Antigenspezifische Immunsuppression in einem Tiermodell der Myasthenia gravis Vom Fachbereich Chemie der Technischen Universitat Kaiserslautern ¨ zur Verleihung des akademischen Grades "Doktor der Naturwissenschaften" genehmigte DISSERTATION (D 386) vorgelegt von Dipl.-Chem. Martin Hossann Betreuer: Prof. Dr. Wolfgang E. Trommer Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 04. Juni 2004 F¨ r meine Eltern und Christine u V Der Beginn aller Wissenschaften ist das Erstaunen, dass die Dinge sind, wie sie sind. Aristoteles VI Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 04. Juni 2004 Promotionskommission: Vorsitzender: Prof. Dr.-Ing. S. Ernst 1. Berichterstatter: Prof. Dr. W. E. Trommer 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Dr. med. D. Schrenk VII Die vorliegende Arbeit entstand zwischen Marz 2001 und Juni 2004 im Fachbereich Chemie / Abteil¨ ung Biochemie der Universitat Kaiserslautern. ¨ ¨ Ich danke Herrn Prof. Dr. Wolfgang E. Trommer fur die Uberlassung dieses hochst interessanten ¨ ¨ Themas, fur die Unterstutzung, fur den Freiraum bei der Durchfuhrung und fur die stetige Diskus¨ ¨ ¨ ¨ ¨ sionsbereitschaft. Weiterhin danke ich fur viele lehrreichen Einblicke, auch in andere Gebiete der ¨ Biochemie. VIII IX Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Das Immunsystem der Wirbeltiere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.1. Lymphozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.2. Antigenprasentierende Zellen (APC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ¨ 1.1.3. Toleranz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2. Myasthenia gravis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.1. Pathogenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.2. Mechanismus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.3. Entstehung - Der Bruch der Toleranz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.4. Therapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.5. Experimentelle autoimmune Myasthenia gravis (EAMG) . . . . . . . . . . . 1.3. Antigenspezifische Immunsuppression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.1. B-Zellen im Visier - Immuntoxine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.2. T-Zellen im Visier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.3. Verwendung von APC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.4. Orale Toleranz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4. Der nikotinische Acetylcholinrezeptor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4.1. Struktur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4.2. Der extrazellulare Teil der -Untereinheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ¨ 1.5. Ribosomen-inaktivierende Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.5.1. Einsatz in der Medizin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.5.2. Wirkmechanismus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.5.3. Gelonin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2. Problemstellung 3. Chemische Deglykosylierung von naturlichem Gelonin ¨ 3.1. Aufgabenstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2. Chemische Deglykosylierung mit TFMS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3. Berechnung des Massenunterschieds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4. Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 1 5 8 11 11 12 13 15 18 18 19 19 20 20 21 21 22 24 24 24 25 27 29 29 29 30 30 X Inhaltsverzeichnis 4. Expression und Isolierung von rekombinantem Gelonin 4.1. Aufgabenstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2. Plasmidcharakterisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3. Expression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4. Lyse der Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5. Isolierung mit Hilfe von Nickel-Ionen-Affinitatschromatographie . . . . . . . . . . . ¨ 4.5.1. Elution mit unterschiedlichen Imidazolkonzentrationen . . . . . . . . . . . . 4.5.2. Abspaltung des HisTag . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5.3. Elution mit Thrombin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.6. Charakterisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.6.1. ESI-FT Massenspektrometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.6.2. Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.6.3. Toxizitatstest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ¨ 4.7. Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5. Klonierung, Expression und Isolierung von H--AChR4-208 5.1. Aufgabenstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2. Klonierungsstrategie von pHE706ext . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3. Charakterisierung der Ausgangsvektoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.1. pHE706 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.2. Synthese von pUCHE706 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.3. Synthese der 100 bp-Box . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.4. Synthese von pUCHE706ext . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.5. Synthese von pHE706ext . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.4. Expression und Lyse der Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.5. Aufarbeitung der inclusion bodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.6. Aufarbeitung des Zelluberstandes mit Nickel-Affinitatschromatographie . . . . . . . ¨ ¨ 5.6.1. Versuche zur Elution mit Imidazol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.6.2. Versuche zur Elution mit Enterokinase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.6.3. Filtration mit Amicon Ultra-Konzentratoren (MWCO 30.000) . . . . . . . . 5.7. Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6. Isolierung von His(T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 6 6.1. Aufgabenstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2. Untersuchung der Klonierungsstrategie von Li . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3. Isolierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.1. Aufreinigung des vorgereinigten Fusionsproteins . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.2. Ruckfaltung des Fusionsproteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ¨ 6.3.3. Isolierung aus inclusion bodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 35 35 37 37 38 38 40 41 44 44 44 45 47 53 53 55 56 56 57 57 60 61 62 63 64 64 65 66 67 71 71 71 73 73 74 77 Inhaltsverzeichnis XI 6.4. Versuche zur Abspaltung des HisTag . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4.1. Einfluss von Guanidin-hydrochlorid auf Thrombin . . . . . . . . . . . . . . 6.4.2. Bestimmung der sterischen Zuganglichkeit des HisTag . . . . . . . . . . . . ¨ 6.5. Charakterisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.5.1. Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.5.2. Toxizitatstest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ¨ 6.6. Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7. Isolierung des AChR aus Torpedo californica 7.1. Aufgabenstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2. Aufarbeitung des elektrischen Organs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.3. Isolierung mit -Cobratoxin-Affinitatschromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . ¨ 7.3.1. Durchfuhrung der Isolierung im Durchflussverfahren . . . . . . . . . . . . . ¨ 7.3.2. Durchfuhrung der Isolierung im Batch-Verfahren . . . . . . . . . . . . . . . ¨ 7.4. Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8. Versuche zur antigenspezifischen Immunsuppression in vivo 8.1. Aufgabenstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.2. Verlauf der Tierversuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.2.1. Verwendete Ratten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.2.2. Haltungsbedingungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.2.3. Bewertung der Erkrankung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.3. Immunisierung der Ratten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.4. Elektrophysiologische Untersuchungen - Repetitive Nervenstimulation . . . . . . . . 8.4.1. Narkose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.4.2. Versuchsaufbau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.4.3. Versuchsparameter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.4.4. Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.4.5. Versuche zur Bestimmung der Latenzzeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.4.6. Einfluss der RNS auf die Ratte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.5. Krankheitsverlauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.5.1. Ratte I5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 78 79 79 79 80 81 85 85 86 86 86 87 88 89 89 90 90 90 91 91 91 91 92 93 95 97 98 99 99 8.5.2. Ratte I6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 8.5.3. Ratte I4, I7, I9, I11 und I12 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 8.5.4. Ratte I1, I6 und I8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 8.6. Therapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 8.6.1. Durchfuhrung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 ¨ 8.6.2. Therapiekontrolle durch optische Beobachtung . . . . . . . . . . . . . . . . 102 8.6.3. Therapiekontrolle durch RNS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 XII Inhaltsverzeichnis 8.7. Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 9. Zusammenfassung 111 9.1. Chemische Deglykosylierung von naturlichem Gelonin . . . . . . . . . . . . . . . . 111 ¨ 9.2. Expression und Isolierung von rekombinantem Gelonin . . . . . . . . . . . . . . . . 111 9.3. Klonierung, Expression und Isolierung von H--AChR 4-208 . . . . . . . . . . . . . 112 9.4. Isolierung von His(T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 6 9.5. Isolierung des AChR aus Torpedo californica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 9.6. Versuche zur antigenspezifischen Immunsuppression in vivo . . . . . . . . . . . . . 114 10. Experimenteller Teil 117 10.1. Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 10.1.1. Gerate und Verbrauchsmaterialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 ¨ 10.1.2. Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 10.1.3. DNA- und Proteinmarker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 10.1.4. Saulenmaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 ¨ 10.1.5. E.coli-Stamme und Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 ¨ 10.1.6. Proteine und Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122 10.1.7. Antikorper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 ¨ 10.1.8. Oligonukleotide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 10.2. Allgemeine Arbeitsmethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 10.2.1. Konzentrationsbestimmungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 10.2.2. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) . . . . . . . . . . . . . . 125 10.2.3. Dialyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 10.2.4. Proteinkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 10.3. Gentechnische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 10.3.1. Allgemeine Arbeitsmethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 10.3.2. Plasmidisolierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128 10.3.3. Herstellung kompetenter Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 10.3.4. Transformation und Kompetenztest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 10.3.5. Restriktionsverdau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 10.3.6. Phosphorylierung von Oligonukleotiden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 10.3.7. Annealing von Oligonukleotiden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 10.3.8. Agarose-Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 10.3.9. DNA-Isolierung aus Agarosegelen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 10.3.10.Expression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 10.3.11.Zelllyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131 10.4. Proteinisolierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132 10.4.1. Isolierung von rekombinantem Gelonin (His T -Gelonin1-251) . . . . . . . . . 132 6 Inhaltsverzeichnis XIII 10.4.2. Isolierung des His(T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 -Fusionsproteins . . . . 135 6 10.4.3. Isolierung von His E0 -H--AChR4-208 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 1 10.5. Spezielle Arbeitsmethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138 10.5.1. Isolierung von Gelonin aus Gelonium multiflorum . . . . . . . . . . . . . . . 138 10.5.2. Isolierung von T-AChR aus Torpedo californica . . . . . . . . . . . . . . . . 138 10.5.3. Chemische Deglykosylierung von Gelonin . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 10.5.4. In vitro Translationstest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 10.6. Immunologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142 10.6.1. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) . . . . . . . . . . . . . . . 142 10.6.2. Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 10.7. Tierversuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 10.7.1. Halten und Spritzen der Ratte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 10.7.2. Induzierung der EAMG in Lewis-Ratten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144 10.7.3. Repetitive Nervenstimulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144 A. Anhang 147 A.1. Diskutierte Aminosaurensequenzen von naturlichem Gelonin . . . . . . . . . . . . . 147 ¨ ¨ A.2. DNA- und Aminosaurensequenz der rekombinanten Proteine . . . . . . . . . . . . . 148 ¨ A.2.1. HisT -Gelonin1-251 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148 6 A.2.2. His(T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149 6 A.2.3. HisE0 -H--AChR4-208 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151 1 A.3. Plasmidkarten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152 A.4. Mogliche Bestandteile der Glykosylierung von Gelonin . . . . . . . . . . . . . . . . 156 ¨ B. Danksagung C. Lebenslauf 177 179 XIV Inhaltsverzeichnis XV Abbildungsverzeichnis 1.1. Einleitung: Struktur eines Immunglobulins der Klasse G (IgG) . . . . . . . . . . . . 1.2. Einleitung: Reifung von dendritischen Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3. Einleitung: Modell der Interaktion zwischen mDC und CD4 + T-Lymphozyten . . . . 1.4. Einleitung: Zentrale Toleranz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.5. Einleitung: Modell der Gefahrensignale nach Matzinger . . . . . . . . . . . . . . . . 1.6. Einleitung: Vergleich einer gesunden und myasthenen Synapse . . . . . . . . . . . . 1.7. Einleitung: Therapieschema bei Myasthenia gravis . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.8. Einleitung: Struktur eines AChBP-Monomers und Vergleich mit H--AChR 4-208 . . 1.9. Einleitung: Struktur von rekombinantem Ricin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1. Deglykosylierung: SDS-PAGE der Umsetzung mit TFMS . . . . . . . . . . . . . . . 3.2. Deglykosylierung: Mogliche Zuckerzusammensetzung der Spezies 1 und 4. . . . . . ¨ 4.1. Rekombinantes Gelonin: Charakterisierung von pET-gel . . . . . . . . . . . . . . . (a). (b). (c). (a). (b). Plasmidkarte pET-gel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Agarosegel des Restriktionsverdaus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Verwendete Restriktionsenzyme und erwartete Fragmente . . . . . . . . . . . HisT -Gelonin1-251 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Gelonin1-251 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 7 9 11 12 16 23 25 30 32 36 36 36 36 38 38 38 39 40 40 40 41 42 42 42 43 43 44 45 4.2. Rekombinantes Gelonin: Primarstruktur (schematisch) . . . . . . . . . . . . . . . . ¨ 4.3. Rekombinantes Gelonin: SDS-PAGE der Saulenfraktionen (Elution mit Imidazol) . . ¨ 4.4. Rekombinantes Gelonin: Isolationskontrolle und Charakterisierung mit ELISA . . . (a). (b). Vergleich der versch. Isolierungen mit Anti-Gelonin Antikorpern . . . . . . . ¨ Untersuchung der Saulenfraktionen mit Anti-Gelonin Antikorpern . . . . . . . ¨ ¨ 4.5. Rekombinantes Gelonin: Abspaltung des HisTag . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.6. Rekombinantes Gelonin: Charakterisierung der Fraktionen (Elution mit Thrombin) . (a). (b). SDS-PAGE der Saulenfraktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ¨ ELISA der Saulenfraktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ¨ 4.7. Rekombinantes Gelonin: ESI-FT Massenspektrum . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.8. Rekombinantes Gelonin: ESI-FT Massenspektrum (mass-deconvoluted) . . . . . . . 4.9. Rekombinantes Gelonin: ESI-MS Massenspektrum (mass-deconvoluted) . . . . . . . 4.10. Rekombinantes Gelonin: Immunologische Charakterisierung . . . . . . . . . . . . . XVI Abbildungsverzeichnis (a). (b). Western Blot mit polyklonalen Anti-Gelonin Antikorpern . . . . . . . . . . . ¨ Western Blot mit Anti-HisTag Antikorpern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ¨ 45 45 46 54 55 57 58 58 59 60 61 63 63 63 63 65 66 72 72 73 74 74 74 76 77 77 77 79 80 80 80 86 87 87 87 90 4.11. Rekombinantes Gelonin: In vitro Translationstest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ¨ 5.1. H--AChR4-208 : Synthesestrategie fur das Plasmid pHE706ext (Teil 1) . . . . . . ¨ 5.2. H--AChR4-208 : Synthesestrategie fur das Plasmid pHE706ext (Teil 2) . . . . . . 5.3. H--AChR4-208 : Verdau der Ausgangsvektoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.4. H--AChR4-208 : Charakterisierung von pUCHE706 . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.5. H--AChR4-208 : Sequenz der synthetisierten 100 bp-Box . . . . . . . . . . . . . . . 5.6. H--AChR4-208 : Nachweis der synthetisierten 100 bp-Box . . . . . . . . . . . . . . 5.7. H--AChR4-208 : Charakterisierung von pUCHE706ext . . . . . . . . . . . . . . . 5.8. H--AChR4-208 : Charakterisierung von pHE706ext . . . . . . . . . . . . . . . . . ¨ 5.9. H--AChR4-208 : Primarstruktur (schematisch) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (a). (b). (c). HisE0 -H--AChR4-181 1 HisE0 -H--AChR4-208 1 .............................. .............................. H--AChR4-208 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.10. H--AChR4-208 : Isolierungsversuch durch Elution mit Imidazol . . . . . . . . . . . 5.11. H--AChR4-208 : Isolierungsversuch durch Elution mit Enterokinase . . . . . . . . . 6.1. Fusionsprotein: Klonierung der DNA-Information in den pET28a-Vektor . . . . . . . 6.2. Fusionsprotein: Primarstruktur (schematisch) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ¨ 6.3. Fusionsprotein: Elutionsdiagramm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4. Fusionsprotein: Isolierung aus den vorgereinigten inclusion bodies . . . . . . . . . . (a). (b). SDS-PAGE der Saulenfraktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ¨ Zeitlicher Verlauf der Renaturierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.5. Fusionsprotein: ELISA nach der Renaturierung in PBS-Puffer . . . . . . . . . . . . 6.6. Fusionsprotein: Isolierung aus den inclusion bodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . (a). (b). SDS-PAGE der Saulenfraktionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ¨ ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.7. Fusionsprotein: Hemmung von Thrombin durch Guanidin-hydrochlorid . . . . . . . 6.8. Fusionsprotein: Charakterisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (a). (b). Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . In vitro Translationstest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.1. T-AChR: Elektrisches Organ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2. T-AChR: Isolierung aus Torpedo californica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (a). (b). SDS-PAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.1. Tierversuche: Verlauf der in vivo Versuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Abbildungsverzeichnis XVII 8.2. Tierversuche: Platzierung der Elektroden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.3. Tierversuche: Schematische Darstellung von Puls und Antwort . . . . . . . . . . . . 8.4. Tierversuche: Einfluss der Masse-Elektrode bei der RNS . . . . . . . . . . . . . . . 8.5. Tierversuche: Einfluss der Stimulationsfrequenz bei der RNS . . . . . . . . . . . . . 8.6. Tierversuche: Das erste Signal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.7. Tierversuche: Messbeispiele der RNS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.8. Tierversuche: Versuche zur Bestimmung der Latenzzeit . . . . . . . . . . . . . . . . 8.9. Tierversuche: Einfluss der RNS auf die Ratte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 93 94 96 97 98 99 99 8.10. Tierversuche: Gewichtskontrolle der Ratten. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 8.11. Tierversuche: Ergebnisse der RNS (vor und nach der Therapie) . . . . . . . . . . . . 104 A.1. Anhang: Vergleich der bekannten Aminosaurensequenzen von Gelonin . . . . . . . . 147 ¨ A.2. Anhang: Plasmidkarte pHE706 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152 A.3. Anhang: Plasmidkarte pHE706ext . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152 A.4. Anhang: Plasmidkarte pBDH-VU1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153 A.5. Anhang: Plasmidkarte pET19b . