Versuche zur antigenspezifischen Immunsuppression der Myasthenia gravis mit Immuntoxinen aus Gelonin und rekombinanten AChR-Fragmenten

  • Die Ausschaltung autoantigener Immunzellen ist das Prinzip der antigenspezifischen Immunsuppression, einer erfolgversprechenden Methode zur Therapie von Autoimmunerkrankungen. Im Fall der Myasthenia gravis, bei der die Autoimmunreaktion gegen den nikotinischen Acetylcholinrezeptor (AChR) gerichtet ist, wurden Konjugate aus dem kompletten AChR und dem ribosomen-inaktivierenden Toxin Gelonin in in vivo Versuchen eingesetzt [Urbatsch et al., 1993; Brust et al., 1987]. Urbatsch und Brust gelang die Therapie von Ratten, bei denen sie die experimentelle autoimmune Myasthenia gravis (EAMG) ausgelöst hatten, durch Applikation dieser Konjugate. Zur Vermeidung unerwünschter Immunreaktionen gegen pathologisch irrelevante Teile des AChR, wurde die humane +- -Untereinheit, sowie der extrazelluläre Teil, in dessen Bereich die hauptantigene Determinante liegt, in E. coli exprimiert [Rousselle, 1996]. Allerdings konnten diese Peptide nur in denaturierter, unlöslicher Konformation als inclusion bodies erhalten werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Isolierung von AChR-Gelonin-Konjugaten aus nativen, gefalteten Rezeptor-Fragmenten und deren in vivo Einsatz zur Therapie der EAMG in Lewis-Ratten. Zur Induzierung der EAMG wurde der nikotinische AChR aus dem elektrischen Organ des Zitterrochens, Torpedo californica (T-AChR) isoliert und in fünf Lewis-Ratten eingesetzt. Der Verlauf der EAMG, wie auch die spätere Therapie mit den Konjugaten, sollte elektrophysiologisch mit Hilfe der repetitiven Serienstimulation verfolgt werden. Bei den Ratten konnte durch diese Methode eine pathologische Reduzierung der funktionstüchtigen AChR nachgewiesen werden. Zur Isolierung nativ gefalteter AChR-Fragmente wurde die Koexpression des Chaperoninsystems GroEL/GroES mit verschiedenen AChR-Fragmenten durchgeführt. Nur mit dem Plasmid polsi HE706 gelang es das AChR-Fragment zu exprimieren. Da das Fragment +- HE706 aber ausschließlich in Form von inclusion bodies detektiert wurde, muß die Koexpression mit dem Chaperonin-Komplex GroEL/GroES zur nativen Faltung des Proteins, als gescheitert angesehen werden. Da keine nativ gefalteten AChR-Fragmente isoliert werden konnten, stellte Prof. Dr. A. Maelicke (Institut für Physiologische Chemie und Pathobiochemie, Mainz) freundlicherweise das rekombinante T-AChR1-209-Fragment zur Verfügung. Die hohe Aggregationsbereitschaft, die negative Reaktion mit konformellen Antikörpern und Schwierigkeiten das Protein aufzukonzentrieren, wiesen auf die unvollständige Faltung des T-AChR1-209 hin. Die Synthese des T-AChR1-209-Gelonin-Konjugates sollte mit dem Kopplungsreagenz BMME (Bis-( maleimido)-methylether) unter Ausbildung einer Thioetherbrücke erfolgen. Dabei ist es notwendig in beide Proteine, durch Modifikation mit 2-Iminothiolan, Thiolgruppen einzuführen. Da die Modifizierung des T-AChR1-209 scheiterte, sollte die Thioetherbrücke mit dem Kopplungsreagenz SMCC (Succinimidyl-4-(N-maleimido)-cyclohexan-1-carboxylat) eingeführt werden. Bei dieser Methode ist es nicht notwendig, den T-AChR1-209 mit Thiolgruppen zu modifizieren. Nach der Synthese des T-AChR1- 209-Gelonin-Konjugates konnte der freie T-AChR1-209 vollständig abgetrennt werden, während das Konjugat mit nicht umgesetztem Gelonin verunreinigt war. Da kein T-AChR1-209-Fragment mehr zur Verfügung stand, mußten Versuche zur Optimierung der Konjugatsynthese aufgegeben werden.

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Metadaten
Author:Ulrike Kreilinger
URN (permanent link):urn:nbn:de:bsz:386-kluedo-12833
Advisor:Wolfgang E. Trommer
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2001
Year of Publication:2001
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2001/09/06
Tag:Acetylcholinrezeptor ; Acetylcholinrezetorfragment ; Chaperone; EAMG ; Gelonin ; Immuntoxin ; Myasthenia gravis ; antigenspezifische Immunsuppression
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften

$Rev: 12793 $