Typisierung von HLA-Klasse-II-Merkmalen mittels des TaqMan-Verfahrens

  • In Anlehnung an die konventionelle SSP-PCR-Methode wurde ein Low-Resolution-Panel mittels des TaqMan-Prinzips entwickelt und es wurde exemplarisch für DR4 und DR15/16 gezeigt, daß die auf dem 5 Nuklease-Assay beruhende Methode fähig ist, auch einzelne Punktmutationen voneinander zu unterscheiden. Das Grundprinzip dieser Methode basiert ähnlich dem der PCR-SSP auf dem Verfahren der PCR und auf dem Ausnutzen genetischer Unterschiede. So kommt es nur zu einer Amplifizierung wenn beide Primer spezifisch binden. Die Detektion einer erfolgreichen Amplifizierung erfolgt bei der TaqMan-Methode über eine Fluoreszenzmessung im gleichen Reaktionsgefäß. So entfallen jegliche Post-PCR-Schritte, d.h. es müssen weder weitere Pipettierschritte noch Gelelektrophorese eingesetzt werden. Das automatisch generierte Datenfile muß nur am Rechner ausgewertet werden. Mit Hilfe einer optimierten Schnell-DNA-Isolierungsmethode, die auf dem Binden an ein Säulenmaterial und Verdau etwaiger Proteine beruht, läßt sich eine DRB1-Typisierung nunmehr in etwas mehr als 2 Stunden durchführen, im Gegensatz zu den bisher 3-3.5 Stunden bei der konventionellen SSP-PCR. Durch den höheren Automatisierungsgrad, werden nicht nur Zeit und Arbeitsaufwand minimiert, sondern auch die potentiellen Fehlerquellen eingeschränkt, wie z.B. Kontaminationen durch PCR-Produkte, fehlerhaftes Auftragen der PCR-Produkte auf das Gel und die falsche Zuordnung von Banden. Bei Validierungsuntersuchungen dieses Tests ergab sich eine zufriedenstellende Übereinstimmung mit der konventionellen SSP-Typisierung und mit anderen molekularbiologischen Methoden wie RFLP. Die TaqMan-Methode stellt eine sehr nützliche Alternative zu herkömmlichen Typisierungsverfahren dar. Sie kann sowohl für Einzel- und Notfalltypisierungen, als auch für eine größere Zahl gleichzeitig durchzuführender Tests eingesetzt werden. Sie ist sehr zuverlässig, weniger zeit- und arbeitsintensiv als andere Methoden (SSP, SSO), besitzt ein höheres Automatisierungspotential und einen höheren Durchsatz. Sie ist erweiterbar für die Detektion neuer Allele und Subtypen. Die Technik ist in ihren Einsatzmöglichkeiten nicht begrenzt, im Gegensatz zu RFLP oder RSCA, die durch Enzyme bzw. ihre Schnittstellen limitiert sind. TaqMan-Assays sind weniger aufwendig und die Interpretation übersichtlicher als z.B. die einer Sequenzierung. Eine Ausdehnung der HLA-Typisierung mittels TaqMan-Verfahren auf andere HLA-Loci ist durchaus sinnvoll.

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Metadaten
Author:Matthias Tremmel
URN (permanent link):urn:nbn:de:bsz:386-kluedo-12776
Advisor:Wolfgang E. Trommer
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2001
Year of Publication:2001
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2001/06/28
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften

$Rev: 12793 $