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153 A.6. Anhang: Plasmidkarte pET-gel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154 A.7. Anhang: Plasmidkarte pET-GA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154 A.8. Anhang: Plasmidkarte pUCHE706 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155 A.9. Anhang: Plasmidkarte pUCHE706ext . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155 A.10. Anhang: Mogliche Zuckerbestandteile der Glykosylierung von Gelonin . . . . . . . 156 ¨ XVIII Abbildungsverzeichnis XIX Tabellenverzeichnis 1.1. Einleitung: Aminosaurensequenz der MIR und des cys-loop bei versch. Spezies . . . ¨ 3.1. Deglykosylierung: Berechnung der exp. bestimmten mittleren Molekularmassen . . . 4.1. Rekombinantes Gelonin: Vergleich der Toxizitaten von rekomb. und nat. Gelonin . . ¨ 5.1. H--AChR4-208 : Aus den SDS-Gelen bestimmte Molekularmassen . . . . . . . . . 5.2. H--AChR4-208 : Literaturvergleich von -AChRex -Isolierungen . . . . . . . . . . . 6.1. Fusionsprotein: Renaturierungsmethoden im Vergleich . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2. Fusionsprotein: Vergleich der Toxizitatsverluste von RIP in Fusionsproteinen . . . . ¨ 7.1. T-AChR: Molekularmassen und Ausbeuten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8.1. Tierversuche: Optische Bewertung der myasthenen Symptome . . . . . . . . . . . . 8.2. Tierversuche: Einfluss der Nadelposition bei der RNS . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 33 49 68 69 75 84 88 91 95 8.3. Tierversuche: Einfluss der Frequenz auf den Dekrementwert . . . . . . . . . . . . . 95 8.4. Tierversuche: Rattenubersicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 ¨ 9.1. Zusammenfassung: Vergleich der Isolationsmethoden von rekombinantem Gelonin . 112 10.10. xp. Teil: Verwendete Primar- und Sekundarantikorper . . . . . . . . . . . . . . . . 143 E ¨ ¨ ¨ A.1. Anhang: Mogliche Bestandteile der Glykosylierung von Gelonin . . . . . . . . . . . 156 ¨ XX Tabellenverzeichnis XXI Verwendete Abkurzungen ¨ A Abb. ACh AChBP AChR -AChR APC APS AS Asn BCA BDH Bew. bp BSA c CD CTL Da DC DEA DMF DNA DTT E.coli EAMG EDTA EGTA ELISA EMG engl. Ampicillin Abbildung Acetylcholin Acetylcholin-bindendes Protein nikotinischer Acetylcholinrezeptor -Untereinheit des nikotinischen Acetylcholinrezeptors antigenprasentierende Zelle (engl.: antigen presenting cell) ¨ Ammoniumpersulfat Aminosaure ¨ Asparagin 4,4-Dicarboxy-2,2-bichinolin-Natriumsalz (R)-3-Hydroxybutyrat Dehydrogenase Bewertung Basenpaare Rinderserumalbumin Konzentration Differenzierungsantigene zytotoxischer T-Lymphozyt (engl.: cytotoxic T-lymphocyte) Dalton (g/mol) dendritische Zelle (engl.: dentritic cell) Diethanolamin Dimethylformamid Deoxyribonucleinsaure ¨ Dithiothreitol Escherichia coli Experimentelle autoimmune Myasthenia gravis Ethylendiamintetraessigsaure ¨ Ethylen-bis(oxyethylennitrilo)tetraessigsaure ¨ Enzyme-linked Immunosorbent Assay Elektromyogramm englisch XXII ER ESI Fa. Fruc FT GdmHCl Gluc GlucNAc GPI H-AChR HisE0 1 HisT 6 His(T) 6 HisTag HLA HPLC Ig IgX IL IPTG IVIg Kan Kap. lat. LC LSM M Man MEA MG MHC MIR MOPS MS NeKo OD opt. Endoplasmatisches Retikulum Electrospray-Ionisierung Firma D-Fructose Fourier-Transformation Guanidin-hydrochlorid D-Glucose N-Acetyl-D-Glucosamin Glykophosphatidylinositol humaner, nikotinischer Acetylcholinrezeptor 10xHisTag mit Enterokinase-Schnittstelle 6xHisTag mit Thrombin-Schnittstelle 6xHisTag mit Thrombin-Schnittstelle, nicht abspaltbar Histidin-Tag Gewebsantigene (engl.: human leukocyte antigen) Hochdruckflussigkeitschromatographie ¨ Immunglobulin Immunglobulin (Klasse X, X = A, D, E, G, M) Interleukin Isopropyl--D-thiogalactopyranosid intravenoses Immunoglobulin ¨ Kanamycin Kapitel lateinisch Langerhans Zellen große suppressive Makrophagen (engl.: large suppressive macrophages) Molekulargewicht D-Mannose Mercaptoethylamin Myasthenia gravis Haupthistokompatibilitats-Komplex (engl.: major histocompatibility complex) ¨ hauptimmunogene Region (engl.: main immunogenic region) 3-(N-morpholino)propan-sulfonsaure ¨ Massenspektrometrie Negativkontrolle optische Dichte optisch XXIII PAGE PBS PMSF PNAG PoKo RIP RNA RNS RT SDS SMCC sog. T-AChR Tab. TCA TCR TEMED TFMS TLR Tris Tween 20 UE UV VIS Xyl Polyacrylamid-Gelelektrophorese Phosphatpuffer Phenylmethylsulfonylfluorid Polynukleotid-Adenosin Glykosidase Positivkontrolle Ribosomen-inaktivierende Proteine Ribonukleinsaure ¨ Repetitive Nervenstimulation Raumtemperatur Natriumdodecylsulfat Succinimidyl-4-(N-maleimido)-cyclohexan-1-carboxylat sogenannte Acetylcholinrezeptor aus Torpedo californica Tabelle Trichloressigsaure ¨ T-Zell Rezeptor (engl.: T-cell antigen receptor) N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin Trifluormethansulfonsaure ¨ Toll-like Rezeptor (engl.: toll-like receptor) Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Polyoxyethylensorbitanmonolaurat Untereinheit ultraviolett sichtbar D-Xylose XXIV 1 1. Einleitung 1.1. Das Immunsystem der Wirbeltiere Der Organismus von Wirbeltieren ist standig außeren Einflussen ausgesetzt. Viele davon sind fur ihn ¨ ¨ ¨ ¨ pathogen. Dringen Viren, Bakterien, Pilze und Parasiten in den Organismus ein, werden diese durch das Immunsystem spezifisch erkannt und zerstort (Klein, 1991; Bundschuh et al., 1992; Gemsa et al., ¨ 1997). Ein wichtiges Merkmal des Immunsystems ist dabei die Fahigkeit zwischen korpereigenen ¨ ¨ und korperfremden, bzw. fur den Korper schadliche Strukturen zu unterscheiden. ¨ ¨ ¨ ¨ Lebewesen sehr niedriger Organisationsstufe, wie z.B. Einzeller, konnen sich dagegen nur im be¨ schrankten Umfang schadigender Einflusse erwehren. So werden toxische Stoffe enzymatisch ent¨ ¨ ¨ giftet, mikrobielle Krankheitserreger durch Phagozytose und Verdauung vernichtet. Das Vorliegen eines gewissen Unterscheidungsvermogens zeigt sich allerdings dadurch, dass sich solche Organis¨ men nicht selbst phagozytieren. Entwicklungsgeschichtlich tritt ein Immunsystem erst bei den Vertebraten auf. Nach dem Eindringen eines Fremdkorpers (Infektion) werden sowohl unspezifische (angeborene), ¨ als auch spezifische (erworbene) Abwehrmechanismen aktiviert. Wahrend unspezifische Maßnahmen ¨ korperfremde Organismen, ohne spezifische Erkennungsmerkmale abtoten, ist das spezifische System ¨ ¨ in der Lage, Antigene aufgrund ihrer Struktur zu erkennen, zu beseitigen und die Information uber ¨ deren Struktur zu speichern. Eine weitere Einteilung der Abwehrmechanismen bezieht sich auf die Form der Immunantwort. So findet man humorale (lat: humor, Flussigkeit) und zellulare Faktoren, die allerdings miteinan¨ ¨ der wechselwirken. Aufgrund der Vielzahl an Partialfunktionen gelingt es dem Organismus, die uberwiegende Mehrheit der Infektionen zu beseitigen, ohne dass ein dauerhafter Schaden entsteht. ¨ 1.1.1. Lymphozyten Die Spezifitat des Immunsystems gegen schadliche Strukturen wird von den sog. Lymphozyten ge¨ ¨ bildet. Lymphozyten entstehen aus Stammzellen des Knochenmarks, die keinerlei immunologische Kompetenz besitzen. Nach dem Ort ihrer Reifung werden B- und T-Lymphozyten unterschieden. An der Zelloberflache gebundene Rezeptoren sind die Grundlage der Lymphozyten-Spezifitat. Jeder ¨ ¨ Lymphozyt besitzt dabei Rezeptoren nur einer einzigen Spezifitat, die auch an seine Abkommlinge ¨ ¨ 2 1. Einleitung Abb. 1.1: Struktur eines Immunglobulins der Klasse G (IgG). (Klone) weitergegeben werden. Eine Abschatzung der Zahl von Antigenen, gegen die ein Mensch ¨ immunologisch reagieren kann, liegt in der Großenordnung von 10 8 . T- und B-Lymphozyten sind ¨ im Ruhezustand morphologisch nicht unterscheidbar. Wahrend der Reifung erwerben sie sich aller¨ dings Differenzierungsantigene (CD, engl.: cluster of differentiation), Membranproteine die zu ihrer Unterscheidung benutzt werden konnen. ¨ ¨ 1.1.1.1. B-Lymphozyten und Antikorper B-Lymphozyten sind Zellen der lymphatischen Reihe, die auf ihrer Oberflache Antikorper (Immun¨ ¨ globuline, Ig) einer einzigen Spezifitat als Rezeptoren tragen. Sie entstehen aus ihren Vorlauferzellen ¨ ¨ im Knochenmark (engl.: bone marrow) und werden dort nach ihrer Spezifitat selektiert. Lymphozyten, ¨ die eine hohe Affinitat fur korpereigenes Gewebe besitzen werden eliminiert, wahrend alle anderen ¨¨¨ ¨ das Knochenmark verlassen und in die sekundaren Lymphorgane, Milz, Lymphknoten und dem darm¨ assozierten lymphatischen Gewebe wandern. B-Lymphozyten zirkulieren sehr wenig, ihr Anteil an der Lymphozytenpopulation im Blut betragt nur 10-15 %. ¨ Unreife B-Lymphozyten, die an ihrer Oberflache IgM- und IgD-Molekule als Antigenrezeptoren tra¨ ¨ gen, reifen nach Antigenkontakt auf zwei verschiedenen Wegen. Neben der Differenzierung in eine IgM-sezernierende Plasmazelle, kann sich der aktivierte B-Lymphozyt auch in eine Gedachtniszelle ¨ differenzieren. Diese Gedachtniszellen sezernieren Antikorper der Immunglobulinklasse G (IgG) der ¨ ¨ gleichen Spezifitat und sind relativ langlebig. Gedachtniszellen spielen bei einer Sekundarreaktion ¨ ¨ ¨ gegen das Antigen eine entscheidende Rolle. Die anschließende Wanderung der Plamazellen in das Knochenmark bildet den Abschluss der Immunantwort (Craxton et al., 1999). 1.1. Das Immunsystem der Wirbeltiere 3 ¨ Antikorper Die von den Plasmazellen gebildeten Antikorper sind fur die spezifische humorale Abwehr zustandig. ¨ ¨ ¨ Es handelt sich um Glykoproteine, von denen man funf verschiedene Klassen unterscheidet (IgG, ¨ IgA, IgM, IgD und IgE). Die Immunglobuline besitzen die gleiche Grundstruktur, die sich in Große, ¨ elektrischer Ladung, Zusammensetzung der Aminosauren und Kohlenhydratanteil unterscheiden. In ¨ Abb. 1.1 ist die schematische Struktur eines IgG abgebildet, das im normalen menschlichen Serum mit 70-75 % den Hauptbestandteil ausmacht. Die Bindung von Antigenen erfolgt in den Regionen, die sich durch eine variable Aminosauresequenz (VL , VH ) auszeichnen. In der sog. Hinge-Region ist eine ¨ Winkelanderung und somit die Besetzung beider Antigenbindungsstellen unabhangig voneinander ¨ ¨ moglich. ¨ Die Bindung eines Antigens an das zugehorige Immunglobulin erfolgt durch spezifische Wechsel¨ wirkung von einigen Aminosauren im hypervariablen Bereich des Immunglobulins mit einem struk¨ turellen Bereich (antigene Determinante, Epitop) des Antigens. Die restlichen Aminosauren dienen ¨ der Aufrechterhaltung der Integritat der Bindungsorte durch die Bildung der Tertiarstruktur. Die ¨ ¨ Bindungsenergie ergibt sich aus den beteiligten Bindungskraften (Wasserstoffbrucken, elektrostatis¨ ¨ che und Van-der-Waals-Krafte, sowie hydrophobe Wechselwirkungen). Da die nichtkovalenten Wech¨ selwirkungen stark vom Abstand der wechselwirkenden Gruppen abhangig sind, spielt die Form des ¨ Bindungsortes eine maßgebliche Rolle. Nur wenn die strukturelle Determinante und Oberflache des ¨ Antikorpers optimal ineinander passen, erreicht die Bindungsenergie ihr Maximum. ¨ Ein Immunglobulinmolekul hat zwei Aufgaben: Die Bindung von Antigenen und Markierung (Op¨ sonierung) fur den Angriff von Immunzellen, einige phagozytierende Zellen und eine Komponente ¨ des Komplementsystems. Die Bindung von Immunzellen, wie z.B. Lymphozyten erfolgt dabei an den konstanten Teil (CH ) der Immunglobuline. ¨ Affinitatsreifung Die Affinitat der gebildeten Antikorper erhoht sich im Verlauf der Immunreaktion gegen ein bestim¨ ¨ ¨ mtes Antigen. Dieser Vorgang wird als Affinitatsreifung bezeichnet. Ursache scheinen Punktmuta¨ tionen zu sein, die bei der Expansion der durch das Antigen selektionierten B-Lymphozytenklone entstehen. Infolge der Mutationen entstehen Klone, die eine geanderte Affinitat zum Antigen be¨ ¨ sitzen. Klone mit hoherer Affinitat werden bevorzugt weiter durch das Antigen stimuliert, wahrend ¨ ¨ ¨ Klone mit niedriger Affinitat aufgrund fehlender Stimulation nicht uberleben. ¨ ¨ 1.1.1.2. T-Lymphozyten Eine weitere Subpopulation von Lymphozyten bilden die T-Lymphozyten, die auf ihrer Zelloberflache ¨ T-Zell Rezeptoren (TCR, engl.: T-cell antigen receptor) tragen. TCR besitzen wie Antikorper eine ¨ 4 1. Einleitung sehr große Vielfalt. Sie sind in der Lage spezifisch an MHC-Rezeptoren von Zellen zu binden, die Antigenpeptide auf ihrer Oberflache prasentieren. ¨ ¨ Der T-Zellen Antigen Rezeptor (TCR) Der Oberflachenrezeptor, der fur die Spezifitat der T-Lymphozyten verantwortlich ist, besteht aus zwei ¨ ¨ ¨ Untereinheiten, die bei der Reifung des Lymphozyten gebildet werden. Dabei kommt es zum genetischen Rearrangieren der Gene fur die - und -Kette, verbunden mit einer ungenauen Vernetzung der ¨ Gensegmente. Durch diesen Prozess entsteht eine riesige Anzahl von TCR, von denen allerdings nur ein geringer Prozentsatz den Pool der reifen peripheren T-Lymphozyten erreicht. Die TCR erkennen Fremdproteine nur in Form von kurzen Peptiden mit 8-10 Aminosauren, die von antigenprasentieren¨ ¨ den Zellen prasentiert werden. ¨ Reifung und Wanderung Unreife T-Lymphozyten werden im Knochenmark gebildet und wandern in den Thymus. Ein Mensch produziert dabei 107 neuer T-Lymphozyten pro Minute. Im Thymus findet anschließend eine Selektion statt. Dies soll verhindern, dass autoreaktive Zellen den Thymus verlassen (Kapitel 1.1.3.1). Den Prozess der Selektion uberleben nur 2-3 % aller Lymphozyten (Chen et al., 1983). Die nicht ¨ benotigten Lymphozyten werden durch Apoptose eliminiert. Apoptotische Zellen werden effizient ¨ und ohne Hinweise auf inflammatorische Reaktionen entfernt (Surh und Sprent, 1994). Die reifen T-Lymphozyten verlassen den Thymus und wandern in die sekundaren lymphatischen Organe. T¨ Lymphozyten rezirkulieren stark, d.h. sie wandern aus den lymphatischen Organen uber das Lymph¨ system und das Blut zuruck in die lymphatischen Organe. Daher betragt ihr Anteil an der Lym¨ ¨ phozytenpopulation im Blut 60-80 %. Aufgaben Die Regulation von Immunantworten ist die zentrale Funktion der T-Lymphozyten. Dies geschieht durch die Ausschuttung von Mediatorsubstanzen, sowie durch direkten Zellkontakt mit antigenprasen¨ ¨ tierenden Zellen wie B-Lymphozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen. Diese Zellen werden T-Helferzellen (TH ) genannt und besitzen als Differenzierungsantigen den Marker CD4. Man unter¨ scheidet zwei Subpopulationen von T-Helferzellen. TH 1-Lymphozyten fordern die Ausbildung der zellvermittelten Immunreaktion, wahrend T H 2-Lymphozyten die Differenzierung von B-Lymphozyt¨ en bis zur Antikorper-sezernierenden Plasmazelle steuern. ¨ Lange Zeit wurde die Existenz von sog. Suppressor-T-Lymphozyten diskutiert. Heute weiß man allerdings, dass diese Subpopulation nicht existiert. Suppression kann durch alle T-Lymphozyten ver¨ mittelt werden. So fordern z.B. TH 1-Lymphozyten ihre eigene Entwicklung, wahrend sie die Ent¨ wicklung von TH 2-Lymphozyten hemmen. T-Lymphozyten die den Marker CD8 tragen, sind unmittelbare Effektorzellen. Sie sind in der Lage 1.1. Das Immunsystem der Wirbeltiere 5 virusinfizierte korpereigene Zellen, die spezifisch mit Hilfe des TCR erkannt wurden, abzutoten ¨ ¨ (CTL, engl.: cytotoxic T-lymphocyte). Dies erfordert allerdings in der Regel die Interaktion der CTLVorlauferzelle mit einer T-Helferzelle. ¨ ¨ 1.1.2. Antigenprasentierende Zellen (APC) Gemeinsames Merkmal der antigenprasentierenden Zellen (APC, engl.: antigen presenting cell) ist ¨ die Expression von Oberflachenproteinen, die im Haupthistokompatibilitatskomplex (MHC, engl.: ¨ ¨ main histocompatibilty complex) des Genoms kodiert sind. Diese Glykoproteine spielen eine wichtige Rolle bei der Prasentation von Antigenpeptiden. Wahrend MHC-Klasse I Proteine auf allen kernhalti¨ ¨ gen Zellen vorkommen, findet man MHC-Klasse II Proteine nur auf B-Lymphozyten, Makrophagen, dendritischen und Langerhans-Zellen. MHC-Klasse I Proteine prasentieren Antigenfragmente ¨ an CTL, wahrend MHC-Klasse II Proteine mit TH -Lymphozyten interagieren. ¨ Die Prasentation von Antigenfragmenten erfolgt hauptsachlich uber zwei Pfade. Ein exogener oder ¨ ¨ ¨ endosomaler, bei dem die prozessierten Antigenpeptide mit MHC-Klasse II Proteinen prasentiert wer¨ den (Morris et al., 1994; Castellino und Germain, 1995; Shi et al., 2000) und ein endogener und protesomaler Weg, bei dem es zur Prasentation mit MHC-Klasse I Proteinen kommt (Pamer und Cresswell, ¨ 1998). Virale Proteine werden uber den protesomalen Weg abgebaut und somit CTL prasentiert, die ¨ ¨ so die virenbefallene Zelle abtoten konnen. Bakterielle und auch korpereigene Proteine werden uber ¨ ¨ ¨ ¨ beide Wege prozessiert. 1.1.2.1. Makrophagen Makrophagen gehoren zu einer, von Monozyten abstammenden Klasse von Zellen, die in der Lage ¨ sind durch Phagozytose exogene Strukturen aufzunehmen und zu prozessieren. Sie wurden bereits 1884 von Metschnikow als Effektorzelle fur die Infektabwehr identifiziert. Ihre wichtigsten Funktio¨ nen sind die Phagozytose, Zytotoxizitat, Kooperation mit Lymphozyten und Sekretion verschiedenster ¨ biologisch aktiver Produkte. Nach der Erkennung von korperfremdem Material, durch Mechanismen, die noch wenig bekannt ¨ sind, kommt es zur Aufnahme durch Phagozytose, Abtotung durch mikrobiozide Substanzen und ¨ Verdauung durch lysosomale Enzyme. Der Erkennungsprozess kann erheblich durch die Opsonierung des Pathogens durch Antikorper und der Komplementkomponente C3b beschleunigt werden. Somit ¨ erhalten Makrophagen mit Hilfe von antikorperproduzierenden B-Lymphozyten eine Spezifitat fur ¨ ¨¨ eingedrungene Pathogene. Die Fahigkeit zur Chemotaxis, d.h. der Wanderung gegen einen ansteigen¨ den Gradienten chemotaktisch aktiver Substanzen, ermoglicht es den Makrophagen gezielt einen ¨ Entzundungsort im Korper zu erreichen. ¨ ¨ 6 1. Einleitung iDC mDC Aufnahme von Antigen +++ + Prozessierung von Antigen +++ + MHC-Klasse II + +++ Kostimulierung + +++ Ausgeschuttete Chemokine proinflammatorisch lymphoid ¨ Abb. 1.2.: Reifung von dendritischen Zellen (nach: Lipscomb und Masten, 2002). 1.1.2.2. Dendritische Zellen Dendritische Zellen (DC) wurden erstmals 1973 von Ralph Steinman beschrieben, der eine neue Subpopulation von Zellen mit charakteristisch verasteltem (engl.: dendritic) Aussehen, isoliert aus ¨ der Milz, beschrieb (Steinman et al., 1973). DC sind eine heterogene Gruppe von Zellen mit Unterschieden in der anatomischen Lokalisation und dem Phanotyp der Zelloberflache. Sie besitzen ¨ ¨ gemeinsame Funktionen bei der Kontrolle und Regulation der Immunantwort (Banchereau und Steinman, 1998). 1.1.2.3. Typen und Vorkommen ¨ Ausgehend von CD34+ Stammzellen des Knochenmarks, entwickeln sich Vorlaufer DC (pDC, engl.: ¨ precursor DC). Uber die Blutbahn gelangen diese ins Gewebe und entwickeln sich zu unreifen DC (iDC, engl.: immature DC), zu denen auch die Langerhans Zellen (LC) und interstitialen DC (auch dermale DC) gehoren. ¨ ¨ Die Funktion von unreifen DC im Gewebe liegt in der Uberwachung der Umgebung. Dabei findet man z.B. LC und interstitiale DC in der Darmschleimhaut und der Haut. Nach ihrer Aktivierung durch Entzundungssignale wie z.B. proinflammatorische Chemokine in der Umgebung, nehmen sie Antigen ¨ auf, prozessieren es und prasentieren die Peptide auf ihren Oberflachen-MHC-Rezeptoren des Typs I ¨ ¨ und II. Werden sie noch zusatzlich durch Gefahrensignale (siehe Kap. 1.1.3.2) aktiviert, reifen sie zu ¨ ¨ mDC und es erfolgt eine Anderung der Oberflachenrezeptoren (Abb. 1.2). Die Rezeptoren fur inflam¨ ¨ 1.1. Das Immunsystem der Wirbeltiere 7 Signal 1 Signal 2 Signal 3 mDC MHC Klasse II-Peptid CD11a CD40 CD54 CD80 CD86 IL-12 Ausschuttung ¨ keine IL-12 Ausschuttung ¨ CD4+ T-Lymphozyt TCR / CD4 CD54 CD40L CD11a CD28/CTLA4 CD28/CTLA4 Th1 Antwort Th2 Antwort Abb. 1.3.: Modell der Interaktion zwischen mDC und CD4+ T-Lymphozyten (nach: Lipscomb und Masten, 2002). matorische Chemokine verschwinden und es werden Rezeptoren fur lymphoide Chemokine exprim¨ iert, die eine Wanderung (engl.: homing) der reifen DC in Organe des Lymphsystems ermoglichen. ¨ + T -Lymphozyten und losen eine ImmunDort interagieren die mDC mit antigenspezifischen CD4 ¨ H antwort aus (de Smet et al., 1997; Liu et al., 1997; Vieira et al., 2000). Faktoren, die bei der Reifung in der Umgebung vorliegen, beeinflussen, ob diese mDC spater eine T H 1 oder TH 2 Immunantwort ¨ auslosen (Vieira et al., 2000). ¨ ¨ 1.1.2.4. Interaktion der Zellen des Immunsystems durch Antigenprasentation DC sind in der Lage sowohl einzelne Molekule durch Phagozytose, als auch ganze Zellen, wie z.B. ¨ apoptotische oder nekrotische Zellen aufzunehmen. Auch die Aufnahme von Antigenen von lebenden Zellen zur Prasentation an CTL ist bekannt (Harshyne et al., 2001). ¨ Die Prasentation von Antigenpeptiden zu T-Lymphozyten ist in Abb. 1.3 schematisch fur einen CD4 + ¨ ¨ T-Lymphozyten dargestellt und konnte erstmal direkt von Ingulli et al. in vivo detektiert werden (Ingulli et al., 1997). Je nachdem wie viele der drei aufgefuhrten Signale den T-Lymphozyten errei¨ chen, kommt es zu unterschiedlichen Reaktionen. Signal 1 alleine reicht nicht zur Aktivierung des T-Lymphozyten aus. Unterbleibt eine Kostimulation nach Signal 2, so hat das Anergy oder Apoptose zur Folge. Kommt es zur Kostimulation, wird der Lymphozyt aktiviert und es kann je nachdem 8 1. Einleitung ob Signal 3 erfolgt, eine Differenzierung zu einem antigenspezifischen TH 1- oder TH 2-Lymphozyten erfolgen. Auch die Dauer der Wechselwirkung mit einer dentritischen Zelle ist fur das Schicksal des T¨ Lymphozyten von entscheidender Bedeutung. Bei kurzer Wechselwirkung kommt es zu Anergy oder Apoptose, wahrend bei langerer Wechselwirkung die Ausbildung von Gedachtnis- oder Effektor-T¨ ¨ ¨ Lymphozyten erfolgt (Banchereau und Steinman, 1998; Lanzavecchia et al., 1999). Nach der Aktivierung der T-Lymphozyten verschwinden die antigenprasentierenden mDC, was zum Beenden der ¨ ¨ Lymphozytenstimulation fuhrt. Dies konnte ein Schutzmechanismus sein, um eine unkontrollierte ¨ Immunantwort mit aktivierten T-Lymphozyten zu verhindern (Ingulli et al., 1997). 