Expression und Charakterisierung von Neurotransmitterrezeptoren des Zentralen Nervensystems

  • In dieser Arbeit konnte ein Protokoll für die Isolierung von bisher nicht zugänglichen Mengen des ionotropen Glutamatrezeptors GluRB erarbeitet werden. Insbesondere die im Vergleich zu früheren Präparationen deutlich verbesserte Reinheit und Homogenität des Proteins ermöglichten erste Schritte hin zu einer strukturellen Aufklärung. Wenngleich diese bei den verschiedenen Ansatzpunkten - hydrodynamische Eigenschaften, Rekonstitution, Quervernetztung, 3D-Rekonstruktion und auch den in jüngerer Zeit begonnenen 2D-Kristallisationversuchen - bislang nur zu vorläufigen und oftmals negativen Ergebnissen geführt hat, so stellt doch die Verfügbarkeit des Proteins im heutigen Maßstab eine wichtige Voraussetzung für alle genannten und weitere Untersuchungen dar. Die Untersuchungen der hydrodynamischen Eigenschaften des Proteins konnten die oligomere Zusammensetzung des Ionenkanals nicht endgültig aufklären. Weitere Untersuchungen sind deshalb unerlässlich. Insbesondere die bessere Verknüpfung von Quervernetzungs- und STEM-Untersuchungen scheint ein vielversprechender Ansatz zur Ermittlung des Molekulargewichtes zu sein. Dennoch sind die hier vorgestellten Ergebnisse mit der Vorstellung eines tetrameren Ionenkanals eher in Einklang zu bringen, als mit einer pentameren Zusammensetzung. Die Hinweise auf das Vorliegen von Dimeren in STEM- und Quervernetzungsexperimenten, seien sie gedeutet als Zerfallsprodukte des intakten-Kanals oder als weitere stabile Konformation des Proteins, lassen die Hypothese zu, daß sich Glutamatrezeptoren zur Ausbildung des Ionenkanals aus zwei Dimeren zusammensetzen, wobei die Wechselwirkungen innerhalb eines Dimers stärker sind als diejenigen zwischen ihnen. Inwieweit dies physiologische Bedeutung haben könnte, ist derzeit aber nicht bekannt. Auf dem Wege zu einer strukturellen Charakterisierung des GluRB sollten Rekonstitutionsversuche auch weiterhin unternommen werden, obgleich sich Hinweise auf funktionelle Inkorporation des Proteins in dieser Arbeit nicht ergaben. Besonders wichtig für das Membranprotein scheint es zu sein, auch im solubilisierten Zustand Bedingungen vorzufinden, die seinem nativen Zustand nahe kommen. Aufgrund der weiterhin begrenzten Verfügbarkeit von GluRB sowie der zahlreichen Parameter, die die Rekonstitution beeinflussen, haben die hier vorgestellten Experimente allenfalls vorläufigen Charakter und sollten nicht zum Anlaß genommen werden, die Rekonstitution grundsätzlich als wichtige Methode zur strukturellen Charakterisierung des GluRB in Frage zu stellen. Die gegenwärtig durchgeführte Einzelpartikelanalyse könnte durch eine gelungene Rekonstitution wesentlich erleichtert werden. Leider ist die Expression des neuronalen a7-Acetylcholinrezeptors nicht mit gleichem Erfolg gelungen. Im Baculovirussystem konnte lediglich ein fragmentierter Rezeptor mit schlechten Ligandenbindungseigenschaften exprimiert werden. Hefen und Bakterien ergaben noch schlechtere Ergebnisse. Optimistisch mag die Erkenntnis stimmen, daß das Expressionsniveau der Fragmente in den Insektenzellen erstaunlich hoch war. Die Proteolyseanfälligkeit ist das eigentliche Problem in dieser Arbeit gewesen. Mittels einer verbesserten Aufreinigung, eventuell unter Verwendung einer 10fach-Histidinmarkierung oder anderer C-terminaler Epitope, könnte die Ermittlung der Proteaseschnittstelle gelingen. Die Expression müßte mit einem a7-Konstrukt versucht werden, in dem diese Schnittstelle durch Mutation entfernt wurde. Insgesamt konnte gezeigt werden, daß das Baculovirusexpressionssystem gute Möglichkeiten bietet, eukaryontische Neurotransmitterrezeptoren in für strukturelle Untersuchungen notwendigem Maße zu erzeugen. Im Falle des a7-nAChR müßte es allerdings gelingen, die Fragmentierung zu unterdrücken. Die Aufreinigung und weitere Untersuchung bleibt angesichts der im Vergleich zu löslichen Proteinen weitaus niedrigeren Expression weiterhin schwierig. Die zahlreichen Arbeiten, die gegenwärtig an Membranproteinen durchgeführt werden, führen in absehbarer Zeit sicherlich zu einem besseren Verständnis dieser wichtigen Klasse von Proteinen und werden dann auch experimentelle Erfolge ermöglichen, die in dieser Arbeit noch nicht gelungen sind.
Metadaten
Author:Markus Safferling
URN (permanent link):urn:nbn:de:bsz:386-kluedo-11521
Advisor:Dean Madden
Document Type:Doctoral Thesis
Language of publication:German
Year of Completion:2000
Year of Publication:2000
Publishing Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Granting Institute:Technische Universität Kaiserslautern
Acceptance Date of the Thesis:2000/05/15
Tag:Acetylcholin ; Glutamat ; Membranprotein; Neurotransmitterrezeptor
Faculties / Organisational entities:Fachbereich Chemie
DDC-Cassification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften

$Rev: 12793 $