Position 3' ragt in einen freien Raumbereich, der von anderen Hemmstoffen besetzt wird und eröffnet daher die Möglichkeit, weitere funktionelle Gruppierungen einzubringen und so die Hemmstärke und die Selektivität der Indirubinderivate noch zu steigern. Läßt man die ionischen Verbindungen, die aufgrund ihrer Ladung die Zellmembran (und Zellkernmembran) wahrscheinlich nicht durchdringen können, außer Betracht, so fällt auf, daß alle starken Inhibitoren des Enzymkomplexes CDK1/Cyclin B auch zu einer starken Wachstumshemmung im Colony-Forming-Assay führen. Eine Schwächung der Affinität zwischen Inhibitor und CDK1 durch eine Substitution am N1-Stickstoff führt gleichzeitig zu einem Abfall der Wirksamkeit im Colony-Forming-Assay und in anderen Testsystemen. Durch die Röntgenstrukturanalyse wird verständlich, wie eine Substitution an dieser Stelle die Wechselwirkung zwischen Inhibitor und Enzym abschwächt. Die Befunde deuten darauf hin, daß der antineoplastischen Wirkung von Indirubinderivaten ein komplexes Zusammenspiel mehrerer Teilmechanismen zugrunde liegt, möglicherweise unter Beteiligung von Int erkalation und Redoxcycling, wobei der Hauptwirk mechanismus in der Inhibierung cyclinabhängiger Kinasen besteht.

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Metadaten
Author:Ralph Hössel
URN (permanent link):urn:nbn:de:bsz:386-kluedo-136
Advisor:G. Eisenbrand
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:1999
Year of Publication:1999
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:1999/06/08
Tag:CDK1 ; Indigo ; Indirubin ; Isoindigo; NMR-Spektroskopie ; Struktur-Wirkungs-Abhängigkeit ; Synthese ; Zellzyklus ; cdc2 ; cyclinabhängige Kinasen
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften

$Rev: 12793 $