1.1.2.5. Rolle der DC bei der Verbindung angeborenes und erworbenes Immunsystem DC gehoren zum angeborenen, unspezifischen Immunsystem, spielen aber eine wichtige Rolle bei ¨ der Regulation des erworbenen Immunsystems. Als professionelle antigenprasentierende Zellen, mit ¨ ihrer Eigenschaft uber Rezeptoren Gefahrensignale aus dem umliegenden Gewebe zu verarbeiten, ¨ sind sie ein wichtiges Bindeglied zwischen dem unspezifischen Immunsystems und dessen Gedacht¨ nis. Eine große Rolle spielen die dendritischen Zellen deshalb bei der Ausbildung der Toleranz des Immunsystems. 1.1.3. Toleranz Eine wichtige Eigenschaft des Immunsystems ist die Aufrechterhaltung der Toleranz gegen korper¨ eigenes Gewebe. Wird diese Toleranz durchbrochen, kommt es zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen (Kapitel 1.2). Das ursprungliche Modell von Burnet beschrieb die direkte Unterscheidung des Immunsystems von ¨ Selbst" - und Nichtselbst" . Danach sollten autoreaktive Lymphozyten im fruhen Stadium des Lebens ¨ " " eliminiert werden (Burnet, 1959). Dieses Modell wurde seit seiner Einfuhrung mehrmals modifiziert. ¨ 1975 entdeckten Lafferty und Cunningham, dass T H -Lymphozyten sterben, wenn sie Antigen durch eine APC prasentiert bekommen und nicht durch Kostimulation gerettet werden. Eine weitere Modi¨ fikation erfuhr das Modell durch die Entdeckung, dass APC eine eigene Methode von Selbst/Nicht" selbst" -Erkennung besitzen mussen (Janeway, 1989). So werden diese durch die Bindung von Bak¨ terien an Oberflachenrezeptoren aktiviert, kostimulierende Liganden und Rezeptoren exprimiert, die ¨ bakteriellen Antigene prozessiert und diese den T-Lymphozyten prasentiert. ¨ Ein vollig neues Modell der Toleranzinduktion schlug Matzinger vor (Matzinger, 1994). Darin pos¨ tulierte sie, dass Lymphozyten nicht die erste Stufe der Immunantwort durch Entdeckung von Antigenen sein mussen. Das Aussenden von Gefahrensignalen durch Zellen des Gewebes und deren Kom¨ munikation mit Immunzellen aktivieren ebenfalls das Immunsystem. 1.1. Das Immunsystem der Wirbeltiere 9 1.1.3.1. Zentrale Toleranzinduktion Im Thymus, dem Ort der Produktion von T-Lymphozyten, findet die erste Auswahl von unreifen T-Lymphozyten statt. Man spricht hier von zentraler Toleranzinduktion. Bei der Entwicklung von T-Lymphozytenklonen werden die Gene fur ¨ die beiden Untereinheiten des TCR willkurlich ¨ rearrangiert, um eine moglichst große Anzahl ¨ von verschiedenen Rezeptoren auszubilden. Dabei kommt es auch zur Produktion von autoreaktiven Lymphozyten-Klonen. Aufgrund der Affinitat des TCR zu von Selbst¨ MHC prasentierten Selbst-Peptiden, erfolgt die ¨ zentrale Selektion der T-Lymphozyten (Abb. 1.4). Bindet der TCR nicht an das mit Selbst-MHC prasentierte Selbst-Peptid, so bleiben Differen¨ zierungssignale aus und der T-Lymphozyt stirbt. Mit diesem Schritt wird erreicht, dass nur die T-Lymphozyten den Thymus verlassen, welche die eigenen MHC-Proteine erkennen. In einem Schritt der Negativselektion werden die T-Lymphozyten eliminiert, deren TCR eine hohe Bindungsaffinitat an die Komplexe aus Selbst-MHC ¨ und Selbst-Peptid besitzen und somit autoreak- Abb. 1.4.: Vereinfachte Darstellung der im Thymus ablaufenden Selektionsschritte von CD4+ /CD8+ T-Lymphozyten. tiv sind. Den Thymus verlassen nur die T-Lymphozyten, die eine niedrige Affinitat besitzen. Damit wird erreicht, dass die Zellen den Thymus ver¨ lassen, die potentielle Fremdpeptide prasentiert durch Selbst-MHC erkennen. Dies wird als Positiv¨ selektion bezeichnet. Die Selektion erfolgt mit CD4+ /CD8+ T-Lymphozyten. Im Rahmen dieser Positivselektion werden die Zellen nach ihrer Affinitat fur die MHC-Proteine weiter differenziert. T-Lymphozyten, die eine ¨¨ Affinitat zu MHC II-Proteinen besitzen, differenzieren sich in CD4+ T-Lymphozyten (TH -Lympho¨ zyten). Wahrend sich die T-Lymphozyten die eine Affinitat zu MHC I-Proteinen besitzen, zu CD8+ ¨ ¨ T-Lymphozyten (CTL) differenzieren. Allerdings gelingt es im Thymus nicht alle autoreaktiven Lymphozyten zu eliminieren. Dies hat verschiedene Grunde. Zum einen konnen T- und B-Lymphozyten der Selektion entgehen (Bouneaud ¨ ¨ et al., 2000), weiterhin haben viele Selbstantigene keinen Zugang zum Thymus (Lo et al., 1989), 10 1. Einleitung wahrend andere erst spater im Leben exprimiert werden, nachdem das Repertoire der Lymphozyten ¨ ¨ bereits ausgebildet wurde. 1.1.3.2. Periphere Toleranzinduktion Ein großer Teil der Selbstantigene wird nicht im Thymus exprimiert. Um eine Reaktion des Immunsystems gegen diese Selbstantigene zu verhindern, muss außerhalb des Thymus ein Mechanismus existieren, der eine Induktion der Toleranz ermoglicht. Diskutiert werden in diesem Zusammenhang ¨ Deletion, Anergy und Regulation. In den letzten Jahren wurde deutlich, dass vor allem APC in der Peripherie fur die Ausbildung der Toleranz verantwortlich sind. Lambolez et al. zeigten 2002 erstmals, ¨ dass dendritische Zellen in vitro Toleranz induzieren konnen (Lambolez et al., 2002). ¨ Ruhende DC sind nur dann in der Lage Lymphozyten zu stimulieren, wenn sie aktiviert werden und zu mDC differenzieren. Diese Aktivierung kann z.B. durch die Bindung von Bakterien an spezifische Rezeptoren (TLR, engl.: toll-like receptors) an der DC-Oberflache erfolgen. TLR binden eine große ¨ Zahl verschiedenster biologischer Molekule (Medzhitov und Janeway jr., 2002; Aderem und Ulevitch, ¨ 2000), wie z.B. Komponenten von Bakterien oder Pilzen. Bisher konnten in Saugetieren zehn TLR ¨ charakterisiert werden (Akira et al., 2001). Das Modell nach Matzinger In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass Autoantikorper (Mouthon et al., 1995; Coutinho et al., 1995) ¨ und autoreaktive Lymphozyten (Huetz et al., 1988; Melms et al., 1992; Shanmugam et al., 1994) auch im Blut von gesunden Menschen gefunden werden. Dies lasst sich durch das oben aufgefuhrte Tole¨ ¨ ranzmodell nicht oder nur unzureichend erklaren. Weiterhin bedeutet Nichtselbst" nicht unbedingt ¨ " pathogen. Viele exogene Substanzen schadigen den Korper nicht und machen somit eine Aktivierung ¨ ¨ des Immunsystems uberflussig. ¨ ¨ Matzinger beschrieb in ihrem Modell der Gefahrensignale" 1994 die Kommunikation des umliegen" den Gewebes mit den Zellen des Immunsystems. Werden Zellen von pathogenen Erregern angegriffen, so senden sie Gefahrensignale aus, die professionelle APC, wie z.B. dendritische Zellen, aktivieren und zur Reifung anregen. Diese prasentieren Antigen den T-Lymphozyten und losen eine ¨ ¨ Immunreaktion aus. Zu diesen Gefahrensignalen gehoren z.B. endogene Signale wie Hitzeschockpro¨ teine (Breloer et al., 2001), DNA (Ishii et al., 2001), RNA, Interferon-, Interleukin-1, CD40-L und Trummer von lysierten Zellen (nekrotische Zellen), aber auch exogene Signale wie z.B. virale RNA ¨ (Alexopoulou et al., 2001; Bai et al., 2002), bakterielle DNA (Hemmi et al., 2000; Hacker et al., 2002) ¨ oder andere bakterielle Komponenten (Hayashi et al., 2001). Bleibt eine Aktivierung durch lokale Gefahrensignale aus, so findet aufgrund der fehlenden Reifung der iDC keine Aktivierung des Immunsystems statt. Um eine Aktivierung des Immunsystems durch apoptotische Zellen zu verhindern, werden apoptotische Korper in Makrophagen aufgenommen, ohne dass Zellbestandteile austreten ¨ 1.2. Myasthenia gravis 11 (a) (b) Abb. 1.5.: Aktivierung von TH -Lymphozyten durch APC, die (a) durch Bindung von Bakterienstrukturen an ihre TLR, oder (b) durch Gefahrensignale aktiviert und zur Reifung angeregt werden. konnen (Reddy et al., 2002). Mit diesem Modell lasst sich auch die Notwendigkeit von Adjuvans bei ¨ ¨ der Immunisierung von Tieren mit Antigenen zur Ausbildung einer Immunantwort erklaren. Das Ad¨ juvans wirkt als Gefahrensignal und aktiviert die iDC. Nach ihrer Reifung werden dann prozessierte Antigene den Zellen des Immunsystems prasentiert und eine Immunantwort ausgelost. ¨ ¨ 1.2. Myasthenia gravis Da sowohl Angriffsort, als auch Mechanismus weitgehend bekannt sind, ist Myasthenia gravis eine der am besten untersuchten Autoimmunerkrankungen (Conti-Fine et al., 1997). Das Wort Myasthenie leitet sich aus dem Griechischen ab und bedeutet Muskelschwache. ¨ 1.2.1. Pathogenese Zum Krankheitsbild zahlt eine abnorme Ermudbarkeit und eine rasch zunehmende Schwache der ¨ ¨ ¨ ¨ quergestreiften Korpermuskulatur bei Belastung. Uberwiegend sind die Muskulatur des Auges, des ¨ Lids, sowie Nacken-, Hals- und Schultergurtelmuskulatur betroffen. Weiterhin kommt es zur Beein¨ trachtigung bei der mimischen Muskulatur, sowie bei Kau-, Schluck- und Sprechmuskulatur. Die ¨ Muskelschwache variiert dabei episodisch. Die Symptome gipfeln in der myasthenen Krise (Atemin¨ 12 1. Einleitung (a) (b) Abb. 1.6.: Vergleich einer gesunden und myasthenen Synapse - (a) Gesunde Synapse: Man erkennt den Axon-Fuß (AX) mit Mitochondrien und synaptischen Vesikeln, die ACh in den synaptischen Spalt (SC) ausschutten konnen. Der synaptische Spalt ist schmal und besitzt eine ¨ ¨ große Oberflache. (b): Myasthene Synapse: der synaptische Spalt ist stark geweitet und besitzt ¨ eine geringere Oberflache als bei einer gesunden Synapse (Illingworth, 2004). ¨ suffizienz) und schließlich im Tod des Patienten. Das Krankheitsbild ahnelt einer Vergiftung mit Cu¨ rare. Die Verabreichung von Pyridostigmin, einem Gegengift des Curare, fuhrt zu einer Verbesserung ¨ der Symptome. Es zeigte sich, dass eine Storung der neuromuskularen Reizubertragung zugrunde ¨ ¨ ¨ liegt, die eine Verringerung der Zahl funktionsfahiger nikotinischer Acetylcholinrezeptoren (AChR) ¨ in den motorischen Endplatten zur Ursache hat. 1.2.2. Mechanismus Myasthenia gravis hat seine Ursache in der Bildung von Autoantikorpern gegen den AChR durch au¨ toreaktive B-Lymphozyten. Diese Autoantikorper sind zum großen Teil gegen die -Untereinheit des ¨ AChR gerichtet. Andere Untereinheiten spielen bei der Pathogenese nur eine untergeordnete Rolle. Allerdings zeigen die Autoantikorper eine hohe Heterogenitat (Vincent et al., 1987). Die Bildung der ¨ ¨ Autoantikorper wird durch TH -Lymphozyten reguliert (Zhang et al., 1988), die allerdings andere Ab¨ schnitte auf dem AChR erkennen (Fujii und Lindstrom, 1988; Hohlfeld et al., 1988). Bei gesunden Menschen findet man keine Autoantikorper gegen den AChR im Blut, allerdings konnte die Existenz ¨ von TH -Lymphozyten, die spezifisch gegen den AChR reagieren nachgewiesen werden (Melms et al., 1992). Es existieren unterschiedliche Mechanismen die Symptome auslosen konnen. Diese sind im ¨ ¨ folgenden einzeln aufgefuhrt. ¨ 1.2. Myasthenia gravis 13 Kreuzvernetzung und Internalisierung der AChR Der Kreuzvernetzung der AChR durch Autoantikorper fuhrt zur Internalisierung durch Endozytose ¨ ¨ und zum Abbau der Rezeptoren durch lysosomale Enzyme. Dies bezeichnet man als antigenic modulation. Dabei wird die Halbwertszeit des AChR an der Zelloberflache von 7 auf 2 Tage reduziert. Zur ¨ Kompensation wird die AChR-Synthese, messbar durch die erhohten mRNA-Levels fur die -UE, ¨ ¨ gesteigert (Asher et al., 1993; Guyon et al., 1994). Eine Blockade der Acetylcholin-Bindungsstelle durch Autoantikorper gilt als pathophysiologisch irrelevant (Pumplin und Drachman, 1983). ¨ Fokale Lyse der postsynaptischen Membran Die Autoantikorper gegen den AChR sorgen nicht nur fur dessen Abbau, sondern konnen auch das ¨ ¨ ¨ Komplementsystem aktivieren. Durch Ausbildung des membranangreifenden Komplexes kann die postsynaptische Membran fokal lysiert werden. Allerdings kommt es nicht zur Lyse der kompletten Muskelfaser, da dieses sehr große Synzytium resistent gegen Abbauprozesse ist. Die Lyse fuhrt ¨ stattdessen zur Veranderung der Oberflachenstruktur der Membran (Abb 1.6). Es kommt zu einer ¨ ¨ Reduzierung der Faltungen, was zu einer Verringerung der Oberflache und einer geringeren AChR¨ Dichte im synaptischen Spalt fuhrt. Die fokale Lyse ist essentiell fur die Ausbildung von Myasthenia ¨ ¨ gravis und die antigenic modulation, da nur in Organismen die ein Komplementsystem besitzen, Experimentelle autoimmune Myasthenia gravis (EAMG) induziert werden kann. Moglicherweise wer¨ den bei der Lyse die Ankerpunkte des AChR im Zytoskelett in der Membran entfernt und somit die Endozytose des Rezeptors erleichtert (Lennon et al., 1978; Lennon und Lambert, 1981), welches die antigenic modulation vereinfacht. Tsujihata et al. zeigten in einem Rattenmodell, dass das Komplementsystem eine entscheidende Rolle beim Abbau der AChR, uber die fokale Lyse der postsynaptis¨ chen Membran, spielt (Tsujihata et al., 2003). Außerdem konnten sie zeigen, dass Makrophageninvasion in die postsynaptische Membran nur bei schwerer Erkrankung beobachtet werden kann und anscheinend ein sekundares Phanomen bei der Pathogenese der Myasthenia gravis darstellt. ¨ ¨ ¨ Der Anti-AChR-Antikorpertiter und die Schwere der Erkrankung Messungen des Titers der Anti-AChR-Antikorper im Blut myasthener Patienten, zeigen, das dieser ¨ nicht mit der Schwere der Erkrankung korreliert. Ein Maß fur die Schwere der Erkrankung ist daher ¨ nur die Zahl der AChR in der motorischen Endplatte. Dies liegt daran, dass ein Teil der Antikorp¨ er pathologisch irrelevante Teile erkennen und so nicht die pathologisch relevanten Mechanismen auslosen konnen (Lindstrom und Lambert, 1978). ¨ ¨ 1.2.3. Entstehung - Der Bruch der Toleranz Der eigentliche Ausloser von Autoimmunerkrankungen ist bis heute unbekannt und Gegenstand der ¨ Diskussion. Das Auftreten von Thymusveranderungen wird dabei sowohl als Ursache, als auch als ¨ 14 1. Einleitung Folge angesehen (Sonnichsen und Apostoloff, 1992). Prinzipiell ware die Ausbildung einer Autoim¨ ¨ munerkrankung dadurch moglich, dass die selbstprotektiven Kontrollmechanismen geschwacht sind, ¨ ¨ oder dass es zum Auftreten eines uberwaltigend starken positiven Stimulationssignal kame. Auch die ¨ ¨ ¨ Bildung von autoreaktiven Immunzellen bei der Affinitatsreifung konnte zur Ausbildung einer Au¨ ¨ toimmunerkrankung fuhren. Untersucht man die im Korper von gesunden Menschen vorkommenden ¨ ¨ autoreaktiven T- und B-Lymphozyten, so fehlen Klone die gegen Autoantigene gerichtet sind, die in hoher Konzentration im Korper vorkommen (z.B. Serumalbumin). Im folgenden soll eine Zusammen¨ fassung von moglichen Auslosern der Autoimmunerkrankung Myasthenia gravis gegeben werden. ¨ ¨ Molekularer Mimikry Mit der These der molekularen Mimikry beschaftigten sich Deitiker et al. (Deitiker et al., 2000). Sie ¨ durchsuchten Datenbanken nach gemeinsamen strukturellen Bereichen zwischen mikrobiellen Proteinen und den hauptantigenen Determinanten auf der humanen -UE des AChR. Sie fanden dabei hunderte Strukturen, die mogliche Kreuzreaktionen hervorrufen konnten. Die Synthese von einer ¨ ¨ Auswahl solcher Peptide und die Untersuchung der Reaktion mit Autoantikorpern myasthener Pa¨ tienten brachte eine große Anzahl von Kreuzreaktionen. Das Blut von gesunden Probanden zeigte keine Kreuzreaktion mit diesen Peptiden. Eine Infektion konnte also durchaus eine Kreuzreaktion ¨ mit korpereigenem AChR hervorrufen und somit eine Autoimmunerkrankung auslosen. ¨ ¨ Bei der Behandlung von Hepatitis C durch die Gabe von Interferon 2b entwickelte sich bei einem 56-jahrigen Mann Myasthenia gravis (Evoli et al., 2002). Die Ausbildung von Autoimmunerkran¨ kungen bei der Behandlung von Hepatitis C mit Interferonen ist seit langerem bekannt (Eibl et al., ¨ 2001; Fukuyama et al., 2000). Genetische Faktoren Der Einfluss von genetischen Faktoren auf die Entstehung von Autoimmunerkrankungen wird ebenfalls diskutiert, und die Identifikation von Krankheitsgenen ist Gegenstand der aktuellen Forschung (Morhahan und Morel, 2002). Bekannt ist, dass Menschen eines bestimmten HLA-Typs (engl.: human leukocyte antigen) haufiger an Myasthenia gravis erkranken (Compston et al., 1980; Nepom und ¨ Erlich, 1991; Yang et al., 1998). In Untersuchungen bei Mausen wurde gezeigt, dass eine Mutation im ¨ MHC die Ausbildung von EAMG nach der Immunisierung mit AChR verhindert (Christadoss et al., 1985; Bellone et al., 1991). Hormonelle Faktoren An verschiedenen Autoimmunerkrankungen wie z.B. Lupus erythematosus, Multiple Sklerose und early onset Myasthenia gravis erkranken signifikant haufiger Frauen als Manner. Dies ist ein Indiz ¨ ¨ fur den Einfluss von Hormonen und/oder die potentielle Beteiligung des X-Chromosoms (Whitacre, ¨ 2001). Matthews et al. untersuchten Autoantikorper von Frauen, die nach der Geburt an Myasthenia ¨ 1.2. Myasthenia gravis 15 gravis erkrankten. Sie konnten zeigen, dass eine Autoimmuisation mit fetalem AChR ein moglicher ¨ Weg zur Ausbildung von Myasthenia gravis bei der Mutter ist (Matthews et al., 2002). Die Beeinflussung der Immunantwort durch Hormone konnte dabei uber verschiedene Mechanismen ¨ ¨ geschehen. So waren eine Modulation der T-Lymphozyten, ein Einfluss auf die Expression von Ober¨ flachenrezeptoren und/oder Transkription und Translation von Genen fur Cytokine von Immunzellen ¨ ¨ denkbar (Talal und Ahmad, 1987; Whitacre et al., 1999). Fehlregulation der Apoptose Eine der wichtigsten Eigenschaften des Immunsystems ist seine homeostatische Kontrolle. Nach der Aktivierung und Eliminierung des Antigens muss die Lymphozytenzahl wieder auf den Stand vor der Aktivierung heruntergeregelt werden (Berzins et al., 1999). Dies wird durch ein Gleichgewicht zwischen Wachstum und Tod erreicht. Apoptose ist die Hauptursache fur das Absterben von Immunzellen ¨ (Krammer, 2000). Eine Fehlregulation der Apoptose konnte so eine Autoimmunerkrankung auslosen. ¨ ¨ Ein genetischer Defekt im CD95-CD95L System fuhrte in einem Mausmodell zur Ausbildung einer ¨ Erkrankung, deren Symptome ahnlich zu denen beim systemischen Lupus erythematosus sind (Na¨ gata, 1998). Bei Menschen fuhrt eine Mutation in der Death-Domane von CD95 zu ALPS (engl.: ¨ ¨ autoimmune lymphoproliferative syndrome). Charakteristisch fur die Erkrankung ist eine stark aus¨ gebildete Autoimmunitat (Rieux-Laucat et al., 1999). ¨ Ein erhohter Widerstand von autoreaktiven T-Lymphozyten gegenuber Apoptose fuhrte im Tierver¨ ¨ ¨ such ebenfalls zur Autoimmunitat (Zhou et al., 1999). Die Gabe von Substanzen, welche die Empfind¨ lichkeit von T-Lymphozyten gegenuber Apoptose steigern, fuhrte zu einer Verbesserung der Sym¨ ¨ ptome. Eine weitere Moglichkeit ware die Fehlregulation der Apoptose bei zellularen Bestandteilen der Anti¨ ¨ ¨ genprasentation und Selbst-Toleranz (Krammer, 2000). ¨ 1.2.4. Therapie Die Therapie von Myasthenia gravis richtet sich nach der Starke der Erkrankung. Allerdings konnen ¨ ¨ bisher nur die Symptome behandelt werden. Eine spezifisch gegen die Ursache gerichtete Therapie ist zur Zeit nicht moglich (Pascuzzi, 2001). In Abbildung 1.7 ist ein Therapieschema gezeigt, wie ¨ Myasthenia gravis aktuell behandelt werden kann. In einer 1937 veroffentlichten Studie von Kennedy und Moersch wurde der Krankheitsverlauf von 87 ¨ unbehandelten Patienten untersucht. Remission wurde in 31 % der Patienten beobachtet, wobei die Remission bis zu 15 Jahre anhielt (Mittel: 2,2 Jahre). Bei 46 Patienten wurde eine Verbesserung festgestellt, wahrend 28 an Myasthenia gravis verstarben. Kennedy und Moersch schlossen daher, dass ¨ die Tendenz zur Besserung bei Myasthenia gravis die Bewertung einer Therapie erschwert. Es konne ¨ 16 1. Einleitung Abb. 1.7.: Therapieschema bei Myasthenia gravis, vorgestellt von Prof. Dr. Newsom-Davis auf dem ESI-Kongress in Paris 2001. nie gesagt werden, ob die Besserung von der Therapie, oder der spontanen Remission verursacht wird (Kennedy und Moersch, 1937). Thymektomie Wird Myasthenia gravis bei Patienten diagnostiziert, so stellt man bei 80 % eine Vergroßerung des ¨ Thymus fest. Jeder zehnte Patient leidet an einem meist gutartigem Tumor des Thymus. Wird dieser entfernt, fuhrt es bei einem großen Teil der Patienten zu einer Verbesserung der Symptome. Dies ¨ wurde von Perlo bei der Betrachtung von 267 Patienten, die einer Thymektomie unterzogen wurden belegt (Perlo et al., 1971). Oftmals wird die Thymektomie auch bei, vor allem jungeren, Patienten, ¨ ohne verandertes Thymusgewebe durchgefuhrt. ¨ ¨ Acetylcholinesterasehemmer Um die Lebensdauer des Neurotransmitters Acetylcholin im synaptischen Spalt zu erhohen und so ¨ den Verlust an AChR im synaptischen Spalt zu kompensieren, werden Acetylcholinesterasehemmer 1.2. Myasthenia gravis 17 gegeben. Acetylcholinesterase ist ein Enzym, das im synaptischen Spalt den Abbau von Acetylcholin zu Acetat und Cholin katalysiert. Die Gabe von Acetylcholinesterasehemmern ermoglicht haufig ¨ ¨ bei schwacher bis moderater Myasthenie eine Behandlung ohne weitere Medikation. Patienten mit starken Symptomen benotigen eine Immuntherapie. ¨ Allgemeine Immunsuppression Aufgrund der autoreaktiven Eigenschaften des fehlregulierten Immunsystems ist die Gabe von unspezifischen Immunsuppressiva oftmals der einzige Weg, die Erkrankung zu kontrollieren. Anwendung finden hier Corticosteroide wie z.B. Prednison, aber auch nicht-steroide Immunsuppressiva wie z.B. Azathioprine oder Cyclosporin A. Als Ersatz fur das nierenschadigende Cyclosporin A sehen ¨ ¨ Evoli at al. Tacrolimus, ein Immunsuppressiva mit ahnlichem Wirkmechanismus, das allerdings um ¨ den Faktor 10-100 potenter ist (Evoli et al., 2002). Haufig werden zusatzlich Acetylcholinesterasen ¨ ¨ gegeben, um die Dosen und Nebenwirkungen der Immunsuppressiva so gering wie moglich zu halten. ¨ Plasmapherese und IVIg Zur Behandlung einer myasthenen Krise oder zur Vorbereitung der Patienten auf die Thymektomie empfiehlt sich die Plasmapherese, bei der das Blutplasma der Patienten ausgetauscht oder gefiltert wird. Dabei werden die pathogenen Autoantikorper und andere humorale Bestandteile des Immun¨ ¨ systems entfernt. Da nur ca. 45% der Autoantikorper intravaskular vorkommen, ist die Plasmapherese ¨ mehrmals durchzufuhren. Da nicht nur die pathogenen Antikorper, sondern auch die Komponenten ¨ ¨ des Komplementsystems entfernt werden, stellt sich innerhalb kurzer Zeit eine deutliche Verbesserung der Symptome ein (Thorlacius et al., 1988). Ein weitere Moglichkeit ist die sehr teure Behandlung mit intravenosem Immunglobulin (IVIg). ¨ ¨ IVIg besteht aus gereinigten Antikorpern von bis zu 20.000 gesunden Spendern und besitzt wie ¨ die Plasmapherese die Eigenschaft, die Symptome der Patienten in kurzer Zeit zu verbessern. Der Wirkmechanismus beruht auf der Neutralisation von pathogenen Auto-Antikorpern durch idiotypis¨ che Antikorper, Verstarkung des Antikorper-Katabolismus durch Sattigung von FcRn Transportrezep¨ ¨ ¨ ¨ toren, Unterdruckung von pathogenen Cytokinen, Hemmung der Komplementbildung und der Aus¨ bildung des membranangreifenden Komplexes, Blockade des Fc Rezeptors, sowie die Modulation der T-Lymphozyten Funktion (Dalakas, 1999). Rebooten" des Immunsystems " Durch die Gabe von hohen Dosen an Cyclophosphamid konnen alle Zellen des Immunsystems aus¨ geschaltet werden, ohne die Stammzellen des Knochenmarks zu schadigen (Brodsky et al., 1996). ¨ Verantwortlich dafur ist das Enzym Aldehyddehydrogenase, welches von den Stammzellen exprim¨ iert wird und in der Lage ist Cyclophosphamid zu deaktivieren. Drachman et al. beschrieben die Behandlung von Patienten mit Myasthenia gravis mit Hilfe dieser Methode (Drachman et al., 2003). 18 1. Einleitung Sie konnten zeigen, dass das neu gebildete Immunsystem eine Toleranz gegenuber dem Autoanti¨ gen AChR entwickelt. Die Patienten, die nicht durch konventionelle immunsuppressive Therapien behandelt werden konnten, zeigten nach der Behandlung mit Cyclophosphamid keine myasthenen Symptome mehr. 1.2.5. Experimentelle autoimmune Myasthenia gravis (EAMG) Ein etabliertes Tiermodell zur in vivo Untersuchung von Myasthenia gravis, ist die sog. Experimentelle autoimmune Myasthenia gravis (EAMG) (Lennon et al., 1975). Patrick et al. beschrieben erstmals 1973 die Ausbildung einer Muskelschwache in Hasen durch die Immunisierung mit aus ¨ Electrophorus electricus isoliertem, komplettem AChR. Die Symptome konnten wie bei humaner Myasthenia gravis durch die Gabe von Acetylcholinesterasehemmern verbessert werden. ¨ Seybold et. al. konnten das Modell auf Ratten ubertragen und lieferten einen detaillierten Uberblick ¨ uber die klinischen und elektrophysiologischen Eigenschaften der Erkrankung (Seybold et al., 1976). ¨ Sie verwendeten 10 Wochen alte Lewis-Ratten zur Immunisierung mit unterschiedlich hohen Dosen an AChR. Seybold et. al. beschrieben den Krankheitsverlauf der EAMG bei Ratten wie folgt: Es konnten zwei Episoden charakterisiert werden. Nach einer Gabe von hohen Dosen an AChR, beobachteten sie zwischen Tag 7 und 15 nach Immunisierung, eine akute Phase der Erkrankung. Eine Verbesserung der Symptome fand dann nach weiteren 2 bis 3 Tagen statt. In den folgenden Tagen verhielten sich die Ratten vollig normal, bis eine Episode mit starker Schwache zwischen Tag 26 und 35 begann. ¨ ¨ In dieser Zeit kam es zu merklichem Gewichtsverlust und zu einer Schwache der Kaumuskulatur, ¨ charakterisiert durch das starke Wachstum der Zahne. Der Gewichtsverlust konnte durch die Gabe ¨ von weichem Futter auf dem Kafigboden verzogert werden. Beim Fortschreiten der Erkrankung kam ¨ ¨ es langsam zum Tod der Tiere. Der Ausbruch der Erkrankung ist bei kleinen Dosen oftmals nur durch elektrophysiologische Untersuchungen erkennbar (Kreilinger, 2001). Bei der Reizung des Ischiasnerv (Nervus ischiadicus) und der Messung der Ableitung an der Muskulatur des Unterschenkels, kam es bei einer repetitiven Nervenstimulation (RNS) zu einer deutlichen Signalabnahme. Bei der Durchfuhrung der Messung ¨ zeigte sich bei Kreilinger, dass selbst Ratten mit einem hohen Dekrementwert optisch keine myasthenen Symptome zeigen mussen. ¨ 1.3. Antigenspezifische Immunsuppression Aufgrund der großen Anzahl von Nebenwirkungen von unspezifischen immunsuppressiven Therapien, ware eine spezifische immunsuppressive Therapie fur den Patienten wunschenswert. Da sowohl die ¨ ¨ ¨ 1.3. Antigenspezifische Immunsuppression 19 antigene Struktur des nikotinischen AChR, als auch die pathologischen Mechanismen bei Myasthenia gravis bekannt sind, gibt es eine Reihe viel versprechender Ansatze. Allerdings ist der Ausloser fur ¨ ¨ ¨ Myasthenia gravis bisher unbekannt. Daher beschranken sich die Therapieansatze auf die Ausschal¨ ¨ tung oder Unterdruckung autoreaktiver B- oder T-Lymphozyten, sowie auf Versuche zur Toleranzin¨ duktion. 1.3.1. B-Zellen im Visier - Immuntoxine Im Arbeitskreis von Prof. Dr. W. E. Trommer gelang die Synthese eines chemisch gekoppelten T-AChR-Gelonin-Konjugats, bei dem der komplette AChR aus Torpedo californica mit Gelonin gekoppelt wurde (Brust et al., 1987). Urbatsch et al. konnten durch elektrophysiologische Untersuchungen zeigen, dass eine Gabe des Konjugats die Zahl der funktionsfahigen AChR deutlich steigerte ¨ (Urbatsch et al., 1993). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der Einsatz des Konjugats zu einer antigenspezifischen Immunsuppression fuhrte, da das Immunsystem normale Reaktion gegen Kon¨ trollantigene zeigte. Allerdings kam es zu einem Anstieg des Antikorpertiters gegen den AChR. ¨ Vermutlich ausgelost durch die Immunantwort gegen pathologisch irrelevante Teile des Rezeptors. ¨ Auch konnte das Konjugat nicht vollstandig von ungekoppeltem T-AChR saulenchromatographisch ¨ ¨ getrennt werden, da sich die Molekularmassen aufgrund des Einsatzes des kompletten T-AChR kaum unterschieden (280 zu 250 kD) und eine quantitative Kopplung nicht gelang. Die Verwendung von AChR-Ricin Konjugaten bei der antigenspezifischen Immunsuppression von EAMG in vitro wurde bereits beschrieben (Killen und Lindstrom, 1984; Olsberg et al., 1985). In einem anderen Versuch konnten Sterz et al. die Ausbildung der EAMG, durch Gabe von radioaktiv markiertem Acetylcholinrezeptor verhindern (Sterz et al., 1985). 1.3.2. T-Zellen im Visier Der Einsatz von Immuntoxinen gegen B-Lymphozyten besitzt einen Nachteil. Sie sezernieren Antikorper, die gegen die Immuntoxine spezifisch binden. Bei einer ausgebrochenen Autoimmuner¨ krankung befinden sich diese Antikorper im Blut des Patienten und sind so in der Lage Immuntoxine ¨ abzufangen. Ein weiterer Ansatzpunkt zur antigenspezifischen Therapie von Autoimmunerkrankungen ware das Ausschalten von T-Lymphozyten. ¨ Immunisierung mit dem TCR Fur T-Lymphozyten vermittelte Autoimmunerkrankungen zeigten Cohen et. al. eine Moglichkeit Un¨ ¨ empfindlichkeit gegen ein Antigen auszulosen, wenn die Tiere mit dem spezifischen TCR immunisiert ¨ ¨ wurden (Cohen et al., 1983). Die Ubertragbarkeit auf eine humoral-vermittelte Erkrankung wie Myasthenia gravis wurde untersucht, fuhrte allerdings zu keinem Erfolg (Kahn et al., 1990). ¨ 20 1. Einleitung Suppressive Makrophagen McIntosh und Drachman beschrieben die Auslosung von Apoptose in aktivierten Blasten von T-Lym¨ phozyten durch suppressive Makrophagen in vitro (McIntosh und Drachman, 1999). Dabei wurden große suppressive Makrophagen (LSM, engl.: large suppressive macrophages) aus Milzzellen von EAMG-Ratten mit dem Autoantigen AChR und Cyclosporin A in vitro restimuliert. Diese LSM bewirkten die Apoptose von spezifisch gegen den AChR gerichteten T-Lymphozyten. ¨ Antiidiotypische Antikorper Ein weiterer antigenspezifischer Weg der Therapie ware das Design von antiidiotypischen Antikorpern ¨ ¨ gegen die pathogenen Anti-AChR-Antikorper und/oder die TCR der pathogenen T-Lymphozyten. ¨ Araga et al. beschrieben die computerunterstutzte Synthese von Peptiden, komplementar zu den ¨ ¨ krankheitsauslosenden Epitopen bei EAMG. Werden diese Peptide appliziert, bilden die Tiere Anti¨ korper gegen diese Peptide, welche Kreuzreaktionen mit anti-AChR-Antikorpern und/oder T- und ¨ ¨ B-Zell Rezeptoren eingehen konnten (Araga et al., 2000). Sie konnten zeigen, dass die gebildeten ¨ Antikorper die Proliferation von AChR-spezifischen Lymphozyten inhibieren, den AChR-Antikorper¨ ¨ Titer senkten, AChR-Abbau verhinderten und die Schwere der EAMG lindern konnten. 1.3.3. Verwendung von APC Die autoimmunen T-Lymphozytenklone bei Myasthenia gravis sind gegen eine große Anzahl von Epitopen auf dem AChR gerichtet (Fujii und Lindstrom, 1988; Brocke et al., 1988; Melms et al., 1989; Melms et al., 1992). Aufgrund dieser Heterogenitat der Erkrankung ist eine Therapie gegen ein¨ zelne Klone nicht in Betracht zu ziehen. Da T-Lymphozyten Peptide nur nach Prasentation mit MHC¨ Proteinen erkennen, kommt aufgrund deren Unterschiede von Patient zu Patient eine weitere Stufe der Heterogenitat dazu. Das Immunsystem bietet allerdings eine Moglichkeit, alle T-Lymphozytenklone ¨ ¨ spezifisch zu erreichen. Das ist die Aufgabe der APC. B-Lymphozyten prozessieren und prasentieren ¨ nur Antigene, die sie an ihren spezifischen IgM Oberflachenrezeptoren gebunden haben. Gibt man ¨ zu B-Lymphozyten AChR, sowie einen bifunktionellen Antikorper gegen IgM und den AChR, so ¨ prozessieren diese Zellen den AChR und sind in der Lage antigenspezifisch T-Lymphozyten zu erkennen (Reim et al., 1992). Nach der Fixierung waren diesen Zellen in der Lage, antigenspezifisch Anergy in T-Lymphozyten zu induzieren. 1.3.4. Orale Toleranz Die Ausbildung von Toleranz gegenuber oral aufgenommenen Proteinen ist schon lange bekannt ¨ (Mowat, 1987). Die Ausnutzung oraler und nasaler Wege bei der Verhinderung und Behandlung von Autoimmunerkrankungen ist eine neuere Entwicklung (Weiner und Mayer, 1996). Die meis- 1.4. Der nikotinische Acetylcholinrezeptor 21 ten Studien zur oralen Toleranz in Autoimmunerkrankungen beschaftigten sich mit Zell-vermittelten ¨ Erkrankungen wie Uveitis, Arthritis und Multiple Sklerose (Nussenblatt et al., 1990; Nagler-Anderson et al., 1986; Bitar und Whitacre, 1988). Bei Antikorper-vermittelten Erkrankungen wie Myasthenia ¨ gravis zeigten Okumura et al., dass die orale Gabe von T-AChR vor der Immunisierung der Ratten die Ausbildung klinischer Zeichen der EAMG verhinderte und die Autoantikorperproduktion und ¨ Zellproliferation inhibierte (Okumura et al., 1994). Bei laufender EAMG konnte im besten Fall ein fehlender Einfluss auf die Erkrankung beobachtet werden. Klinische Studien bei Multiple Sklerose und rheumatischer Arthritis verliefen enttauschend (Weiner et al., 1993; Trentham, 1998). Die spe¨ zifische Therapie von Autoimmunerkrankungen wie Myasthenia gravis durch Induktion von oraler Toleranz erscheint nicht viel versprechend. 1.4. Der nikotinische Acetylcholinrezeptor Beim nikotinische Acetylcholinrezeptor (AChR) handelt es sich um einen Ionenkanal, der nach seinem Agonisten Nikotin benannt ist. Er befindet sich in der Membran der Neuronen und Muskelzellen und ¨ ist an der Ubertragung der Nervenimpulse beteiligt. Der Mechanismus der Ionenkanaloffnung wurde ¨ ¨ von Miyazawa et al. aufgeklart (Miyazawa et al., 2003). 1.4.1. Struktur Der nikotinische AChR gehort zur Superfamilie der ligandengesteuerten Ionenkanale, zu denen auch ¨ ¨ ¨ die GABAA und Glycinrezeptoren gehoren. Sie besitzen eine gemeinsame Organisation von hydrophilen und hydrophoben Domanen. Der AChR besitzt eine heteropentamere Struktur, bestehend aus ¨ vier homologen Untereinheiten. Bisher wurden 16 Typen von Untereinheiten unterschiedlicher Spezies ¨ identifiziert. Diese beeinhalten 1-9, 1-4, sowie die , und -Untereinheit. Bei muskularen AChR findet man die Stochiometrie (1)2 (1). In der fetalen Form wird dabei durch ersetzt. Die ¨ Organisation der Untereinheiten um den zentralen Ionenkanal entspricht symmetrisch angeordneten Zylindern in der Reihenfolge (Kreienkamp et al., 1995). Im Zytoplasma bindet der AChR an Rapsyn, ein Protein das die AChR mit dem Zytoskelett verbindet und zur dichten Packung der AChR beitragt (Sanes und Lichtman, 1999). ¨ ° In einer Kristallstruktur des T-AChR mit einer Auflosung von 4,6 A wurde dessen Durchmesser zu ¨ ° ° ° 80 A und die Lange auf 120 A bestimmt (Miyazawa et al., 1999). Davon entfallen 65 A auf den ex¨ ° ° trazellularen Bereich, 40 A auf den Transmembranbereich und 15 A auf den intrazellularen Bereich. ¨ ¨ Die Untereinheiten bestehen aus einem N-terminalen extrazellularen Bereich der ca. 220 Aminosau¨ ¨ ren umfasst, gefolgt von 4 Transmembrandomanen und einem kleinen C-terminalen extrazellularen ¨ ¨ Bereich. Von entscheidender Bedeutung fur den AChR ist der N-terminale extrazellulare Bereich der ¨ ¨ 22 1. Einleitung Spezies MIR (H--AChR67-76 ) Mensch WNPDDYGGVK Maus (Mus musculus) WNPDDYGGVK Ratte (Rattus norvegicus) WNPDDYGGVK Motte (Heliothis virescens) WEPREYGGVE Wanderheuschrecke (Locusta migratoria) WNPDDYGGVD Kugelfisch (Takifugu rubripes) WNPDDYGGIR Zitterrochen (Torpedo californica) WNPADYGGIK AChBP WNSSH--SPD cys-loop (H--AChR185-195 ) KHSVTYSCCPD KHWVFYSCCPT KHWVFYSCCPN RNEKFYTCC-D RNEKFYTCC-D KHWVYYTCCPD KHWVYYTCCPD KNSVTYSCCPE Tab. 1.1.: Aminosaurensequenz der MIR und des cys-loop bei verschiedenen Spezies. Zum ¨ Vergleich ist die jeweils homologe Sequenz beim AChBP aufgef uhrt (AChBP66-74 bzw. ¨ AChBP182-192 ). Zur humanen Sequenz identische Aminos auren sind unterstrichen dargestellt. ¨ -Untereinheit. ¨ 1.4.2. Der extrazellulare Teil der -Untereinheit Die Bindungsstelle fur den Agonisten Acetylcholin befindet sich auf dem extrazellularen Bereich der ¨ ¨ -Untereinheit bei den Aminosauren 149 und 190-198 (Dennis et al., 1988). Allerdings tragen auch ¨ Aminosauren im extrazellularen Bereich der bzw. zur Ligandenbindung bei. Die kleine extrazel¨ ¨ lulare C-terminale Domane der -Untereinheit spielt dabei eine zu vernachlassigende Rolle (Eise¨ ¨ ¨ ¨ le et al., 1993). Zur Offnung des Ionenkanals mussen beide ACh-Bindungsstellen besetzt sein. Die ¨ ¨ Bindung eines Antagonisten verhindert die Offnung des Ionenkanals. Der Mensch besitzt neben der 1-UE zusatzlich eine um 25 Aminosauren verlangerte Isoform 1 + ¨ ¨ ¨ (Beeson et al., 1990). Die 1+-UE bindet analog zur 1-UE -Bungarotoxin und monoklonale Antikorper gegen die hauptimmunogene Region (MIR, engl.: main immunogenic region). Die Ausbil¨ dung von funktionsfahigen Rezeptoren wurde nicht beobachtet (Newland et al., 1995). Die Funktion ¨ der Isoform ist bis heute unklar. Der extrazellulare Teil der -Untereinheit ist nicht nur aufgrund der Bindungsstelle fur die Ago¨ ¨ nisten und Antagonisten interessant, sondern auch im Hinblick auf Myasthenia gravis. Der großte ¨ Teil der Autoantikorper (mehr als 60 %) bindet an die MIR, die sich bei den Aminosauren 67-76 ¨ ¨ auf dem extrazellularen Teil der -Untereinheit befindet (Tzartos et al., 1988). Allerdings wird nicht ¨ ausgeschlossen, dass auch andere Aminosauren an der Bindung der Antikorper beteiligt sind, indem ¨ ¨ sie u.a. zur Faltung der MIR beitragen. Durch die Lokalisierung der MIR konnte die Kreuzreaktion der Autoantikorper bei AChR unterschiedlicher Spezies erklart werden. Diese Sequenz ist hoch kon¨ ¨ serviert (Tab. 1.1). 2001 gelangen Brejc et al. die Losung einer hochaufgelosten Kristallstruktur eines Acetylcholin¨ ¨ bindenden Proteins (AChBP) aus Lymnaea stagnalis. In Hefe rekombinant exprimiert, bildete es Ho- 1.4. Der nikotinische Acetylcholinrezeptor 23 20 30 40 50 H-AChR(4-208) VRPVEDHRQVVEVTVGLQLIQLINVDEVNQIVTTNVRLKQQW : :.. : :. :.:.:..:....:.:... : . .: AChBP VIPTQRDRPVA-VSVSLKFINILEVNEITNEVDVVFWQQTTW 20 30 40 50 60 70 80 90 100 H-AChR(4-208) VDYNLKWNPDDYGGVKKIHIPSEKIWRPDLVLYNNADGDFAI : .: :: . . .. .: ..: :::. :: . .. AChBP SDRTLAWNSSH--SPDQVSVPISSLWVPDLAAYNAISKPEVL 60 70 80 90 110 120 130 140 H-AChR(4-208) V-KFTKVLLQYTGHITWTPPAIFKSYCEIIVTHFPFDEQNCS . ....:. . :.. . : . :.. . . .: AChBP TPQLARVVSD--GEVLYMPSIRQRFSCDVSGVDTE-SGATCR 110 120 130 150 160 170 180 H-AChR(4-208) MKLGTWTYDGSVVAINPESDQPDLSN-FMESGEWVIKESRGW .:.:.::. . ....: ... : :. : . ... : . AChBP IKIGSWTHHSREISVDPTTENSDDSEYFSQYSRFEILDVTQK 140 150 160 170 190 H-AChR(4-208) KHSVTYSCCPDTPYLDI :.::::::::.. : :. AChBP KNSVTYSCCPEA-YEDV 190 Abb. 1.8.: Struktur und Aminosauresequenz des ACBP - (a) Struktur eines AChBP-Monomers, ¨ hervorgehoben ist der cys-loop bei den Aminos auren 189/190 (gelb) und die zur MIR auf dem ¨ AChR homologe Region (blau). (b) Sequenzvergleich AChBP und H--AChR4-208 . Gleiche Aminosauren sind mit einem Doppelpunkt (:) gekennzeichnet, homologe mit einem Punkt (.). ¨ mopentamere, und in Ligandenbindungsassays zeigte es Eigenschaften von nikotinischen und muskarinischen AChR (Brejc et al., 2001; Smit et al., 2001). Das Protein wird bei der Aktivierung von Rezeptoren auf Gliazellen durch ACh ausgeschuttet und moduliert im synaptischen Spalt die ¨ ACh-Konzentration. Bei einem Vergleich der Aminosauresequenz mit dem extrazellularen Bereich ¨ ¨ der -UE des humanen nikotinischen AChR zeigte sich eine hohe Homologie der strukturbildenden Aminosauren, wie z.B. dem cys-loop bei den Aminosauren 189/190 im AChBP (siehe auch Abb. 1.8). ¨ ¨ Auf Grundlage der Struktur des AChBP konnte die Bedeutung der aromatischen Tasche, die durch Trp-Reste gebildet wird, bei der Ligandenerkennung gezeigt werden (Hansen et al., 2002). Auch ¨ zeigten die Bindungskinetiken der Liganden eine Ubereinstimmung mit denen fur viele Subtypen ¨ des nikotinischen AChR. Somit kann das AChBP als Modellprotein fur den extrazellularen Teil der ¨ ¨ ¨ -Untereinheit des nikotinischen AChR (-AChRex ) angesehen werden, fur den bisher, aufgrund zu geringer Mengen an rekombinantem Protein, noch keine Kristallisation gelang. Die Expression von -AChRex gelang bisher in E.coli verschiedenen Gruppen unter Verwendung von T--AChRex,1-209 (Schrattenholz et al., 1998; Alexeev et al., 1999) und H--AChRex,1-207 (Tsouloufis et al., 2000). Alle Gruppen konnten das Protein nur in unloslichen inclusion bodies exprimieren. Da¨ her musste es denaturierend aufgearbeitet und ruckgefaltet werden. Dies ist mit hohem Aufwand und ¨ Proteinverlust verbunden. Die renaturierten Proteine zeigten eine geringe Loslichkeit und waren nicht ¨ fur Kristallisationsexperimente geeignet. Die unabhangige Faltung der N-terminalen extrazellularen ¨ ¨ ¨ und der membrangebundenen Domane der -Untereinheit wurde mit Hilfe von Chimarenrezeptoren ¨ ¨ gezeigt (Eisele et al., 1993). 24 1. Einleitung 1.5. Ribosomen-inaktivierende Proteine Ribosomen-inaktivierende Proteine (RIP) gehoren zur Klasse der Polynukleotid-Adenosin Glykosi¨ dasen (PNAG) (EC 3.2.2.22). Sie sind in der Lage eukaryontische Ribosomen durch Deaktivierung der 60 S Untereinheit zu hemmen und so die Bindung des Elongationsfaktors zu verhindern. Die Wirkung ist irreversibel, da die Enzyme eine Purinbase abspalten. Die Substratspezifitat ist aller¨ dings viel großer als angenommen. So depurinieren alle Enzyme DNA, manche von ihnen auch an¨ dere Polynukleotide, wie nicht-ribosomale RNA und poly(A) (Barbieri et al., 1997). Bis heute ist ¨ die naturliche Rolle der RIP in der Pflanze unbekannt. Aufgrund der großen Substratspezifitat wird ¨ angenommen, dass RIP verschiedene Aufgaben ausfullen. Diskutiert werden antivirale und antifun¨ gale Aufgaben (Leads et al., 1991; Huang et al., 1992), eine Rolle bei der Abwehr von Fraßfeinden, sowie beim programmierten Stoppen des Metabolismus bei Alterungsprozessen (Barbieri et al., 1993). Man unterscheidet zwei verschiedene Typen von RIP. RIP des Typ I sind Einzelkettenproteine, die nur aus einer aktiven Polypeptidkette (A-Kette) bestehen und nicht ohne fremde Hilfe in intakte Zellen gelangen konnen. Diese sind sehr stabil uber einen großen Bereich von physiko-chemischen Bedin¨ ¨ gungen. Die RIP des Typs II besitzen zusatzlich zur aktiven A-Kette eine zweite Polypeptidkette, die ¨ durch eine Disulfidbrucke mit der A-Kette verbunden ist. Diese B-(bindende) Kette ermoglicht den ¨ ¨ Transport des RIP in eine intakte Zelle. Aufgrund dieser Eigenschaft sind RIP vom Typ II um viele Zehnerpotenzen potentere Toxine gegenuber intakten Zellen. ¨ 1.5.1. Einsatz in der Medizin Beim Eindringen von RIP in Zellen, sterben diese aufgrund der Hemmung der Proteinbiosynthese. Da die selektive Ausschaltung von pathogenen Zellen von großem Interesse in der Therapie von Autoimmunerkrankungen und Krebs ist, wird der Einsatz von RIP intensiv untersucht. Nach der Kopplung mit einem Antigen (bei Autoimmunerkrankungen), Antikorper (bei Krebs) oder einem anderen Car¨ rier, konnten diese Proteinkonjugate zur selektiven Therapie eingesetzt werden (Brust et al., 1987; ¨ Urbatsch et al., 1993; Lambert et al., 1988; Rybak et al., 1994; Vitetta und Uhr, 1985). Der mogliche ¨ Einsatz gegen Malaria (Surolia und Misquith, 1996; Nicolas et al., 1997) und AIDS (Zarling et al., 1990) wurde ebenfalls berichtet. Beim Einsatz in Immunkonjugaten erwies sich Gelonin effektiver als die A-Kette von Ricin (Fishwild et al., 1994). 1.5.2. Wirkmechanismus RIP spalten katalytisch eine N-glykosidische Bindung eines spezifischen Adenin-Restes in der 28 S ribosomalen RNA der 60 S Untereinheit von eukaryontischen Ribosomen. Bei der Inkubation mit 1.5. Ribosomen-inaktivierende Proteine 25 (a) (b) Abb. 1.9.: Struktur von rekombinantem Ricin (A-Kette). Eingezeichnet sind der N-Terminus (rot), der C-Terminus (gelb) und die katalytisch aktiven Aminos auren Tyr80, Glu177, Arg180 ¨ und Tyr123 (blau). Die Abb. (a) und (b) sind um 180° gedreht. isolierter rRNA, zeigen RIP die gleiche Reaktivitat, allerdings ist ihre Aktivitat merklich reduziert. ¨ ¨ Es konnte gezeigt werden, dass das Substrat eine Haarnadelschleife ist, welches die Sequenz GAGA enthalt. Dabei wird das erste Adenin durch eine Hydrolysereaktion abgespalten (Endo et al., 1987). ¨ Die Erklarung fur die Spezifitat kann durch spezifische Wasserstoffbruckenbindungen zwischen dem ¨ ¨ ¨ ¨ Adenin und dem RIP erklart werden. Auf Basis von Rontgenstrukturen wurden zwei mogliche Mech¨ ¨ ¨ anismen fur die Hydrolysereaktion vorgeschlagen (Ren et al., 1994; Monzingo und Robertus, 1992). ¨ 1.5.3. Gelonin Gelonin ist ein Glykoprotein, das in den Samen von Gelonium multiflorum gefunden und erstmals von Stirpe isoliert wurde (Stirpe et al., 1980). Es handelt sich um ein RIP des Typ I und ist somit untoxisch bei intakten Zellen. ° Hosur et. al. gelangen die Losung einer Rontgenstruktur von Gelonin mit einer Auflosung von 1,8 A ¨ ¨ ¨ (Abb. 1.9) (Hosur et al., 1995). Sie konnten zeigen, dass Gelonin eine ahnliche Faltung wie die A¨ Kette von Ricin besitzt. Die Aminosauren Tyr74, Gly111, Tyr113, Glu166, Arg169 und Trp198 for¨ men das aktive Zentrum, wie es auch bei anderen RIP gefunden wird (Kim und Robertus, 1992; Ren et al., 1994). In der Rontgenstruktur konnten drei Wassermolekule in der Hohle des aktiven Zentrums ¨ ¨ ¨ ¨ ¨ ¨ aufgelost werden. Jedes dieser Molekule konnte das Substratmolekul sein, das an der Hydrolyse¨ reaktion beteiligt ist, welche Gelonin katalysiert. Gelonin besitzt in seiner Aminosauresequenz zwei ¨ 26 1. Einleitung mogliche Stellen fur eine N-Glykosylierung. Der Ort wurde von Hosur et. al. aufgrund eines Un¨ ¨ terschiedes in der Elektronendichte bei Asn189 bestimmt. Die zweite mogliche Bindungsstelle ist ¨ unbesetzt. Die Zuckerzusammensetzung konnte bisher nicht genau bestimmt werden. Weiterhin besitzt Gelonin eine Disulfidbruche bei Cys44 und Cys50. ¨ In vivo Versuche zeigten, dass Gelonin nach i.v. Gabe sehr schnell in der Leber endozytiert wird (Colaco et al., 2002). Gelonin konnte dabei in der zytosolischen Fraktion der Leberzellen nachgewiesen ¨ werden. Der Ubergang von Endosomen und Lysosomen ins Zytosol wurde von Selboa et al. gezeigt (Selbo et al., 2000). 27 2. Problemstellung Wie bereits beschrieben, ist bisher keine kausale Therapie der Autoimmunerkrankung Myasthenia gravis bekannt. Durch die etablierten Behandlungsmethoden werden bisher nur die Symptome der Erkrankung bekampft. Von großem Vorteil fur die Patienten waren spezifische immunsuppressive ¨ ¨ ¨ Therapien, die nur Immunzellen im Korper ausschalten, welche fur die Immunantwort gegen den ¨ ¨ korpereigenen AChR verantwortlich sind. Ein moglicher Ansatz sind Konjugate aus dem Autoantigen ¨ ¨ AChR und einem Zellgift. Wahrend der AChR von den autoreaktiven Immunzellen erkannt wird und ¨ fur die Aufnahme des Konjugats in die Immunzelle sorgt, entwickelt das Toxin in der Zelle seine ¨ toxischen Eigenschaften und totet sie. ¨ Der Einsatz von chemisch gekoppelten Konjugaten aus dem kompletten AChR und dem Pflanzentoxin Gelonin fuhrte im Rattenmodell der Myasthenia gravis zu einer deutlichen Erhohung der AChR-Zahl ¨ ¨ im synaptischen Spalt (Brust et al., 1987; Urbatsch et al., 1993). Bei der Therapie kam es allerdings zum Anstieg des Antikorpertiters gegen den AChR, was durch Kreuzreaktionen mit patholo¨ gisch irrelevanten Teilen erklart werden konnte. Bei der Synthese der Konjugate wurde der komplette ¨ AChR aus Torpedo californica eingesetzt. Da dessen Abtrennung vom Konjugat aufgrund des geringen Molekularmassenunterschieds nicht vollstandig moglich war, wurden Versuche unternommen, ¨ ¨ nur -AChRex -Fragmente bei der Synthese der Konjugate einzusetzen. Die Isolierung von nativen -AChRex -Fragmenten schlug im Arbeitskreis fehl (Rousselle, 1996; Kreilinger, 2001; Hossann, 2001). Ursache durfte das Fehlen von strukturbildenden Aminosauren ¨ ¨ gewesen sein. Die Synthese eines Konjugats aus chemisch gekoppelten T--AChR 1-209 -Fragmentes (Schrattenholz et al., 1998), das uns freundlicherweise von Prof. Maelicke zur Verfugung gestellt ¨ wurde und Gelonin aus Gelonium multiflorum gelang schließlich (Kreilinger, 2001; Hossann, 2001). Aufgrund der geringen uns zur Verfugung stehenden Menge und der Instabilitat des T--AChR 1-209 ¨ ¨ Fragmentes waren allerdings keine weiterfuhrenden Versuche moglich. ¨ ¨ Im Arbeitskreis gelang Li die Synthese eines Expressionsplasmids fur ein Fusionsprotein aus einem ¨ (T) Gelonin- und H--AChRex -Fragment (His6 -Gelonin1-246-H--AChR4-181 ) (Li, 2002). Li isolierte das Protein mit Hilfe von Großenausschluss- und Ionenaustauscherchromatographie, obwohl im Fu¨ sionsprotein ein N-terminaler HisTag vorlag. Ein Ziel dieser Arbeit war die Isolierung und Charakterisierung des Fusionsproteins mit Hilfe der Nickel-Affinitatschromatographie und der Einsatz in der ¨ antigenspezifischen Immunsuppression im Rattenmodell der Myasthenia gravis. In einem weiteren Versuch sollte untersucht werden, ob auch das von Li isolierte rekombinante 28 2. Problemstellung Gelonin uber einen HisTag verfugte. Beim Vorliegen sollte das Protein exprimiert und die Nickel¨ ¨ Affinitatschromatographie zur Aufreinigung des Proteins verwendet werden. Anschließend sollte der ¨ HisTag abgespalten und dessen Einfluss auf die Toxizitat bestimmt werden. ¨ ¨ Um die Expression von nativen -AChRex -Fragmenten zu ermoglichen, sollte die DNA-Information ¨ fur -AChR4-181 auf dem Plasmid pHE706 durch molekularbiologische Arbeiten verlangert wer¨ den. Dazu sollte mit synthetischen Oligonukleotiden die Information fur -AChR 182-208 in den Vek¨ tor einkloniert werden. In einem abschließenden Teil der Arbeit, sollte eine mogliche antigenspezifische immunsuppressive ¨ Wirkung des Fusionsproteins in vivo untersucht werden. Dazu war in Ratten, mit Hilfe des T-AChR, das Tiermodell der Myasthenia gravis zu induzieren. Mit Hilfe von im Arbeitskreis zu etablierenden elektrophysiologischen Untersuchungen, der sog. repetitiven Nervenstimulation (RNS) des Ischiasnerv (Nervus ischiadicus), sollte das Vorliegen der Erkrankung nachgewiesen und durch Gabe des Fusionsproteins therapiert werden. 29 3. Chemische Deglykosylierung von naturlichem Gelonin ¨ 3.1. Aufgabenstellung Die Aminosaurensequenz des aus Gelonium multiflorum isoliertem Gelonin wurde erstmals 1993 von ¨ Nolan et al. bestimmt (Nolan et al., 1993). Es gelang die Klonierung und Expression von rekombinantem Gelonin in E.coli als Fusionsprotein mit einer Leadersequenz, welche die Sekretion des Proteins durch die zytoplasmatische Membran der E.coli erlaubte. Die Aminosaurensequenz wurde dabei ¨ durch PCR Amplifikation von cDNA mit Oligonukleotiden bestimmt und umfasste 251 Aminosauren. ¨ Rosenblum et al. fanden 1995 eine um 7 Aminosauren langere Sequenz (Rosenblum et al., 1995). ¨ ¨ Hier gelang die Aufklarung der Aminosaurensequenz durch Proteinsequenzierung. Die Sequenzun¨ ¨ terschiede sind in Abb. A.1 dargestellt. Bis heute konnte nicht gezeigt werden, welche der beiden Sequenzen dem naturlichen Gelonin entspricht. Ein Hinweis auf die von Nolan bestimmte Aminosauren¨ ¨ sequenz lieferte die Losung der Rontgenstruktur (Hosur et al., 1995). ¨ ¨ Naturliches Gelonin besitzt eine posttranslationale Modifizierung durch Zuckerreste (Glykosylierung) ¨ (Stirpe et al., 1980). Dabei existieren unterschiedlich stark glykosylierte Spezies (Hossann, 2001). Durch vollstandige Deglykosylierung des naturlichen Gelonins mit Hilfe chemischer Methoden und ¨ ¨ anschließender massenspektrometrischer Analyse, sollte in Kooperation mit Prof. Dr. Niedner-Schatteburg (Physikalische Chemie, Technische Universitat Kaiserslautern) untersucht werden, welche ¨ Aminosaurensequenz im naturlichen Gelonin vorliegt. ¨ ¨ 3.2. Chemische Deglykosylierung mit TFMS Zur Deglykosylierung wurden unter Stickstoffatmosphare lyophilisiertes Gelonin mit 150 µl Triflu¨ ormethansulfonsaure (TFMS) pro mg Protein umgesetzt und bei 0 C fur 2 Stunden inkubiert. Eine ¨ ¨ Inkubation uber 4 h fuhrte dabei zur Zersetzung des Gelonins, was durch niedermolekulare Fragmente ¨ ¨ auf einem SDS-Gel sichtbar wurde (nicht gezeigt). Die Neutralisation der Saure erfolgte mit 60 %iger ¨ Pyridinlosung bei -20 C. Das mit dieser Methode deglykosylierte Gelonin wurde anschließend gegen ¨ Wasser dialysiert. Bei der Neutralisation kam es zur Aggregation der Proteine. Daher konnte das deglykosylierte Gelonin nur mit Hilfe der SDS-PAGE untersucht werden. In Abb. 3.1(a) ist der Erfolg der Deglykosylierung gezeigt. Es war ein deutlicher Massenverlust auf dem SDS-Gel zu erkennen. 30 3. Chemische Deglykosylierung von naturlichem Gelonin ¨ (a) (b) Abb. 3.1.: (a) SDS-PAGE (12 %iges Trenngel) zur Kontrolle der Deglykosylierung von naturlichem Gelonin mit TFMS; Bahn 1: Proteinmarker, Bahn 2: unbehandeltes Gelonin, Bahn ¨ 3: mit TFMS deglykosyliertes Gelonin. (b) Regressionsgerade der Markerproteine zur Bestimmung der Molekularmasse von Gelonin. Aufgetragen wurde die Laufstrecke gegen den Logarithmus des Molekulargewichtes. 3.3. Berechnung des Massenunterschieds Zur Bestimmung der Molekularmasse von Proteinen auf SDS-Gelen, lasst sich die Laufstrecke von ¨ bekannten Proteinen gegen den Logarithmus ihrer Molekularmassen auftragen. Man erhalt eine Eich¨ gerade, die zur Berechnung der Molekularmassen unbekannter Proteine verwendet werden kann. Wurden die Molekularmassen aus dem in Abb. 3.1(a) dargestellten SDS-Gel berechnet, so ergab sich fur naturliches Gelonin eine Molekularmasse von 29,5 kD, wahrend fur mit TFMS umgesetztes ¨ ¨ ¨ ¨ Gelonin eine Molekularmasse von 28,2 kD gefunden wurde. 3.4. Diskussion Im Rahmen dieser Arbeit gelang die chemische Deglykosylierung von naturlichem Gelonin mit Hilfe ¨ von TFMS, sowie die Berechnung eines moglichen Glykosylierungsmusters, welches das Vorliegen ¨ der von Nolan et al. bestimmten Aminosaurensequenz (Nolan et al., 1993) bestatigen wurde. Bei ¨ ¨ ¨ der Umsetzung von naturlichem Gelonin mit TFMS zeigte sich bei einer Inkubationszeit unter vier ¨ Stunden eine diskrete Proteinbande auf einem SDS-Gel. Die Molekularmasse wurde zu 28,2 kDa bestimmt. Nicht umgesetztes Gelonin zeigte eine Molekularmasse von 29,5 kDa. Wurde die Probe langer als vier Stunden mit TFMS inkubiert, so wurden auch niedermolekulare Banden gefunden. Die ¨ 3.4. Diskussion 31 Intensitat dieser Bande nahm dabei proportional mit der Inkubationszeit zu, bis die 28,2 kDa große ¨ Bande nicht mehr zu sehen war. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte davon ausgegangen werden, dass bis zu einer Inkubationszeit von vier Stunden eine Deglykosylierung stattfand, wahrend sich ¨ bei langerer Inkubationszeit das Protein zersetzte. Der aus dem SDS-Gel berechnete Massenverlust ¨ betrug 4,4 %, was dem von Falasca et al. bestimmten Zuckergehalt entsprach (Falasca et al., 1982). ¨ Zuckergehalt und Aminosaurensequenz im naturlichen Gelonin ¨ Die N-Glykosylierung erfolgt bei Proteinen am Asn-Rest des Tripeptides Asn-X-Ser/Thr, wobei X jede Aminosaure, außer Pro und Asp, sein kann (Kornfeld und Kornfeld, 1985). In der Sequenz von ¨ Gelonin wurden zwei mogliche N-Glykosylierungsstellen gefunden, von denen in der Rontgenstruk¨ ¨ tur nur der Asn189-Rest als glykosyliert erschien (Hosur et al., 1995). Die Zuckerzusammensetzung der Glykosylierung wurde von Falasca et al. bestimmt (Falasca et al., 1982). Sie fanden Xylose, Mannose und Glucosamin. Die Anzahl der Zucker wurde von ihnen zu 1,1 Xylose, 1,6 Glucosamin und 6,9 Mannose pro Geloninmolekul bestimmt. Der Gesamtzuckergehalt betrug 4,46 %. ¨ Im ESI-FT Massenspektrum von naturlichem Gelonin wurden 6 Spezies, mit mittleren molekularen ¨ Massen von 29.137,8 bis 29.519,2 Da gefunden (Hossann, 2001). Wurden von diesen Massen die, in dieser Arbeit bestimmten, 4,4 % Zuckergehalt abgezogen, so berechneten sich die mittleren molekularen Massen von unglykosyliertem Gelonin zu 27.855,7 bis 28.221,9 Da. Wurden die berechneten mittleren molekularen Massen aus den Aminosaurensequenz von Nolan et al. bzw. Rosenblum et ¨ al. (Abb. A.1) zugrunde gelegt, schien die von Nolan et al. gefundene Sequenz der des naturlichen ¨ Gelonins zu entsprechen. Dass in der Rontgenstruktur an der Position 239 ein Lys-Rest gefunden ¨ wurde (Hosur et al., 1995), sprach ebenfalls fur das Vorliegen dieser Sequenz. Im Rahmen seiner ¨ Diplomarbeit unterzog Daubenfeld naturliches Gelonin einem tryptischen Verdau und analysierte die ¨ erhaltenen Peptide massenspektrometrisch (Daubenfeld, 2003). Es wurden von ihm keine Peptide gefunden, die auf die von Rosenblum et al. bestimmte Aminosaurensequenz schließen ließen. ¨ Daher wurde vom Vorliegen der von Nolan et al. bestimmten Aminosaurensequenz im naturlichen ¨ ¨ Gelonin ausgegangen. Vorschlag fur das Glykosylierungsmuster von naturlichem Gelonin ¨ ¨ Auf der Grundlage der von Falasca et al. bestimmten Zuckerzusammensetzung wurde ein mogliches ¨ Glykosylierungsmuster fur Gelonin errechnet. Anstatt D-Glucosamin, wurde N-Acetyl-D-Glucosamin ¨ (GlcNAc) bei der Berechnung zu Grunde gelegt, da in Oligosaccharidstrukturen von Glykoproteinen nur diese Form gefunden wird. Falasca et al. bestimmten den Zuckergehalt nach der Methode von Dunstan et al. (Dunstan et al., 1974). Dabei wurde das Glykoprotein einer sauren Hydrolyse in methanolischer HCl-Losung mit anschließender zweistundiger Inkubation bei 90 °C unterzogen. Eine ¨ ¨ Hydrolyse von N-Acetyl-D-Glucosaminen zu D-Glucosamin unter diesen Bedingungen war dabei sehr wahrscheinlich. 32 3. Chemische Deglykosylierung von naturlichem Gelonin ¨ (a) (b) Abb. 3.2.: Mogliche Zuckerzusammensetzung der Spezies 1 und 4 - (a) Glykosylierungsmuster ¨ des paucimannosidischen Typs. (b) Vorgeschlagenes Glykosylierungsmuster der Spezies 1 und 4 von Gelonin. In Ricin D wurde neben der Glykosylierung GlcNAc 2 Man3 Xyl1 Fuc1 zu 8 % auch diese Struktur gefunden (Kimura et al., 1988). Alle N-Glykosylierungen von Pflanzenproteinen haben eine minimale Struktur gemeinsam (Kornfeld und Kornfeld, 1985). Diese besteht aus der Struktur GlcNAc 2 Man3 und wird als Kern-Struktur bezeichnet. Glykoproteine aus Pflanzen werden in vier verschiedene Typen eingeteilt (Lerouge et al., 1998). Es werden mannosereiche, komplexe, hybride und paucimannosidische Typen unterschieden. Der letzte Typ (Abb. 3.2(a)) wurde bisher in einer großen Zahl von Pflanzenproteinen gefunden, darunter auch Ricin D (Kimura et al., 1988). Er ist charakterisiert durch die Zusammensetzung GlcNAc2 Man3 Xyl0,1 Fuc0,1 . Das Vorliegen von Xylose (Xyl) bzw. Fucose (Fuc) ist dabei optional und hat keine Auswirkung auf die Substratspezifitat (Johnson und Chrispeels, 1987; Tezuka et al., ¨ 1992; Zeng et al., 1997). Wurde die Kern-Struktur zu Grunde gelegt, konnte eine mogliche Zuckerzusammensetzung fur vier ¨ ¨ der sechs gemessenen Gelonin-Spezies gefunden werden (Tab. 3.1). Fur diese vier Spezies wurde eine ¨ allgemeine Zuckerzusammensetzung von GlcNAc2 Manx Xyl1 bestimmt. Die Anzahl der MannoseMolekule variierte von 2 bis 5. Die heterogene Besetzung von Glykosylierungsstellen wurde auch fur ¨ ¨ andere Glykoproteine in Pflanzen gefunden (Oxley und Bacic, 1995; Sturm, 1991; Takahashi et al., 1990). Der berechnete Zuckergehalt von 4,6 % fur die Spezies 3 deckte sich sehr gut mit dem aus ¨ dem SDS-Gel der Deglykosylierung und dem von Falasca et al. bestimmten Zuckergehalt von 4,46 % (Falasca et al., 1982). Die Spezies 4, mit einer mittleren molekularen Masse von 29.212,8 Da, konnte durch die Zuck¨ erzusammensetzung GlcNAc2 Man3 Xyl1 charakterisiert werden (Tab. 3.1, Spezies 4). Die verbliebene Massendifferenz von ca. 17 Da ware durch eine Oxidation (+16 Da) eines Methionin-Schwefelatoms ¨ erklarbar, wie es bei der massenspektrometrischen Analyse des tryptischen Verdau von naturlichem ¨ ¨ Gelonin gefunden wurde (Daubenfeld, 2003). Die verbliebene Differenz von 1 Da ware durch eine ¨ Desaminierung eines Asn-Restes zu erklaren. Die Desaminierung findet an Asn- und Gln-Resten ¨ statt. Wird Asn desaminiert, muss in der folgenden Position ein Gly-Rest vorhanden sein. Die NolanSequenz enthalt bei den Aminosauren 211 und 212 eine solche Aminosaureabfolge. Daubenfeld kon¨ ¨ ¨ nte diese Modifizierung ebenfalls massenspektrometrisch nachweisen. 3.4. Diskussion 33 Spezies Protein MAS,ber (Da) MAS,ber -H2 O (Da) Disulfidbrucke Cys44-Cys50 (Da) ¨ Zucker N-GlcNAc Man Xyl MZucker,ber (Da) Modifizierungen Oxidation Desaminierung MMod.,ber (Da) MGelonin,ber (Da) MGelonin,gem (Da) Differenz (Da) Zuckergehalt (%) 1 2 3 4 28.172,2 28.172,2 28.172,2 28.172,2 28.154,2 28.154,2 28.154,2 28.154,2 -2,0 -2,0 -2,0 -2,0 2 3 1 1.043,0 2 4 1 1.205,1 2 5 1 1.367,2 2 3 1 1.043,0 1 1 0 0 0 17,0 29.195,1 29.357,3 29.519,4 29.212,1 29.195,1 29.357,9 29.519,2 29.212,8 0,0 -0,6 0,2 -0,7 3,6 4,1 4,6 3,6 Tab. 3.1.: Vorschlag fur die Zusammensetzung der im Massenspektrum von nat urlichem ¨ ¨ Gelonin gefundenen Massen MGel onin,gem . Der Zuckergehalt berucksichtigt nicht die posttrans¨ lationalen Modifizierungen. (Hossann, 2001). Auch die zwei verbliebenen Spezies bei 29.137,9 und 29.300,0 Da konnten durch das Vorliegen der ¨ Kern-Struktur mit unterschiedlicher Anzahl an Mannose-Molekulen (GlcNAc 2 Man2-3 Xyl1 ) erklart ¨ ¨ werden. Die Differenz zur experimentell bestimmten Masse, lasst sich hier durch eine Phospho¨ rylierung des Proteins (+79,98 Da) und der Anlagerung eines Natrium-Ions (+22,99 Da) aus dem Puffer erklaren. Allerdings fehlte die fur Na-Addukte charakteristische Verteilung von Peaks mit 22¨ ¨ Da-spacing im ESI-FT Massenspektrum (Daubenfeld, 2003). Auch fehlte in der Literatur ein Hinweis auf eine mogliche Phosphorylierung von Gelonin. ¨ Die von Falasca et al. gefundenen Spuren von Fucose (Falasca et al., 1982) konnten durch die Auswertung des Massenspektrums nicht bestatigt werden. Allerdings hangt die Zusammensetzung der Glyko¨ ¨ sylierung von Gelonin von saisonalen Faktoren ab (Trommer und Surolia, personliche Mitteilung). ¨ Vorkommen von Gelonin in der Pflanzenzelle Gelonin findet man in den Samen von Gelonium multiflorum. Fur das hier vorgeschlagene Glyko¨ sylierungsmuster des paucimannosidischen Typs spricht, dass Glykoproteine aus Vakuolen und Pflanzensamen hauptsachlich diesen Typ aufweisen. ¨ 34 3. Chemische Deglykosylierung von naturlichem Gelonin ¨ 35 4. Expression und Isolierung von rekombinantem Gelonin 4.1. Aufgabenstellung Die Isolierung von rekombinantem Gelonin aus E.coli gelangen Li (Li, 2002) und Buttner (Buttner, ¨ ¨ 2002), unter Verwendung von Ionenaustauscherchromatographie, direkt aus dem Zelllysat. Li verwendete in einem ersten Saulenschritt einen starken Kationenaustauscher (SP-Sepharose ff). Sie ¨ eluierte die Proteine durch eine stufenweise Erhohung der NaCl-Konzentration im PBS-Puffer (pH ¨ 6,5). Nach einer Dialyse gegen Tris-Puffer, pH 10,5, wurde die Fraktion, welche das rekombinante Gelonin enthielt, erneut uber SP-Sepharose ff gesault und die Proteine im Gradienten eluiert. Da durch ¨ ¨ den Wechsel des pH-Wertes von 6,5 nach 10,5 der isoelektrische Punkt des rekombinanten Gelonins durchschritten wurde (berechneter Wert: 9,22), kam es bei der Dialyse zu dessen Prazipitation und ¨ somit zu erheblichen Ausbeuteverlusten. Buttner gelang die Optimierung der Aufreinigung durch Verwendung eines einzigen Saulenschrittes ¨ ¨ unter Verwendung von SP-Sepharose ff bei einem pH-Wert von 6,5 und einer Gradientenelution mit steigender NaCl-Konzentration. ¨ Die Uberprufung der DNA-Sequenz des Expressionsvektors fuhrte zu der Entdeckung, dass das ¨ ¨ rekombinante Gelonin uber einen N-terminalen HisTag verfugte. Ein HisTag ist ein Oligopeptid, ¨ ¨ welches mehrere Histidinreste enthalt und in der Lage ist Schwermetallionen zu binden. Dieses ¨ erlaubt eine einfache Aufreinigung eines fusionierten Proteins mit Hilfe von Nickel-Affinitatschro¨ matographie. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das rekombinante Gelonin mit Hilfe der Nickel-Affinitatschromatogra¨ phie isoliert, der HisTag mit Thrombin abgespalten und das Protein erneut duch ELISA und einen Toxizitatstest charakterisiert werden. Dabei sollte der Einfluss des HisTag auf die Toxizitat des Pro¨ ¨ teins untersucht werden. 4.2. Plasmidcharakterisierung Vor der Durchfuhrung der Expression wurde der Expressionsvektor pET-gel uberpruft. Dazu wurde ¨ ¨ ¨ das Plasmid aus vorhandenen Glycerinkulturen isoliert und durch Restriktionsverdau mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen charakterisiert. 36 4. Expression und Isolierung von rekombinantem Gelonin (a) (b) BglII 1 6.089 EcoRI 1 6.089 HindIII 1 6.089 MboII 13 930, 810, 791, 753, 520, 369, 360, 345, 340, 339, 250 , 171, 111 NcoI 2 5.923, 166 PflMI 2 3.984, 2.105 XhoI 1 6.089 (c) Abb. 4.1.: Charakterisierung von pET-gel durch Verdau mit verschiedenen Restriktionsenzymen - (a) Plasmidkarte von pET-gel inkl. der verwendeten Restriktionsenzyme. (b) 0,9 bzw. 2 %iges Agarosegel: Bahn 1: DNA-Marker -DNA HindIII, Bahn 2: HindIII, Bahn 3: PflMI, Bahn 4: XhoI, Bahn 5: NcoI, Bahn 6: EcoRI, Bahn 7: BglII, Bahn 8: DNA-Marker MassRuler DNA Ladder (Low Range), Bahn 9: MboII, Bahn 10: NcoI. (c) Verwendete Restriktionsenzyme mit Anzahl Schnittstellen (kursiv) und erwartete Gr oße der Fragmente; auf dem Agarosegel gefun¨ dene Fragmente sind fett gedruckt. Fragmente die nicht eindeutig identifiziert werden konnten sind unterstrichen dargestellt. sehr schwach auf dem Agarosegel sichtbar. Von einer Glycerinkultur wurde ein Verdunnungsausstrich auf LBK-Agarplatten erstellt und uber ¨ ¨ C inkubiert. Eine Kolonie wurde gepickt und damit 25 ml LBK-FlusNacht im Brutschrank bei 37 ¨ ¨ sigmedium angeimpft. Diese Ubernachtkultur wurde dann bei 37 C und 300 U/min inkubiert. Mit dem Plasmidisolierungskit QIAprep Spin Miniprep Kit (Fa. Qiagen) konnte anschließend aus den ¨ Ubernachtkulturen Plasmid isoliert werden. Zur Charakterisierung wurden die Restriktionsendonukleasen BglII, EcoRI, HindIII, MboII, NcoI, PflMI und XhoI verwendet. Das Ergebnis des Verdaus ist in Abb. 4.1 dargestellt. Bei den Enzymen mit einer Schnittstelle (BglII, EcoRI, HindIII und XhoI) war wie erwartet nur eine Bande bei 6.089 bp zu sehen. Der Verdau mit NcoI zeigte eine Bande bei 5.923 bp (Bahn 5). Die zweite Bande bei 166 bp war nur auf dem 2,5 %igem Agarosegel sichtbar (Bahn 10). Bei PflMI waren deutlich die beiden Banden bei 3.984 und 2.105 bp zu sehen. Die Bande bei ca. 6.000 bp entstand durch unvollstandigen ¨ 4.3. Expression 37 Verdau und reprasentierte das einfach geschnittene Plasmid mit 6.089 bp. MboII schnitt den Vektor ¨ 13 mal und erzeugte Fragmente unter 1.000 bp (Bahn 9). Bis auf das Fragment bei 250 bp, das nur sehr schwach auf dem Agarosegel detektierbar war, konnten alle Fragmente nachgewiesen werden. Moglicherweise wurde das Plasmid nur unvollstandig verdaut, was durch die Instabilitat des Enzyms ¨ ¨ ¨ erklart werden konnte. MboII ist laut Herstellerangabe nur ca. 15 Minuten bei einer Inkubation unter ¨ ¨ Standardbedingungen stabil. Aufgrund dieser Ergebnisse war der Vektor pET-gel ausreichend charakterisiert und konnte fur die ¨ Expression von Gelonin eingesetzt werden. 4.3. Expression Der Vektor pET-gel kodierte fur rekombinantes Gelonin mit N-terminalem 6 fach HisTag und ein¨ er Schnittstelle fur die Endoprotease Thrombin (His T -Gelonin1-251 , Abb. 4.2). Das Protein enthielt ¨ 6 alle 251 Aminosauren des naturlichen Gelonins (Swissprot: P33186, Nolan et al., 1993). Die En¨ ¨ doprotease Thrombin erkennt die Aminosauresequenz LysValProArgGlySer und spaltet die Peptid¨ bindung C-terminal des Gly-Restes. Durch die Inkubation von His T -Gelonin1-251 mit Thrombin 6 sollte Gelonin1-251 erhalten werden. Zur Expression wurden von einer Glycerinkultur BL21(DE3) pET-gel Verdunnungsaustriche auf ¨ LBK-Agarplatten angelegt und bei 37 C im Brutschrank inkubiert. Mit je einer einzelnen Kolonie ¨ wurden Ubernachtkulturen angeimpft und bei 37 C und 300 U/min inkubiert. Mit 5 - 10 ml dieser ¨ Ubernachtkulturen wurden jeweils 500 ml LBK-Flussigmedium angeimpft und bei 37 C im Wasser¨ badschuttler bei 220 U/min inkubiert. Das Bakterienwachstum wurde durch Messung der optischen ¨ Dichte bei 600 nm (OD600nm ) verfolgt. Bei einer OD600nm zwischen 0,5 und 1,0 wurde die Expression mit IPTG induziert. Beim Erreichen der stationaren Wachstumsphase wurden die Zellen durch Inku¨ bation in einem Eiswasser-Bad geerntet und bei 6.400 xg abzentrifugiert. In allen Versuchen erzielten die Zellen beim Erreichen der stationaren Phase nur eine OD600nm von bis zu 2. ¨ 4.4. Lyse der Zellen Die Zellpellets wurden nach zweimaligem Waschen mit Pellet-Waschpuffer (20 mM Tris, pH 7,6) in Resuspendierungspuffer (50 mM Natriumdihydrogenphosphat, 0,5 M Natriumchlorid, 20 mM Imidazol, 1,5 mM PMSF, pH 7,2) aufgenommen und durch die Zugabe von Lysozym und mittels Ultraschall ¨ lysiert. Durch die Zentrifugation bei 30.000 xg erhielt man die loslichen Zellproteine im Uberstand, ¨ wahrend die unloslichen Zelltrummer und inclusion bodies im Pellet verblieben. Das Auftragen des ¨ ¨ ¨ Zelllysats auf ein SDS-Gel, und die Untersuchung der entsprechenden Bande mit einem Densitometer 38 4. Expression und Isolierung von rekombinantem Gelonin (a) HisT -Gelonin1-251 6 (b) Gelonin 1-251 Abb. 4.2.: Primarstruktur des rekombinanten Gelonins (schematisch), kodiert im Vektor pET¨ T -Gelonin gel - (a) His6 ¨ 1-251 : Das exprimierte Protein enthielt alle 251 Aminos auren von naturlichem Gelonin (schwarz). Zusatzlich besitzt es einen N-terminalen 6xHisTag (schraffiert) ¨ ¨ und eine Schnittstelle fur Thrombin (Pfeil). (b) Gelonin1-251: Rekombinantes Gelonin nach der ¨ Abspaltung des HisTag. N-terminal verblieben die Aminos auren GSHM des Vektors fusioniert. ¨ (Abb. 4.3(a)) zeigte einen Gehalt von 17 % von Proteinen der gesuchten Molekularmasse (ca. 31 kDa) ¨ im Uberstand der Zelllyse. ¨ 4.5. Isolierung mit Hilfe von Nickel-Ionen-Affinitatschromatographie Bei den Isolierungen von Li und Buttner lag His T -Gelonin1-251 nativ im Zelllysat vor (Li, 2002; ¨ 6 Buttner, 2002). Aufgrund des HisTag war eine Isolierung mit Hilfe von an HiTrap Chelating immo¨ bilisierten Nickel-Ionen direkt aus dem Zelllysat moglich. Um optimale Trenneigenschaften auf der ¨ Saule zu erhalten, wurden 0,5 M NaCl in den Puffer gegeben, um die Ionenaustauschereigenschaften ¨ des Saulenmaterials zu unterdrucken. Die Zugabe von 20 mM Imidazol zum Puffer verringerte die ¨ ¨ unspezifische Bindung von unerwunschten Proteinen an die immobilisierten Nickel-Ionen. ¨ 4.5.1. Elution mit unterschiedlichen Imidazolkonzentrationen Um Schwebstoffe und andere großere Aggregate abzutrennen, welche die HiTrap Chelating Affini¨ tatssaule verstopfen konnten, wurde das Zelllysat 60 Minuten in der Ultrazentrifuge (400.000 xg, ¨¨ ¨ C) zentrifugiert. Wurde die Proteinlosung nach der Zentrifugation bei -20 C eingefroren, so bil¨ 4 deten sich nach Lagerung erneut großere Aggregate, moglicherweise von verbliebenen Zelltrummern, ¨ ¨ ¨ die vor dem Auftragen auf die Saule erneut abzentrifugiert werden mussten. ¨ 4.5. Isolierung mit Hilfe von Nickel-Ionen-Affinitatschromatographie ¨ 39 (a) (b) Abb. 4.3.: SDS-PAGE - Isolierung von HisT -Gelonin1-251 (Elution mit Imidazol) - (a) SDS6 PAGE (12 %iges Trenngel) der Saulenfraktionen, Bahn 1: Proteinmarker, Bahn 2: Zelllysat ¨ (30 µg), Bahn 3: Durchlauf (30 µg), Bahn 4: Waschfraktion (10 µg), Bahn 5: His T -Gelonin1-251 6 (10 µg). (b) SDS-PAGE (12 %iges Trenngel) der Isolierung nach B uttner (Buttner, 2002). Bahn ¨ ¨ 1: Proteinmarker, Bahn 2: HisT -Gelonin1-251 (10 µg). 6 ¨ Zur Isolierung von HisT -Gelonin1-251 wurde der Uberstand der Zelllyse nach der Ultrazentrifugation 6 direkt auf die Saule aufgetragen und solange mit Bindungspuffer gewaschen, bis keine Absorption ¨ bei 280 nm mehr detektiert werden konnte. Die Saule wurde mit Waschpuffer (50 mM Natriumdi¨ hydrogenphosphat, 0,5 M Natriumchlorid, 100 mM Imidazol, pH 7,2) gewaschen, um unspezifisch gebundene Proteine von der Saule zu entfernen. Reines HisT -Gelonin1-251 konnte mit Elutions¨ 6 puffer (50 mM Natriumdihydrogenphosphat, 0,5 M Natriumchlorid, 500 mM Imidazol, pH 7,2) von der Saule eluiert werden. Man erhielt aus 1 l Schuttelkultur ca. 2,4 mg rekombinantes Gelonin. Die ¨ ¨ Konzentration betrug ca. 0,5 mg/ml. Eine Aufkonzentration bis zu 1,5 mg/ml war moglich. ¨ Der Verlauf der Aufreinigung ließ sich anhand der auf ein SDS-Gel aufgetragenen Saulenfraktionen ¨ ¨ verfolgen (Abb. 4.3(a)). Im Uberstand der Zelllyse (Bahn 2) war deutlich bei ca. 31 kD die Bande von HisT -Gelonin1-251 zu sehen, welches komplett an die Saule gebunden hatte und im Durchlauf ¨ 6 nicht mehr detektierbar war (Bahn 3). In Abb. 4.3(b) ist in Bahn 2 His T -Gelonin1-251 zu sehen, das 6 nach der Methode von Buttner isoliert wurde. Deutlich sind Verunreinigungen zu sehen, die bei der ¨ Isolierung mit Hilfe der Nickel-Affinitatschromatographie nicht auftraten. ¨ Verglich man beide Isolationsmethoden mit Hilfe einer densitometrischen Analyse der Banden auf den SDS-Gelen, so konnte bei der Isolierung mit Hilfe der Nickel-Affinitatschromatographie ein ¨ Reinheitsgrad von 95 % erzielt werden, wahrend die Methode nach Buttner nur ein Reinheitsgrad von ¨ ¨ 40 4. Expression und Isolierung von rekombinantem Gelonin (a) (b) Abb. 4.4.: Isolationskontrolle und Charakterisierung von His T -Gelonin1-251 mit ELISA - (a) 6 ELISA mit polyklonalen Anti-Gelonin Antik orpern (1:1000), Vergleich von HisT -Gelonin1-251 ¨ 6 isoliert nach der Methode von Buttner (B, 5 µg) bzw. mit Nickel-Affinitatschromatographie (N, ¨ ¨ 5 µg), Negativkontrolle: Glucose-Dehydrogenase (10 µg), Positivkontrolle: Gelonin aus Gelonium multiflorum (5 µg). (b) ELISA mit polyklonalen Anti-Gelonin Antik orpern (1:1000), Unter¨ suchung der aufgefangenen Saulenfraktionen, Zelllysat (44 µg), Durchlauf (5 µg), alle anderen ¨ Fraktionen 4 µg. Negativkontrolle: Rinderserumalbumin (4 µg), Positivkontrolle: Gelonin aus Gelonium multiflorum (Gelonin (S), 8 µg). . 92 % erbrachte. Dieses Ergebnis zeigte sich auch im ELISA (Abb. 4.4). Wurde His T -Gelonin1-251 6 aus beiden Isolierungen mit polyklonalen Anti-Gelonin Antikorpern getestet, so zeigte das mit Hil¨ fe der Affinitatschromatographie aufgereinigte Gelonin eine deutlich positivere Reaktion. Der Erfolg ¨ der Aufreinigung ließ sich auch durch die Kontrolle der Fraktionen mit Hilfe eines ELISA bestimmen (Abb. 4.4(b)). Dazu wurden alle Fraktionen mit polyklonalen Anti-Gelonin Antikorpern getestet. Es ¨ war deutlich die vollstandige Bindung von His T -Gelonin1-251 an die Nickel-Affinitatssaule erkennbar. ¨ ¨¨ 6 Im Durchlauf durch die Saule ließ sich sowohl mittels SDS-PAGE, als auch durch ELISA kein His T ¨ 6 Gelonin1-251 detektieren. Allerdings zeigte sich, dass ein Teil des gewunschten Proteins bereits beim ¨ Waschschritt von der Saule eluiert wurde. Dies ließ sich aufgrund der geringen Menge vernachlassig¨ ¨ en. In der Waschfraktion befanden sich ca. 400 µg Gesamtprotein, von denen His T -Gelonin1-251 nur 6 ein geringer Prozentsatz darstellte. Nach der Dialyse gegen 3 mal 5 l Dialysepuffer (20 mM Natriumhydrogenphosphat, pH 7,2) konnte das Protein weitergehend charakterisiert werden. 4.5.2. Abspaltung des HisTag ¨ ¨ In einem in vitro Translationstest zeigte His T -Gelonin1-251 eine Toxizitat von 3,0 ng/ml (Buttner, 6 2002). Um den Einfluss des HisTag auf die Toxizitat zu beurteilen, sollte dieser mit Thrombin abge¨ spalten und die Toxizitat von Gelonin 1-251 bestimmt werden. Thrombin erkennt die Aminosaurese¨ ¨ 4.5. Isolierung mit Hilfe von Nickel-Ionen-Affinitatschromatographie ¨ 41 quenz LeuValProArgGlySer und spaltet die Polypeptidkette N-terminal des Glycin. Dabei kommt es zu einem Massenverlust von ca. 2 kDa, der auf einem SDS-Gel beobachtet werden kann. Zur Optimierung der Bedingungen wurden zeit- und dosisabhangige Versuche durchgefuhrt. ¨ ¨ In einem ersten Versuch, zur Bestimmung der benotig¨ ten Thrombinmenge, wurden 30 µg His T -Gelonin1-251 6 mit 5, 10, 20 und 40 mU Thrombin umgesetzt und 16 h bei Raumtemperatur inkubiert. Bei allen Proben wurde der HisTag vollstandig abgespalten und Gelonin 1-251 ¨ erhalten (Abb. 4.5, oben). In einem weiteren Versuch wurden 40 µg HisT -Gelonin1-251 mit 5 mU Thrombin 6 bei Raumtemperatur inkubiert und in bestimmten Zeitintervallen Proben mit je 5 µg Protein entnommen. Das Ergebnis der zeitabhangigen Thrombinspaltung ist in Abb. ¨ 4.5 dargestellt. Nach 7 Stunden war immer noch eine Abb. 4.5.: Abspaltung des HisTag. Verwendung verschiedener Thrombinkonzentrationen (oben) bzw. unterschiedlicher Inkubationszeiten (unten). ¨ schwache Bande des ungeschnittenen HisT -Gelonin1-251 zu erkennen. Wahrend nach 10 Stunden 6 diese Bande nicht mehr auf dem SDS-Gel zu erkennen war, erkannte man deutlich die schwachere ¨ ¨ Bande von geschnittenem HisT -Gelonin1-251 , im Vergleich mit der Bande bei der 20 stundigen Inku6 bation. Daher konnte von einer unvollstandigen Spaltung zu diesem Zeitpunkt ausgegangen werden. ¨ Die optimalen Bedingungen fur die Entfernung des HisTag wurden bei diesen Versuchen zu 1 mU ¨ Thrombin pro µg Protein, bei einer Proteinkonzentration von 0,2 mg/ml und einer Inkubationszeit von 16 Stunden bei Raumtemperatur festgelegt. 4.5.3. Elution mit Thrombin Wurde HisT -Gelonin1-251 , welches durch die in Kap. 4.5.1 beschriebene Methode isoliert wurde, in 6 großen Mengen (> 30 µg) auf ein SDS-Gel aufgetragen, so fand man eine hohermolekulare Verun¨ reinigung (Abb. 4.6, Bahn 7). Durch Variation der Methode sollte untersucht werden, ob His T -Ge6 ¨ lonin1-251 durch Thrombin von der Saule eluiert werden konnte. Durch die Inkubation des immobilisierten HisT -Gelonin1-251 mit Thrombin sollte der HisTag abgespalten und Gelonin 1-251 von der 6 Saule eluiert werden. ¨ Hierzu wurde das Zelllysat der Expression von BL21(DE3) pET-gel, wie oben beschrieben, auf die Nickel-Affinitatssaule aufgetragen und unspezifisch gebundene Proteine mit Waschpuffer entfernt. ¨¨ ¨ Die Elution von Gelonin 1-251 erfolgte durch eine 16 stundige Inkubation mit 2,2 U Thrombin bei Raumtemperatur. Dazu wurde Bindungspuffer mit Thrombin versetzt und mit einer 1 ml Spritze auf die Saule aufgetragen. Um die Hemmwirkung des im Puffer vorhandenen 500 mM NaCl auf Throm¨ bin auszugleichen, wurde die doppelte Menge der Endoprotease eingesetzt. Durch den Pufferwechsel wurde kein Protein eluiert. Nach Abschluss der Inkubation konnte das Protein mit Bindungspuffer 42 4. Expression und Isolierung von rekombinantem Gelonin (a) (b) Abb. 4.6.: SDS-PAGE und ELISA der Isolierung von Gelonin 1-251 (Elution mit Thrombin) - (a) SDS-PAGE der Saulenfraktionen von der Nickel-Saule (12 %iges Trenngel), Bahn 1: Protein¨ ¨ standard, Bahn 2: Zelllysat (40 µg), Bahn 3: Durchlauf (40 µg), Bahn 4: Waschfraktion (30 µg), Bahn 5 und 6: Gelonin1-251 (15 bzw. 5 µg), Bahn 7: HisT -Gelonin1-251 eluiert mit 500 mM 6 Imidazol (30 µg). (b) ELISA mit polyklonalen Anti-Gelonin-Antik orpern (1:4.000), HisT -Ge¨ 6 lonin1-251 und Gelonin1-251 (8 µg), Positivkontrolle: nat urliches Gelonin (8 µg), Negativkon¨ trolle: Rinderserumalbumin (20 µg). eluiert werden. Der Erfolg der Isolierung wurde durch das in Abb. 4.6 gezeigte SDS-Gel deutlich. HisT -Gelonin1-251 band vollstandig an die Nickel-Affinitatssaule. Wahrend im Zelllysat die ¨ ¨¨ ¨ 6 Bande bei ca. 31 kD sichtbar war (Bahn 2), fehlte sie im Durchlauf vollig (Bahn 3). In Bahn 5 ist ¨ ¨ Gelonin1-251 in großer Reinheit zu sehen. Die Ausbeute betrug 2,6 mg pro 1 l Schuttelkultur, mit einer Konzentration von 1 mg/ml. Eine densitometrische Analyse ergab eine Reinheit von 99 %. Allerdings konnte nicht das gesamte Gelonin mit dieser Methode eluiert werden. Durch anschließende Elution mit Elutionspuffer wurden weitere 0,2 mg His T -Gelonin1-251 erhalten. Moglicherweise reichte ¨ 6 ¨ ¨ die Thrombinmenge nicht aus, um Gelonin 1-251 vollstandig von der Saule zu entfernen. Laut Herstellerangabe ist zur Spaltung von immobilisierten HisTag-Proteinen eine hohere Thrombinmenge ¨ notwendig, als bei der Spaltung der gleichen Proteinmenge in Losung. Auch eine Deaktivierung von ¨ Thrombin aufgrund der langen Inkubationszeit bei Raumtemperatur konnte nicht ausgeschlossen werden. Im ELISA mit polyklonalen Anti-Gelonin Antikorpern zeigte sich eine starkere Reaktion bei His T ¨ ¨ 6 ¨ Gelonin1-251 als mit Gelonin1-251 (Abb. 4.6(b)). Moglicherweise erkannten die verwendeten polyklonalen Antikorper den stark polaren, immunogenen HisTag und fuhrten so zu einer starkeren Reak¨ ¨ ¨ tion. Nach der Abspaltung des HisTag zeigte Gelonin 1-251 eine mit aus Gelonium multiflorum isoliertem Gelonin vergleichbare Aktivitat. ¨ 4.5. Isolierung mit Hilfe von Nickel-Ionen-Affinitatschromatographie ¨ 43 Abb. 4.7.: ESI-FT Massenspektrum von rekombinantem Gelonin: das gemessene Spektrum zeigt die mehrfach positiv geladenen Analytmolek ule. ¨ Abb. 4.8.: ESI-FT Massenspektrum (mass-deconvoluted) von His T -Gelonin1-251. 6 44 4. Expression und Isolierung von rekombinantem Gelonin 4.6. Charakterisierung 4.6.1. ESI-FT Massenspektrometrie Zur Kontrolle der Aminosauresequenz des exprimierten His T -Gelonin1-251 wurde ein Massenspek¨ 6 trum mit einem Elektrospray-Ionisations-Fouriertransformations-Massenspektrometer (ESI-FT-MS) bei der Fa. Bruker Daltonik in Bremen aufgenommen. Die Probe wurde vor der Messung entsalzt, da anorganische Salze und Detergentien einen negativen Einfluss auf die Ionisierungseffizienz in der ESI-Quelle besitzen. Puffersalze kon¨ nen die Analytmolekule wahrend der Verdampfung des Lo¨ ¨ ¨ sungsmittels in der ESI-Quelle durch Auskristallisation einschließen bzw. den Prozess der Ionenbildung behindern. Experimentell werden Puffersalzkonzentrationen von 0,1 bis 1 mM toleriert (Kay und Mallet, 1993; Lehmann, 1996). Zur Entsalzung wurden 5 ml einer 0,11 mg/ml Losung von ¨ T -Gelonin His6 1-251 viermal gegen 5 l bidestilliertes Wasser dialysiert und danach mit YM10-Centricon-Konzentratoren bis zu einer Konzentration von 0,65 mg/ml aufkonzentriert. Die Ausbeute an salzfreiem HisT -Gelonin1-251 betrug 64 %. 6 Neben drei anderen Peaks, wurde im mass deconvoluted Spektrum ein Peak mit einer mittleren molekularen Masse von 30.512 Da gefunden. Wurde die Aminosauresequenz im Vek¨ tor zu Grunde gelegt und die Formylierung der Startaminosaure Methionin durch die E.coli berucksichtigt, dann berech¨ ¨ nete sich eine mittlere molekulare Masse von 30.496 Da. Die mittlere molekulare Masse der anderen gefundenen Peaks betrug 9.225 Da, 9.535 Da und 30.334 Da. Eine quantitative Aussage uber die Menge der Verunreinigungen im Vergleich mit ¨ T -Gelonin His6 1-251 ließ sich allerdings mit dieser Methode nicht treffen. Abb. 4.9.: ESI-MS Massenspektrum von HisT -Gelo6 nin1-251 (mass-deconvoluted). Der Peak reprasentiert eine ¨ Spezies mit einer mittleren molekularen 30.512 Da. Masse von 4.6.2. Western Blot In einem Western Blot mit polyklonalen Anti-Gelonin bzw. Anti-HisTag Antikorpern konnte die ¨ T -Gelonin bei ca. 31 kD im SDS-PAGE auftretende Bande als His6 1-251 identifiziert werden (Abb. 4.6. Charakterisierung 45 (a) (b) Abb. 4.10.: Immunologische Charakterisierung von His T -Gelonin1-251 mit Hilfe von Western 6 Blot; SDS-PAGE (Bahn 1 und 2) und Western Blot (Bahn 3 und 4) - (a) polyklonale AntiGelonin-Antikorper (1:1000), Bahn 1 und 3: Proteinstandard, Bahn 2 und 4: His T -Gelonin1-251 ¨ 6 (10 µg). (b) Anti-Tetra-His-Antikorper (1:500), Bahn 1 und 3: Zelllysat (60 µg), Bahn 2 und 4: ¨ HisT -Gelonin1-251 (10 µg). 6 4.10(a)). Zusatzlich zum aufgereinigten Protein wurde im Western Blot mit den monoklonalen Anti¨ HisTag Antikorpern auch die nicht aufgereinigten Proteine nach der Lyse der Zellen aufgetragen ¨ (Abb. 4.10(b), Bahn 1 und 3). Die Antikorper reagierten nur mit His T -Gelonin1-251 und konnten ¨ 6 so im ELISA als Isolationskontrolle von in E.coli exprimierten Proteinen mit 6xHisTag verwendet werden. ¨ 4.6.3. Toxizitatstest Mit Hilfe eines Kaninchen-Retikulozyten-Lysat ließ sich die Toxizitat von Gelonin 1-251 in einem zell¨ freien System bestimmen. Das Lysat enthielt alle zellularen Komponenten, die zur Proteinbiosynthese ¨ notwendig sind, wie t RNA, Ribosomen, Aminosauren, Initiations-, Elongations- und Terminations¨ faktoren. Als Energielieferant diente ein System aus Creatinphosphat und Creatinkinase. Die Messung beruhte auf der Synthese eines Testproteins (Globin) an den Ribosomen des Lysats, wobei die radioaktive Aminosaure 14 C-Valin eingebaut wurde. Nach dem Abstoppen der Translation ¨ durch Inkubation in kaltem Wasser, wurden die Proteine durch Trichloressigsaure gefallt. Die ausge¨ ¨ fallenen Proteine wurden uber Whatman GF/C filtriert und nicht eingebautes radioaktives Valin abge¨ trennt. Durch die Bestimmung der Radioaktivitat des Filterpapiers mit einem -Szintillationszahler ¨ ¨ konnte die Menge an gebildetem Protein bestimmt werden. RIP hemmen eukaryontische Ribosomen und somit die Biosynthese des Testproteins im Lysat. Es findet sich daher weniger Radioaktivitat ¨ 46 4. Expression und Isolierung von rekombinantem Gelonin Abb. 4.11.: In vitro Translationstest von Gelonin 1-251 im Vergleich mit naturlichem, aus Gelo¨ nium multiflorum isoliertem Gelonin. Als Negativkontrolle diente Rinderserumalbumin. (IC100 = 1.981 cpm, IC50 = 991 cpm). auf dem Filterpapier. Die Toxizitat wurde durch das Messen von Proteinproben unterschiedlicher ¨ Konzentration bestimmt. Es wurden Proteinproben von toxischen bis zu untoxischen Konzentrationen vermessen. Die Auswertung der entstandenen Messkurven erfolgte wie beschrieben: Untoxische Proteine wie Rinderserumalbumin hemmten die Translation nicht, daher fand man im Idealfall eine Gerade. Diese beschrieb den sog. IC 100-Wert (IC, engl. incorporation concentration). Die Toxizitat ¨ eines Proteins ließ sich aus dem Schnittpunkt der Kurve fur das Protein mit der Geraden des IC 50¨ Wertes berechnen. Zur Bestimmung der Toxizitat von Gelonin 1-251 wurde der HisTag von HisT -Gelonin1-251 mit Throm¨ 6 bin entfernt und die Losung sofort in einer Verdunnungsreihe in die zu messenden Konzentrationen ¨ ¨ verdunnt. Es wurde eine Verdunnungsreihe mit 6 Konzentrationen von 1· 10 -7,5 bis 1· 10-12,5 mol/l ¨ ¨ angesetzt. Als Kontrolle fand naturliches Gelonin Verwendung, das aus Gelonium multiflorum isoliert ¨ und auf die gleiche Weise verdunnt wurde. Als Negativkontrolle diente Rinderserumalbumin, wobei ¨ eine Umsetzung mit Thrombin unter den gleichen Bedingungen wie fur Gelonin 1-251 erfolgte. Ziel ¨ war es, einen moglichen Einfluss von Thrombin auf den Toxizitatstest zu untersuchen. Man fand fur ¨ ¨ ¨ ¨ ¨ ¨ ¨ Gelonin1-251 eine Toxizitat von 2,4 ng/ml, wahrend fur naturliches Gelonin als Positivkontrolle eine Toxizitat von 4,6 ng/ml gemessen wurde. Thrombin besaß keinen Einfluss auf den Toxizitatstest, wie ¨ ¨ mit den konstanten Messwerten fur Rinderserumalbumin gezeigt werden konnte (Abb. 4.11). ¨ 4.7. Diskussion 47 4.7. Diskussion Isolierung Im Rahmen dieser Arbeit wurde der N-terminale HisTag von His T -Gelonin1-251 zur Isolierung be6 nutzt. Ein N-terminaler HisTag ist ein Oligopeptid, der mehrere (in diesem Fall 6), Histidin-Reste enthalt und die Bindung an, am Saulenmaterial immobilisierte, Schwermetallionen ermoglicht. Zur ¨ ¨ ¨ Abtrennung von Membrantrummern und Schwebstoffen, die nicht durch eine Zentrifugation bei ¨ 30.000 xg abgetrennt werden konnten, wurde das Zelllysat in einer Ultrazentrifuge bei 400.000 xg zentrifugiert. Das Zentrifugat wurde anschließend direkt auf die Nickel-Affinitatssaule aufgetragen ¨¨ und die gebundenen Proteine schrittweise durch Puffer mit ansteigender Imidazolkonzentration eluiert. Imidazol besitzt eine hohere Bindungsaffinitat an die immobilisierten Nickel-Ionen und ist so in ¨ ¨ der Lage die gebundene Proteine zu verdrangen. Der Waschschritt mit 100 mM Imidazol war aus¨ reichend, um nahezu alle unspezifisch gebundenen Proteine von der Saule zu waschen. Nur ein ca. ¨ 77 kD schweres Protein blieb bei der Elution mit 500 mM Imidazol auf der Saule (Abb. 4.6, Bahn ¨ 7), war allerdings aufgrund der im Densitometer bestimmten Menge (5 %) zu vernachlassigen. Die ¨ Ausbeute und Reinheit lag deutlich uber den Isolierungen von Li und Buttner (Tab. 9.1). Ursache ¨ ¨ war die Verwendung einer spezifischen Chromatographiemethode. Nur Proteine mit hoher Affinitat ¨ an Schwermetallionen banden an die Nickel-Affinitatssaule. Unspezifisch gebundene Proteine kon¨¨ nten mit Puffern geringerer Imidazolkonzentrationen eluiert werden, wahrend Proteine mit einem N¨ terminalen HisTag erst von Puffern mit hoher Imidazolkonzentration eluiert wurden. Durch Verwendung der Nickel-Affinitatschromatographie konnte der Zeitaufwand fur die Isolierung von 5 Tagen ¨ ¨ (Li, 2002) auf 3 Tage reduziert werden. Der HisTag konnte durch Verwendung von Thrombin abgespalten werden. Die Endoprotease Thrombin erkennt spezifisch die Aminosauresequenz LeuValProArgGlySer und spaltet die Peptidbindung ¨ N-terminal des Glycin-Restes. Diese Eigenschaft wurde ebenfalls dazu verwendet, Gelonin 1-251 spezifisch von der Affinitatssaule zu eluieren. Dazu wurde das Zelllysat auf die mit Nickel-Ionen be¨¨ ladene HiTrap-Chelating Affinitatssaule aufgetragen, ungebundene Proteine mit Bindungspuffer, un¨¨ spezifisch gebundene Proteine mit Waschpuffer eluiert und danach die Saule mit Thrombin-haltigem ¨ T -Gelonin ¨ Elutionspuffer uber Nacht inkubiert. Der HisTag von His 6 ¨ 1-251 wurde direkt auf der Saule gespalten und Gelonin1-251 in hoher Ausbeute, Konzentration und Reinheit eluiert, da das ca. 77 kDa schwere Protein nicht eluierte. Die Elution mit Thrombin besaß gegenuber der herkommlichen Elu¨ ¨ tion mit Imidazol den Vorteil, dass ein zusatzlicher Dialyseschritt, zum Entfernen des Imidazols und ¨ des HisTag-Oligopeptides aus dem Puffer, entfallen konnte. Weiterhin erhielt man Gelonin 1-251 in hoher Konzentration (bis 1,5 mg/ml), was eine Aufkonzentration nach der Isolierung uberflussig machte. ¨ ¨ Aufkonzentrationsschritte sind immer mit einem Verlust an Protein verbunden, die Vermeidung dieses Schrittes war ein weiterer Vorteil der Elution mit Thrombin. Der Waschschritt mit 100 mM Imidazol¨ haltigem Waschpuffer war notwendig, um eine mogliche unspezifische Spaltung von an die Saule ¨ 48 4. Expression und Isolierung von rekombinantem Gelonin gebundenen Proteinen, durch vorzeitiges Entfernen dieser Proteine, zu vermeiden. Eine Datenbankanalyse nach E.coli-Proteinen mit einer Thrombin-Schnittstelle blieb erfolglos. Die Expression in E.coli und Isolierung eines rekombinanten Gelonins wurde zuerst von Nolan et al. beschrieben (Nolan et al., 1993). Sie beschrieben die Klonierung eines Fusionsproteins mit N-terminaler leader-Sequenz, welche die Sekretion des exprimierten Proteins durch die Zytoplasmamembran ermoglichte. Das exprimierte Protein zeigte eine mit naturlichem Gelonin vergleichbare ¨ ¨ Aktivitat (Tab. 4.1), wobei der Einfluss der leader-Sequenz auf die Toxizitat nicht bestimmt wurde. ¨ ¨ ESI-FT Massenspektrum Vor der Messung im Massenspektrometer musste His T -Gelonin1-251 gegen bidestilliertes Wasser 6 dialysiert werden. Anschließend konnte das Protein bis zu einer Konzentration von 0,65 mg/ml aufkonzentriert werden, wobei keine Aggregation des Proteins festgestellt wurde. Der bei der Dialyse und Aufkonzentration aufgetretene Proteinverlust von 36 % lag dabei im ublichen Rahmen. His T ¨ 6 ¨ ¨ Gelonin1-251 erwies sich als sehr stabil in wassriger, salzfreier Losung. Im ESI-FT Massenspektrum von HisT -Gelonin1-251 wurden zwei Massen gefunden, die rekombinan6 tem Gelonin zugeordnet werden konnten. Die Spezies bei 30.512 Da entsprach His T -Gelonin1-251 mit 6 formyliertem Methionin (30.496 Da). Die Differenz von 16 Da zur berechneten Masse ließ sich durch ein oxidiertes Schwefelatom an einem Methionin erklaren, wie es auch bei naturlichen Gelonin gefun¨ ¨ den wurde (Daubenfeld, 2003). Das Signal bei 30.334 Da konnte His T -Gelonin1-251 entsprechen, bei ¨ 6 dem das formylierte Methionin posttranslational abgespalten wurde. Neben den Signalen fur His T ¨ 6 Gelonin1-251 , wurden zwei weitere Signale mit einer mittleren molekularen Masse von 9.225 Da und 9.535 Da detektiert. Eine Detektion dieser niedermolekularen Proteinen im SDS-PAGE gelang nicht. Moglicherweise handelte es sich bei ihnen um Fragmente des rekombinanten Gelonins, die beim Ion¨ isierungsprozess gebildet wurden. Eine Aussage uber die Menge der moglichen Verunreinigungen in ¨ ¨ der Isolierung ließ sich allerdings mit Hilfe des ESI-FT Massenspektrums nicht treffen. Zwar ist die quantitative Analyse eine der zentralen Anwendungsgebiete der Massenspektrometrie (Lehmann und Schulten, 1978; Haskins, 1982; Lehmann, 1996), allerdings erfolgen quantitative Messungen immer durch die Einbeziehung eines internen Standards. Die absolute Signalhohe wird durch eine große ¨ Anzahl von instrumentellen Parametern, wie z.B. der Ionisierungsausbeute, beeinflusst. Verwendung finden daher isotopenmarkierte Analoga der Analyt-Molekule. ¨ Faltung Aufgrund der Ergebnisse des ELISA und des in vitro Translationstests konnte von einer nativen Faltung des rekombinanten Gelonins ausgegangen werden. Im ELISA wurde bei der Verwendung von polyklonalen Anti-Gelonin Antikorpern bei abgespaltenem HisTag eine mit naturlichem Gelonin ver¨ ¨ gleichbare Aktivitat gezeigt. Die verwendeten polyklonalen Antikorper waren allerdings nicht auf ihre ¨ ¨ Spezifitat bezuglich nativem oder denaturiertem Gelonin getestet, daher konnte der ELISA nicht als ¨ ¨ 4.7. Diskussion 49 Protein Gelonin1-251 HisT -Gelonin1-251 6 rek. Gelonin nat. Gelonin 251 AS 251 AS 251 AS, inkl. leader-Sequenz 258 AS IC50 (pM) 80 100 26 7 426 25 18 14 Literatur Kap. 4.6.3 (Buttner, 2002) ¨ (Nolan et al., 1993) (Rosenblum et al., 1995) (Stirpe et al., 1980) (Hofmann, 1988) (Nolan et al., 1993) (Rosenblum et al., 1995) Tab. 4.1.: Vergleich der Toxizitaten von rekombinantem und nat urlichem Gelonin. zur Berech¨ ¨ nung wurde eine mittlere Molekularmasse von 29.329 Da angenommen (Hossann, 2001). ausreichendes Mittel zur Bestimmung der nativen Faltung herangezogen werden. Die native Faltung wurde durch den in vitro Translationstest bestatigt. ¨ ¨ Toxizitat In einem in vitro Translationstest zeigte sich das rekombinante Gelonin toxisch bei der Inhibierung eukaryontischer Ribosomen, ein Beweis fur die native Faltung des Proteins. Wurde die Toxizitat ¨ ¨ von Gelonin1-251 unter Zuhilfenahme der aus der Aminosauresequenz berechneten Molekularmasse ¨ (28.585 Da) berechnet, so erhielt man einen Wert von 80 pM. Buttner verwendete im Toxizitatstest ¨ ¨ HisT -Gelonin1-251. Wurde die Masse von 30.495 Da berucksichtigt, so errechnete sich ein IC50 von ¨ 6 100 pM. Der HisTag besaß somit keinen Einfluss auf die Toxizitat des rekombinanten Gelonins. ¨ Wurde der unterschiedliche Reinheitsgrad zu Grunde gelegt, so waren beide Werte als identisch anzusehen. Der fehlende Einfluss des HisTag auf die Toxizitat des rekombinanten Gelonins, ließ ¨ sich durch die Lage des aktiven Zentrums erklaren. Der HisTag war N-terminal an das rekombinante ¨ Gelonin fusioniert und befand sich, unter Annahme der gleichen Faltung wie bei rekombinantem Ricin (Hosur et al., 1995), auf der abgewandten Seite des Proteins (Abb. 1.9). Bei der massenspektrometrischen Analyse von naturlichem Gelonin wurden eine Reihe von unter¨ schiedlich glykosylierten Geloninmolekulen gefunden (Hossann, 2001). Wurde ein mittleres Moleku¨ largewicht von 29.329 Da zu Grunde gelegt, berechnete sich ein IC50-Wert von 160 pM fur naturlich¨ ¨ es Gelonin. Ein Vergleich mit der Toxizitat von Gelonin 1-251 zeigte, dass dieses um den Faktor 2 ¨ toxischer war als naturliches Gelonin. Allerdings variierte die Toxizitat von naturlichem Gelonin je ¨ ¨ ¨ nach Isolierungsmethode (Tab. 4.1), daher war diese Aussage mit großer Vorsicht zu treffen. Bei einem Vergleich der Toxizitat von HisT -Gelonin1-251 , mit den von Nolan et al. und Rosenblum et ¨ 6 al. exprimierten rekombinanten Proteinen (Nolan et al., 1993; Rosenblum et al., 1995), zeigten sich große Unterschiede im absoluten Wert der Toxizitat (Tab. 4.1). Da sich die Aminosauresequenzen der ¨ ¨ rekombinanten Proteine unterschieden, war ein Vergleich mit den in dieser Arbeit gemessenen Werten nicht sinnvoll. Wahrend bei Nolan et al. eine leader-Sequenz an das rekombinante Gelonin fusioniert ¨ 50 4. Expression und Isolierung von rekombinantem Gelonin war, dessen Einfluss auf die Toxizitat nicht bestimmt wurde, verfugte das rekombinante Gelonin von ¨ ¨ Rosenblum et al. uber sieben zusatzliche Aminosauren (Abb. A.1). ¨ ¨ ¨ Die große Diskrepanz der in dieser Arbeit bestimmten Toxizitat von naturlichem Gelonin und des ¨ ¨ von Hofmann gemessenen Wertes (Hofmann, 1988), beruhte auf der unterschiedliche Reinheit der verwendeten Gelonin-Isolierungen. Hofmann rechromatographierte das isolierte Gelonin, worauf in dieser Arbeit aufgrund des hohen Zeitaufwands verzichtet wurde. ¨ Glykosylierung und Toxizitat Bei naturlichem Gelonin handelt es sich um ein Glykoprotein (Kap. 3). Die Modifizierung des Pro¨ teins mit Zuckerresten fehlt bei in E.coli exprimierten Proteinen. Aus den Ergebnissen des in vitro Translationstests zeigte sich, dass die Glykosylierung keinen Einfluss auf die Toxizitat von Gelonin ¨ besitzt. Ein direkter Einfluss der Glykosylierung auf die Toxizitat war bei der Betrachtung der Ront¨ ¨ genstruktur von Gelonin nicht zu erwarten (Abb. 1.9). Der Asparagin-Rest, der laut Hosur et al. die Glykosylierung tragt, lag auf der zum aktiven Zentrum entgegengesetzten Seite. Ein Einfluss der ¨ Oligosaccharidreste auf die Substratspezifitat oder Aktivitat von Glykoproteinen aus Pflanzen wird ¨ ¨ bis heute ausgeschlossen (Lerouge et al., 1998). Der Einfluss der Glykosylierung auf die Toxizitat von naturlichem Gelonin wurde schon von Hof¨ ¨ mann bestimmt (Hofmann, 1988). Er deglykosylierte naturliches Gelonin enzymatisch mit Exo-¨ Mannosidase und erhielt ein 20 kD schweres Protein, das in einem in vitro Translationstest eine Toxizitat von 150 pg/ml aufwies. Wurde die mit 20 kD bestimmte Molekularmasse herangezogen, dann ¨ berechnete sich die Toxizitat zu 10 pM. Daraus ergab sich eine um den Faktor 8 gesteigerte Toxizitat ¨ ¨ von deglykosyliertem Gelonin. Die von Hofmann bestimmte Molekularmasse lag allerdings deutlich unter der aus der Aminosauresequenz berechneten Molekularmasse von 28.172 Da. Moglicherweise ¨ ¨ kam es bei den Versuchen zu einer Fragmentierung des Gelonins. Ein Vergleich mit Gelonin 1-251 erschien daher nicht sinnvoll. ¨ Immunogenitat Auch wenn der HisTag keinen Einfluss auf die Toxizitat hatte, so konnte er beim spateren Ein¨ ¨ ¨ satz in vivo, in chemisch gekoppelten Immuntoxinen, einen Einfluss auf das Immunsystem des Versuchstiers haben. Aufgrund der stark polaren Histidin-Reste, konnte der HisTag stark immunogen ¨ wirken und bei mehrmaliger Gabe zur Therapie der EAMG eine Immunreaktion gegen das Konjugat auslosen. Diese Immunogenitat zeigte sich im ELISA mit polyklonalen Anti-Gelonin Antikorpern. ¨ ¨ ¨ Die Antikorper wurden im Arbeitskreis durch die Immunisierung von Mausen mit Gelonin gewon¨ ¨ nen. Allerdings erfolgte keine Aufreinigung der spezifisch gegen Gelonin gerichteten Antikorper. Die ¨ T -Gelonin Antikorperreaktion war deutlich positiver bei His 6 ¨ 1-251 , als bei Gelonin1-251 . 4.7. Diskussion 51 Ausblick Der HisTag konnte sich als nutzlich bei der chemischen Kopplung von Gelonin mit exprimierten ¨ ¨ Fragmenten des AChR erweisen. Nach der Kopplung ware es moglich, den HisTag zur Aufreinigung ¨ ¨ der Konjugate zu verwenden, und diese so von den ungekoppelten AChR-Fragmenten abzutrennen. Ein weiterer Vorteil von rekombinantem Gelonin ist die fehlende Glykosylierung. Die Oligosaccharide besitzen ein hohes immunogenes Potential (Lerouge et al., 1998; Conrad et al., 1995; Faye et al., 1993). Es wurde gezeigt, dass D-Fucose und D-Xylose Ziele von Immunglobulinen der Klasse E (IgE) bei Patienten mit Allergien gegen Pflanzenpollen sind (Bardor et al., 2003). Eine Antigenitat ¨ von naturlichem Gelonin zeigte Brust beim Einsatz von Ovalbumin-Gelonin-Konjugaten in Ratten ¨ (Brust et al., 1987). Bei den Ratten konnten im Verlauf der Behandlung Antikorper gegen Gelonin ¨ gefunden werden. Ein Einsatz von Konjugaten mit naturlichem Gelonin ware mit immer großeren ¨ ¨ ¨ Dosen an Konjugat verbunden, um den Verlust durch Komplexierung mit Anti-Gelonin Antikorpern ¨ im Blut auszugleichen. Daher ist rekombinantes Gelonin, bei gleicher Toxizitat, von großerem Inter¨ ¨ esse im in vivo Einsatz als naturliches Gelonin. ¨ 52 4. Expression und Isolierung von rekombinantem Gelonin 53 5. Klonierung, Expression und Isolierung von H--AChR 4-208 5.1. Aufgabenstellung Ein Ziel dieser Arbeit war die Synthese von Immuntoxinen aus dem Pflanzentoxin Gelonin und dem nikotinischen AChR, dem Autoantigen bei Myasthenia gravis. Die Synthese von Immuntoxinen mit dem kompletten Rezeptor und der Einsatz in in vivo Versuchen gelangen im Arbeitskreis Brust und Urbatsch (Brust et al., 1987; Urbatsch et al., 1993). Allerdings war die Aufreinigung des chemisch gekoppelten Konjugats aufgrund des geringen Molekularmassenunterschieds zwischen dem kompletten Rezeptor (250 kD) und dem Immuntoxin (280 kD) nicht vollstandig moglich. Auch zeigte sich ¨ ¨ trotz der Therapieerfolge beim Einsatz des Immuntoxins in vivo ein Anstieg des Antikorpertiters ¨ gegen den AChR. Dies ließ sich durch mogliche Bildung von Antikorpern gegen pathologisch irrele¨ ¨ vante Teile des Rezeptors erklaren. ¨ Da der großte Teil der Autoantikorper im Blut myasthener Patienten gegen den extrazellularen Teil ¨ ¨ ¨ der -Untereinheit des Rezeptors gerichtet ist, ware ein Einsatz solcher Fragmente in Immuntoxinen ¨ sinnvoll. Allerdings gestaltete sich die gentechnische Isolierung schwierig. Versuche zur Isolierung im Arbeitskreis mit Fragmenten unterschiedlicher Große scheiterten daran, dass sich diese nicht nativ ¨ isolieren ließen (Rousselle, 1996; Kreilinger, 2001; Hossann, 2001). Ursache schien das Fehlen des sog. cys-loop bei den Aminosauren 192/193 in allen verwendeten Fragmenten zu sein. Die Expres¨ sion und native Isolierung durch denaturierende Aufarbeitung und Ruckfaltung von -AChR ex gelang ¨ seit 1998 bisher in E.coli nur unter Verwendung von T--AChR ex,1-209 (Schrattenholz et al., 1998; Alexeev et al., 1999) und H--AChRex,1-207 (Tsouloufis et al., 2000). In allen Fragmenten lag der strukturbildende cys-loop vor. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Expressionsvektor pHE706, der fur die Aminosauren 4-181 ¨ ¨ des extrazellularen Teils der -Untereinheit des humanen nikotinischen AChR kodiert, um die DNA¨ Sequenz, welche fur die Aminosauren 182-208 kodiert, erweitert werden. Nach erfolgreicher Klonier¨ ¨ ung sollten Expressionsversuche durchgefuhrt und uberpruft werden, ob sich natives H--AChR 4-208 ¨ ¨ ¨ isolieren lasst. ¨ 54 5. Klonierung, Expression und Isolierung von H--AChR 4-208 Abb. 5.1.: Synthesestrategie fur das Plasmid pHE706ext (Teil 1): Synthese von ¨ pUCHE706ext durch Umklonieren der DNA-Information f ur H--AChR4-181 in den ¨ Klonierungsvektor pBDH-VU1 und Einf ugen der DNA-Information fur H--AChR182-208 durch ¨ ¨ eine 100 bp-Box aus synthetischen Oligonukleotiden. 5.2. Klonierungsstrategie von pHE706ext 55 Abb. 5.2.: Synthesestrategie fur das Plasmid pHE706ext (Teil 2): Synthese von pHE706ext ¨ durch Umklonieren der DNA-Information f ur H--AChR4-208 aus pUCHE706ext in den Ex¨ pressionsvektor pHE706. 5.2. Klonierungsstrategie von pHE706ext Die Synthese des Plasmids pHE706ext sollte nach dem in Abb. 5.1 und 5.2 dargestellten Schema erfolgen. In einem ersten Schritt sollte die Sequenz fur den AChR mit den Enzymen EcoRI und NcoI ¨ aus pHE706 herausgeschnitten und in den, mit den gleichen Enzymen geoffneten, pBDH-VU1¨ Klonierungsvektor einkloniert werden. pBDH-VU1 eignete sich fur diesen Klonierungsschritt beson¨ ders, da es sich um ein sog. high-copy Plasmid handelte und es außerdem nur eine Schnittstelle fur ¨ BclI besaß. Im nachsten Schritt sollte der erhaltene pUCHE706-Vektor mit den Enzymen BclI und ¨ EcoRI geoffnet und die aus synthetischen Oligonukleotiden synthetisierte DNA-Sequenz fur H-¨ ¨ AChR182-208 einkloniert werden. Aus dem so erhaltenen Vektor pUCHE706ext sollte anschließend durch Verdau mit NcoI und EcoRI die DNA-Information fur H--AChR4-208 in den Expressionsvek¨ 56 5. Klonierung, Expression und Isolierung von H--AChR 4-208 tor pHE706 zuruck kloniert werden. Der so synthetisierte Expressionsvektor pHE706ext sollte ¨ schließlich in der Lage sein, das gewunschte Protein zu exprimieren. Zusatzlich verfugte der Vektor ¨ ¨ ¨ uber einen N-terminalen HisTag, der die Aufreinigung des Proteins mit Hilfe der Nickel-Affinitats¨ ¨ chromatographie ermoglichen sollte. ¨ 5.3. Charakterisierung der Ausgangsvektoren 5.3.1. pHE706 Um an pHE706 gentechnische Arbeiten durchfuhren zu konnen, musste dessen DNA-Sequenz be¨ ¨ kannt sein. Der Vektor wurde uns freundlicherweise von Dr. D. Beeson (Institute of Molecular Medicine, Oxford, England) zur Verfugung gestellt, allerdings ohne genaue DNA-Sequenz-Angaben. ¨ Bekannt war allerdings, dass ein kommerziell erhaltlicher pet19b-Vektor (Fa. Novagen) zur Synthese ¨ verwendet wurde. Im Rahmen ihrer Dissertation wurde der Vektor von Kreilinger zur Kontrolle der AChR-DNA-Information sequenziert (Kreilinger, 2001), allerdings keine komplette Plasmidkarte erstellt. Durch Auswertung der Sequenzierungsdaten konnte gezeigt werden, dass die Information fur H¨ ¨ -AChR4-181 uber die XhoI und EspI (Bpu1102I)-Schnittstellen in den pet19b-Vektor einkloniert wurde. Das -AChR-Insert besaß dabei an seinen Enden Schnittstellen fur die Enzyme XhoI und ¨ Bpu10I. Damit ergab sich die in Abb. A.5 dargestellte Plasmidkarte. Die Charakterisierung von pHE706 durch Verdau mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen wurde bereits durchgefuhrt (Hossann, 2001). Sie fuhrte zu Fragmenten mit den nach der neu erstellten Plas¨ ¨ midkarte erwarteten Großen. Somit wurde das Plasmid pHE706 ausreichend charakterisiert und ¨ konnte in gentechnischen Versuchen eingesetzt werden. 5.3.1.1. pBDH-VU1 Der Klonierungsvektor pBDH-VU1 kodierte fur den Wildtyp der lecithinabhangigen (R)-3-Hydroxy¨ ¨ butyrat Dehydrogenase (BDH) und wurde von Jehl im Arbeitskreis zu deren Expression eingesetzt (Jehl, 2002). Der Vektor wurde von ihm durch Restriktionsverdau charakterisiert und konnte daher in gentechnischen Versuchen eingesetzt werden. Die Plasmidkarte ist ein Abb. A.4 dargestellt und zeigt die fur diese Arbeit relevanten Schnittstellen fur Restriktionsenzyme. ¨ ¨ 5.3. Charakterisierung der Ausgangsvektoren 57 5.3.2. Synthese von pUCHE706 Zur Synthese von pUCHE706 wurden Glycerinkulturen mit BL21(DE3) pHE706 und DH5 pBDHVU1 auf Agarplatten mit dem entsprechenden Antibiotikum ausgestrichen und im Brutschrank bei ¨ 37 C inkubiert. Aus den erhaltenen Einzelkolonien wurden Ubernachtkulturen angelegt und daraus am nachsten Tag die Plasmide mit dem QIAprep-Kit (Fa. Qiagen) isoliert. Durch einen Verdau mit ¨ den Restriktionsenzymen EcoRI und NcoI erhielt man die gewunschten Fragmente, die auf einem ¨ Agarosegel aufgetrennt werden konnten (Abb. 5.3). Mit Hilfe des QIAEX II-Kits (Fa. Qiagen) wurde das 879 bp (pHE706) und das 3.194 bp (pBDH-VU1) große Fragment aus dem Agarosegel isoliert und mit T4 DNA-Ligase ligiert. Im folgenden Schritt wurde zur Synthese von pUCHE706ext das Restriktionsenzym BclI benotigt, welches nur die unme¨ thylierte DNA-Sequenz TGATCA erkennt und schneidet. Daher musste das Plasmid pUCHE706 in einen E.coli-Stamm mit der dam- Mutation transformiert werden. E.coli besitzen zwei spezifische Methylationssysteme fur DNA (Marinus und ¨ Morris, 1973; May und Hattman, 1975). Die Methylase Dam methyliert spezifisch die N6-Position des Adeninrestes in der Sequenz GATC (Hattman et al., 1978) und verhindert so die Restriktion mit BclI. Fur die weiteren Versuche eigneten sich ¨ GM2163-Zellen, die die Mutation dam- tragen und im Arbeitskreis verwendet wurden. Nach der Inaktivierung der Ligase durch Inkubation bei 65 C, wurde die Ligationslosung daher in kompetente GM2163 Zellen ¨ transformiert. Durch Restriktionsverdau wurden die entstandenen Transformanten charakterisiert (Abb. 5.4). Es wurden die Enzyme BclI, BglII, DraII, HindIII, EcoRI und MboII verwendet. Beim Verdau mit dem Enzym MboII war die Zuordnung Abb. 5.3.: 0,9 %iges Agarosegel - Verdau der Ausgangsvektoren mit EcoRI und NcoI; Bahn 1: pBDHVU1, Bahn 2: pHE706 aufgrund der Verwendung eines 0,9 %igen Agarosegels nur bedingt moglich. Die anderen eingeset¨ zten Enzyme zeigten das erwartete Bandenmuster. Daher konnte vom Vorliegen von pUCHE706 ausgegangen werden. 5.3.3. Synthese der 100 bp-Box Die 100 bp-Box (Abb. 5.5 und 5.6), welche die Information fur die fehlenden Aminosauren enthielt, ¨ ¨ wurde auf zwei verschiedenen Wegen synthetisiert. Es wurden 5 bzw. 2 synthetische Oligonukleotide zusammengefugt. An den Enden dieser 100 bp-Box waren die Basensequenzen fur eine EcoRI bzw. ¨ ¨ 58 5. Klonierung, Expression und Isolierung von H--AChR 4-208 (a) (b) BclI BglII DraII EcoRI HindIII MboII (c) 1 1 2 1 2 9 4.073 4.073 2.946, 1.125 4.073 3.142, 931 851, 791, 756, 755, 454, 208 , 109 , 78 , 71 Abb. 5.4.: Charakterisierung von pUCHE706 - (a) Plasmidkarte mit den verwendeten Restriktionsenzymen. (b) 0,9 %iges Agarosegel: Bahn 1: DNA-Marker -DNA AvaII, Bahn 2: HindIII, Bahn 3: BglII, Bahn 4: DraII, Bahn 5: MboII, Bahn 6: BclI, Bahn 7: EcoRI, Bahn 8: unverdautes Plasmid, (c) Verwendete Restriktionsenzyme mit Anzahl der Schnittstellen (kursiv) und erwartete Große der Fragmente. Auf dem Agarosegel gefundene Fragmente sind fett gedruckt. ¨ nicht aufgelost, nur als verwaschene Bande sichtbar. ¨ Abb. 5.5.: DNA-Sequenz der 100 bp-Box. Die zur Synthese verwendeten 2 bzw. 5 synthetischen Oligonukleotide sind markiert. 5.3. Charakterisierung der Ausgangsvektoren 59 Abb. 5.6: Nachweis der synthetisierten 100 bpBox durch Agarosegele - (a) 3 %iges Agarosegel zum Nachweis der 100 bp-box synthetisiert aus 5 Oligonukleotiden; Bahn 1: DNA-Marker pBR322 BsuRI, Bahn 2: Annealing der Oligonukleotide ext2, ext3 und ext4, Bahn 3: Annealing der Oligonukleotide ext1 bis ext5 zur 100 bp-Box, Bahn 4: Annealing der Oligonukleotide ext1 und ext5. (b) 2 %iges Agarosegel zum Nachweis der 100 bp-Box synthetisiert aus den Oligonukleotiden ext123 und ext45; Bahn 1: DNA-Marker pBR322 BsuRI, Bahn 2: 100 bp-Box. (a) (b) BclI-Schnittstelle in Form von uberhangende Enden enthalten. ¨ ¨ Verwendung von 5 Oligonukleotiden Die Zusammenlagerung der Oligonukleotide wurde durch zehnminutige Inkubation bei 70 C und an¨ schließendem langsamen Abkuhlen auf Raumtemperatur in Annealing-Puffer (100 mM Tris, 100 mM ¨ MgCl2 , 500 mM NaCl, pH 7,5) erreicht. Alle 5 Oligonukleotide (je 200 pmol) wurden zusammen unter diesen Bedingungen inkubiert und auf ein Agarosegel aufgetragen. Man erhielt in geringer Ausbeute und Reinheit ein 100 bp großes Fragment (Abb. 5.6(a), Bahn 3). Die niedermolekularen Fragmente stammten aus unvollstandig zusammengelagerten Oligonukleotiden. Wurden nur die Oligonuk¨ leotide ext1 und ext5 (Bahn 4) bzw. ext2, ext3 und ext4 (Bahn 2) umgesetzt, so wurden die entsprechenden niedermolekularen Banden erhalten. Die so synthetisierte 100 bp-Box konnte allerdings nicht verwendet werden, da die EcoRI-Schnittstelle nicht richtig gebildet wurde. Wahrend die Ligation mit T4-DNA-Ligase und einem Fragment mit ¨ BclI-Schnittstelle gelang, konnte die andere Seite der 100 bp-Box nicht ligiert werden (nicht gezeigt). Verwendung von 2 Oligonukleotiden Zur Ligation mussten die Oligonukleotide am 5'-Ende phosphoryliert werden. Dazu wurden die Oligonukleotide ext123 und ext45 (je 100 pmol) mit 20 µmol ATP und 10 U T4-Polynukleotid Kinase in T4-Polynukleotid Kinase Puffer fur 20 Minuten bei 37 C inkubiert. Die beiden Phospho¨ rylierungsansatze wurden zum Annealing der Oligonukleotide vereint und mit 10xAnnealing-Puffer ¨ (100 mM Tris, 100 mM MgCl 2 , 500 mM NaCl, pH 7,5) versetzt. Die Losung wurde 10 Minuten bei ¨ C inkubiert, wodurch auch die T4-Polynukleotid Kinase deaktiviert wurde. Das Zusammenlagern 70 der Oligonukleotide erfolgte beim langsamen Abkuhlen auf Raumtemperatur. Beim Auftragen der ¨ Losung auf ein Agarosegel, fand sich ein einziges Produkt mit der Große von ca. 100 bp (Abb. 5.6(b), ¨ ¨ 60 5. Klonierung, Expression und Isolierung von H--AChR 4-208 (a) (b) MboII 9 (c) 791, 756, 755, 669, 454, 208, 109, 78, 71 Abb. 5.7.: Charakterisierung von pUCHE706ext durch Verdau mit MboII - (a) Plasmidkarte mit den zur Charaktierisierung verwendeten Restriktionsenzymen, (b) 2,5 %iges Agarosegel, Bahn 1: DNA-Marker pBR322/AluI, Bahn 2-4: pUCHE706ext (Klon 1-3) MboII, Bahn 5: pUCHE706 MboII, Bahn 6: pHE706 MboII, (c) Verwendete Restriktionsenzyme mit Anzahl der Schnittstellen (kursiv) und erwartete Gr oße der Fragmente. Auf dem Agarosegel gefundene ¨ Fragmente sind fett gedruckt. Fragmente die nicht eindeutig identifiziert werden konnten, sind unterstrichen dargestellt. Bahn 2). Aufgrund dieser Ergebnisse wurde, bei den weiteren Versuchen, auf die aus 2 Oligonukleotiden synthetisierte 100 bp-Box zuruckgegriffen. ¨ 5.3.4. Synthese von pUCHE706ext Zur Synthese von pUCHE706ext wurde pUCHE706 mit den Enzymen EcoRI und BclI geschnitten. Von den erhaltenen Fragmenten wurde das Großere (3.791 bp) isoliert und mit der 100 bp-Box ¨ ligiert. Nach der Transformation in kompetente GM2163 E.coli-Zellen erhielt man Transformanden. 10 der Transformanden wurden zur Plasmidisolierung verwendet und diese mittels Restriktionsverdau charakterisiert. 3 Plasmide zeigten das erwartete Bandenmuster, die restlichen Plasmide wurden verworfen. In Abb. 5.7 ist der Verdau von pUCHE706ext mit dem Restriktionsenzym MboII dargestellt. Ein Verdau mit den Enzymen EcoRI, NcoI, BglI, XhoI wurde ebenfalls durchgefuhrt und zeigte die er¨ warteten Bandenmuster (nicht gezeigt). Bis auf die niedermolekularen Fragmente des MboII-Verdaus, die auf dem 0,9 %igen Agarosegel nicht aufzutrennen waren, fanden sich nur Banden der erwarteten Großen. Die unterstrichenen Fragmente konnten aufgrund der ahnlichen Große nicht aufgelost wer¨ ¨ ¨ ¨ 5.3. Charakterisierung der Ausgangsvektoren 61 (a) (b) BclI EcoRI / NcoI EcoRV HincII ScaI StyI XhoI (c) 2 2 1 2 1 2 1 4.576, 1.438 5.317, 697 6.014 3.532, 2.482 6.014 3.689, 2.325 6.014 Abb. 5.8.: Charakterisierung von pHE706ext durch Verdau mit verschiedenen Restriktionsenzymen - (a) Plasmidkarte mit den zur Charakterisierung verwendeten Restriktionsenzymen. (b) 0,9 %iges Agarosegel, Bahn 1: DNA-Marker -DNA/Eco47I (AvaII), Bahn 2: pUCHE706 NcoI und EcoRI, Bahn 3: pHE706 NcoI und EcoRI, Bahn 4: EcoRI und NcoI, Bahn 5: BclI, Bahn 6: ScaI, Bahn 7: EcoRV, Bahn 8: HincII, Bahn 9: XhoI, Bahn 10: StyI. (c) Verwendete Restriktionsenzyme mit Anzahl der Schnittstellen (kursiv) und erwartete Gr oße der Fragmente. ¨ Auf dem Agarosegel gefundene Fragmente sind fett gedruckt. den. Zum Vergleich sind der Verdau der Plasmide pUCHE706 (Bahn 5) und pHE706 (Bahn 6) mit MboII dargestellt. Das Bandenmuster beim Verdau von pUCHE706ext und pUCHE706 unterschieden sich in einer einzigen Bande: Die Bande bei 669 bp, die beim Verdau von pUCHE706ext auftrat, wurde beim Verdau von pUCHE706 durch eine Bande bei 851 bp ersetzt. Die abschließende Charakterisierung von pUCHE706ext erfolgte durch Sequenzierung. Dabei wurde der Bereich der 100 bp-Box mit Standard-Sequenzierprimern fur pUC-Vektoren sequenziert. Es zeigte sich, dass bei ¨ allen drei isolierten Klonen die richtige DNA-Sequenz der 100 bp-Box vorlag. Zur Lagerung der Zellen wurden Glycerinkulturen hergestellt. 5.3.5. Synthese von pHE706ext Der pUC-Klonierungsvektor pUCHE706ext war fur Expressionsversuche nicht geeignet. Daher ¨ ¨ musste die Information fur das verlangerte AChR-Fragment in einen Expressionsvektor einkloniert ¨ 62 5. Klonierung, Expression und Isolierung von H--AChR 4-208 werden. Dazu wurde das Fragment mit den Enzymen NcoI und EcoRI aus dem Plasmid herausgeschnitten und uber diese Schnittstellen in den pHE706-Vektor eingebaut. Nach erfolgter Ligation ¨ wurde das Plasmid in kompetente BL21(DE3) E.coli-Zellen transformiert, 8 Transformanten gepickt, ¨ Ubernachtkulturen angelegt und aus diesen Zellen Plasmid isoliert. Sieben Klone zeigten bei einem Restriktionsverdau das erwartete Bandenmuster. Dies ist in Abb. 5.8 fur einen Klon dargestellt. ¨ Da die Klonierung mit Hilfe der Enzyme NcoI und EcoRI erfolgte, wurde zur Kontrolle pHE706 erneut mit diesen Enzymen verdaut und im Agarosegel aufgetragen (Bahn 3). Der Verdau von pHE706ext zeigte zwei Banden, wobei die hohermolekulare Bande, wie erwartet, die identischer Große, ¨ ¨ wie die 5.317 bp Bande beim Verdau von pHE706, zeigte. Der Verdau von pUCHE706 wurde ebenfalls als Vergleich aufgetragen (Bahn 2). Die niedermolekulare Bande ist deutlich großer, als ¨ beim Verdau von pHE706ext. Alle anderen verwendeten Restriktionsenzyme zeigten ebenfalls die erwarteten Banden. Damit wurde pHE706ext ausreichend charakterisiert und konnte in Expressionsversuchen eingesetzt werden. Zur Lagerung der Zellen wurden Glycerinkulturen hergestellt. 5.4. Expression und Lyse der Zellen Das Plasmid pHE706ext kodierte fur den N-terminalen extrazellularen Teil der -Untereinheit des ¨ ¨ humanen, nikotinischen Acetylcholinrezeptors mit den Aminosauren 4 bis 208 (Swiss-Prot P02708, ¨ E -H--AChR ¨ Noda et al., 1983). Wahrend das in pHE706 kodierte His 10 ¨ 4-181 nur die Aminosauren 4 bis 181 enthielt, besaß His E0 -H--AChR4-208 den strukturbildenden cys-loop (TYSCCPD). Zur 1 Aufreinigung mit Hilfe der Nickel-Affinitatschromatographie war ein N-terminaler HisTag mit 10 ¨ Histidin-Resten vorhanden, der mit Hilfe von Enterokinase abgespalten werden konnte. Dabei entstand H--AChR4-208 (Abb. 5.9). Zur Expression wurden Glycerinkulturen von BL21(DE3) pHE706ext auf LBA-Agarplatten als Verdunnungsausstrich angelegt und uber Nacht bei 37 C im Brutschrank inkubiert. Am nachsten ¨ ¨ ¨ Tag wurde je eine einzelne Kolonie gepickt und damit je 25 ml LBA-Medium angeimpft. Diese ¨ Ubernachtkulturen wurden bei 37 C und 300 U/min im Wasserbadschuttler inkubiert. Am folgen¨ den Tag wurde die optische Dichte der Kulturen bestimmt. Mit 10 ml der Kultur mit dem hochsten ¨ OD600nm -Wert wurden 500 ml LBA-Medium angeimpft und bei 37 C und 250 U/min im Luftschuttler ¨ ¨ inkubiert. Zur Wachstumskontrolle wurde die OD 600nm stundlich gemessen. Erreichte die Kultur einen Wert zwischen 1 und 1,2, erfolgte die Induzierung mit 1 mM IPTG. Anschließend wurden die Schuttelkulturen unter den gleichen Bedingungen wie zuvor inkubiert. Nach dreistundigem Wachs¨ ¨ tum wurden die Zellen in ein Eiswasser-Bad gestellt und das Wachstum gestoppt. Durch Zentrifugation bei 6.400 xg gelang die Abtrennung der Zellen vom Nahrmedium. Die Zellpellets wurden ¨ zweimal mit Pellet-Waschpuffer gewaschen und bis zum Zellaufschluss auf Eis gelagert. Zum Auf- 5.5. Aufarbeitung der inclusion bodies 63 (a) HisE0 -H--AChR4-181 1 (b) HisE0 -H--AChR4-208 1 (c) H--AChR4-208 Abb. 5.9.: Primarstruktur der rekombinanten H--AChR ex -Fragmente (schematisch) - (a) ¨ E -H--AChR His10 ¨ 4-181 besaß die Aminosauren 4-181 der Untereinheit des humanen, nikotinischen AChR (weiß), mit einem N-terminalen 10xHisTag (schraffiert) und einer EnterokinaseSchnittstelle (Pfeil). Die Sequenz enthielt die MIR (WNPDDYGGVK). (b) Das verl angerte Pro¨ E -H--AChR tein His10 ¨ 4-208 enthielt zusatzlich den strukturbildenden cys-loop (TYSCCPD). (c) H--AChR4-208 : Inkubation von HisE0 -H--AChR4-208 mit Enterokinase fuhrte zur Abspaltung ¨ 1 des HisTag. schluss der Zellen wurden diese mit Resuspendierpuffer (20 mM PBS, 500 mM Natriumchlorid, pH 7,4) resuspendiert und mit PMSF-Stammlosung (1 µl/ml) und 1 mg/ml Lysozym versetzt. Nach dreißig¨ minutiger Inkubation wurden die Zellen mit Ultraschall lysiert, bei 30.000 xg dreißig Minuten zen¨ trifugiert und so das Zelllysat von den inclusion bodies und Zelltrummern abgetrennt. ¨ 5.5. Aufarbeitung der inclusion bodies Um eine optimale Isolierungsmethode fur H--AChR4-210 zu finden, wurden die folgenden Ver¨ suche mit NiCAM-Saulenmaterial (Fa. Sigma) im Batchverfahren durchgefuhrt. Das Saulenmaterial ¨ ¨ ¨ ermoglichte eine Isolation im kleinem Maßstab und im Batch-Verfahren. Außerdem tolerierte es bis ¨ zu 20 mM Mercaptoethanol und eignete sich dadurch besonders zur Aufreinigung von Proteinen aus 64 5. Klonierung, Expression und Isolierung von H--AChR 4-208 inclusion bodies. Die inclusion bodies wurden mit denaturierendem Puffer (6 M Guanidin-hydrochlorid, 500 mM Natriumchlorid, 50 mM Natriumdihydrogenphosphat, 20 mM Imidazol, 1 mM Mercaptoethanol, pH 8) resuspendiert und uber Nacht unter leichtem Ruhren inkubiert. Nach dreißigminutiger Zentrifugation ¨ ¨ ¨ ¨ (30.000 xg) erhielt man die gelosten inclusion bodies im Uberstand. Die Losung wurde ultrazen¨ ¨ ¨ trifugiert (400.000 xg, 4 C, 60 Minuten) und der Uberstand direkt auf das Saulenmaterial aufgetra¨ gen. Ungebundene Proteine wurden durch Denaturierungspuffer entfernt und die gebundenen Proteine mit unterschiedlichen Imidazolkonzentrationen (100, 200, 500 mM) im Denaturierungspuffer eluiert. Bereits bei der Inkubation mit 100 mM Imidazol wurde der großte Teil der gebundenen Pro¨ teine eluiert. Die Untersuchung der Fraktionen in der SDS-PAGE ergab, dass kein Protein mit der erwarteten Molekularmasse von ca. 27 kD an die Saule gebunden hatte (nicht gezeigt). ¨ ¨ 5.6. Aufarbeitung des Zelluberstandes mit Nickel-Affinitatschromatographie ¨ In Vorversuchen wurden Proteine mit der fur HisE0 -H--AChR4-208 erwarteten Molekularmasse von ¨ 1 ca. 27 kD im Zelllysat gefunden (nicht gezeigt). Zur Untersuchung, ob sich His E0 -H--AChR4-208 1 moglicherweise im Zelllysat befand, wurden 1,5 ml (ca. 10 mg) des in der Ultrazentrifuge zentrifu¨ gierten Zelllysates auf 50 µl Saulenmaterial (Bindungskapazitat ca. 20-25 mg Protein/ml Saulenmate¨ ¨ ¨ rial) aufgetragen und eine Stunde unter leichtem Schutteln inkubiert. Danach wurde das Saulenmate¨ ¨ ¨ rial abzentrifugiert und der Uberstand vorsichtig mit einer Pipette entfernt. Anschließend wurde 4 bis 6 mal mit je 1 ml Resuspendierpuffer gewaschen, um alle ungebundenen Proteine zu entfernen. 5.6.1. Versuche zur Elution mit Imidazol Zur Elution der gebundenen Proteine wurden Puffer mit unterschiedlichen Imidazolkonzentrationen verwendet. Puffer mit 100 und 500 mM Imidazol wurden nacheinander auf die Saule gegeben. In ¨ beiden Fraktionen konnten Proteine eluiert werden. In Abb. 5.10 ist das SDS-Gel und der ELISA der Saulenfraktionen dargestellt. ¨ Im ELISA zeigte nur die Elutionsfraktion mit 500 mM Imidazol, bei Verwendung von Anti-His und konformationsabhangigen mAb 35 Antikorpern (-AChR, human, native MIR), eine deutliche Reak¨ ¨ tion. Dies ließ auf die erfolgreiche Expression von nativem His E0 -H--AChR4-208 schließen. Die 1 leicht positive Reaktion des Durchlaufs war auf eine unvollstandige Bindung von H--AChR 4-208 ¨ zuruckzufuhren. In der entsprechenden Fraktion im SDS-PAGE (Abb. 5.10, Bahn 3) waren allerdings ¨ ¨ eine große Zahl von Proteinen zu sehen. Ein Protein der gesuchten, berechneten Molekularmasse von 27 kD, war in der Fraktion, die mit 500 mM Imidazol eluiert wurde, zu finden. In einem Western Blot der Saulenfraktionen mit Anti-His-Tag Antikorpern zeigte sich beim Zelllysat ¨ ¨ 5.6. Aufarbeitung des Zelluberstandes mit Nickel-Affinitatschromatographie ¨ ¨ 65 (a) (b) Abb. 5.10.: Isolierungsversuch von HisE0 -H--AChR4-208 durch Elution mit Imidazol - (a) 1 SDS-PAGE (12 %iges Trenngel, Silberf arbung) der Saulenfraktionen, Bahn 1: Proteinmarker, ¨ ¨ Bahn 2: Zelllysat (80 µg), Bahn 3: Durchlauf (80 µg), Bahn 4: Durchlauf (20 µg), Bahn 5: Elution mit 100 mM Imidazol (20 µg), Bahn 6: Elution mit 500 mM Imidazol (20 µg) - (b) ELISA der Saulenfraktionen mit mAb 35 (1:1000) und Anti-HisTag Antik orpern (1:1000), Durchlauf ¨ ¨ und Waschfraktion (20 µg), Elution mit 100 und 500 mM Imidazol (2 µg), als Negativkontrolle wurde BSA (5 µg) verwendet. eine sehr schwache Reaktion im Bereich zwischen 20-30kD mit einer breiten Bande (nicht gezeigt). Moglicherweise eigneten sich die Antikorper nicht fur den im Protein vorliegenden HisTag, da es sich ¨ ¨ ¨ nicht um einen 6x, sondern um einen 10xHisTag handelte. Ein Western Blot mit den im ELISA positiv ¨ ¨ reagierenden mAb 35 war nicht moglich, da es sich um einen konformationsabhangigen Antikorper ¨ handelte, der nur native Antigene erkennt. 5.6.2. Versuche zur Elution mit Enterokinase Da eine Isolierung durch die Elution mit Imidazol scheiterte, sollte das Protein durch direkte Abspaltung des HisTag mit Enterokinase von der Saule eluiert werden. Enterokinase ist eine Endo¨ protease, welche die Aminosauresequenz AspAspAspAspLys erkennt und C-terminal des Lys eine ¨ Peptidbindung spaltet. Das Saulenmaterial wurde wie oben beschrieben mit dem Zelllysat beladen und so lange mit Re¨ suspendierpuffer gewaschen bis keine ungebundenen Proteine mehr im Saulenmaterial vorlagen. An¨ schließend wurde mit 1 ml Enterokinasepuffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM Natriumchlorid, 2,5 mM Calciumchlorid, pH 7,4) equilibriert. Da durch den Pufferwechsel die Bindungseigenschaft des Sau¨ lenmaterials verandert werden konnte, wurde uberpruft, ob Protein von der Saule eluiert wurde. In ¨ ¨ ¨ ¨ ¨ einer Proteinbestimmung konnte kein Protein detektiert werden. Anschließend wurde das Saulenma¨ 66 5. Klonierung, Expression und Isolierung von H--AChR 4-208 (a) (b) Abb. 5.11.: Isolierungsversuch von H--AChR4-210 durch Elution mit Enterokinase - (a) SDSPAGE (12 %iges Trenngel, Silber-Farbung) der Saulenfraktionen, Bahn 1: Zelllysat (70 µg), ¨ ¨ Bahn 2: Durchlauf (70 µg), Bahn 3: Elutionsfraktion mit Enterokinase (7 µg), Bahn 4: Elutionsfraktion mit 500 mM Imidazol (17 µg) - (b) ELISA der S aulenfraktionen mit mAb 35 Antik orpern ¨ ¨ (1:1000), Zelllysat (10 µg), Durchlauf (10 µg), Fraktion eluiert mit Enterokinase (rEk, 2 µg), Fraktion eluiert mit 500 mM Imidazol (Imidazol, 2 µg), Negativkontrolle BSA (5 µg). terial mit 100 µl Enterokinasepuffer und 1 µl rekombinanter Enterokinase (1,7 U/µl) fur 19 Stunden ¨ bei 20 C im Wasserbad inkubiert und die Elutionsfraktion durch Zentrifugation gesammelt. Zum Entfernen aller weiteren gebundenen Proteine wurde das Saulenmaterial schließlich mit 500 mM Im¨ idazol inkubiert und die restlichen Proteine eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden durch Lowry, ELISA und SDS-PAGE charakterisiert. Bei der Abspaltung des HisTag durch die Enterokinase verringerte sich die berechnete Molekularmasse von H--AChR4-208 auf ca. 24,2 kDa. Im SDS-PAGE war in der Fraktion, die mit Enterokinase eluiert wurde, ein Protein mit der Molekularmasse von ca. 26 kD neben zwei hohermolekularen Verunreinigungen zu sehen (Abb. 5.11, Bahn 3). Die Konzen¨ tration der eluierten Fraktion lag bei 0,11 mg/ml. In der Fraktion, die mit 500 mM Imidazol von der Saule eluiert wurde, war eine große Anzahl verschiedenster Proteine zu sehen (Bahn 4). ¨ 5.6.3. Filtration mit Amicon Ultra-Konzentratoren (MWCO 30.000) Bei der Elution mit Enterokinase zeigten sich vor allem hohermolekulare Verunreinigungen. Durch ¨ eine Filtration durch eine Polymermembran mit einem Ausschlussvolumen von 30 kD, sollte es mog¨ lich sein, die Verunreinigungen abzutrennen. Fur diesen Zweck wurden Amicon Ultra Konzentratoren ¨ (MWCO 30.000) verwendet. Die Proteinlosung wurde eingefullt und bei 3.291 xg durch die Mem¨ ¨ bran zentrifugiert. Eine Analyse des Filtrats mit Hilfe von Lowry und SDS-PAGE zeigte, dass das gewunschte 24 kD große Protein die Membran nicht passiert hatte (nicht gezeigt). ¨ 5.7. Diskussion 67 5.7. Diskussion In dieser Arbeit wurde das Plasmid pHE706, welches fur H--AChR4-181 kodiert, um die DNA¨ Information fur H--AChR182-208 erweitert und erfolgreich exprimiert. Dabei konnte zum ersten Mal ¨ ein -AChRex -Fragment nach der Expression in E.coli nativ im Zelllysat nachgewiesen werden. Die Expression von -AChRex -Fragmenten in E.coli ist bekannt (Schrattenholz et al., 1998; Alexeev et al., 1999; Tsouloufis et al., 2000). Allerdings lag in allen beschriebenen Isolierungen das gewunschte Protein in inclusion bodies vor und musste denaturierend aufgearbeitet werden. Die Ex¨ pression in CHO K1 Zellen (West jr. et al., 1997) und Xenopus Eizellen (Wells et al., 1998) fuhrte ¨ zwar zu nativ gefalteten, loslichen Proteinen, allerdings in geringen Ausbeuten und Konzentratio¨ nen. Fur Kopplungs- und Kristallisationsexperimente waren diese Isolierungen nicht geeignet. In Tab. ¨ 5.2 ist ein Vergleich der bisher beschriebenen Expressionen mit dem hier exprimierten -AChR ex Fragment aufgefuhrt. ¨ Klonierung In einem ersten Schritt musste eine Plasmidkarte fur den Ausgangsvektor pHE706 erstellt wer¨ den, um gentechnische Arbeiten durchfuhren zu konnen. Dazu wurden die Sequenzierungsdaten von ¨ ¨ Kreilinger (Kreilinger, 2001), die Ergebnisse des Restriktionsverdaus des Vektors (Hossann, 2001) und die Angaben von Dr. D. Beeson ausgewertet. Es stellte sich heraus, dass die Information fur ¨ ¨ H--AChR4-181 uber die XhoI und EspI (Bpu1102I)-Schnittstellen in den pet19b-Vektor einkloniert wurde. Die im Restriktionsverdau gefundenen Fragmente bestatigten die neu erstellte Plasmidkarte. ¨ Unter Berucksichtigung der Aminosauresequenz fur H--AChR (Swissprot P02708) wurden syn¨ ¨ ¨ thetische Oligonukleotide herausgesucht, welche, nach erfolgter Zusammenlagerung zu einer 100 bpBox, die DNA-Information fur H--AChR182-208 bildeten. Mit Hilfe des in den Abb. 5.1 und 5.2 ¨ dargestellten Klonierungsschemas, gelang die Synthese eines Expressionsplasmids fur His E0 -H-¨ 1 ¨ ¨ AChR4-208 . Es enthielt zusatzlich die DNA-Information fur einen N-terminalen 10xHisTag und eine Schnittstelle fur Enterokinase. ¨ Eine Verlangerung des Gens fur den extrazellularen Teil der -Untereinheit des nikotinischen AChR ¨ ¨ ¨ von den Aminosauren 4-181 auf 4-208 ließ aus mehreren Grunden eine erfolgreiche native Isolierung ¨ ¨ ¨ von H--AChRex erwarten. Neben den strukturbildenden Cys-Resten der Aminosauren 192/193 (Brejc et al., 2001), war auch der komplette N-terminale extrazellulare Teil enthalten. Chavez und Hall ¨ bestimmten durch die Klonierung und Expression von Chimarenrezeptoren, dass 207 noch aus der ¨ Membranoberflache herausragt (Chavez und Hall, 1992). Durch ELISA mit konformationsabhangig¨ ¨ en Antikorpern und einem -Bungarotoxin-Bindungsassay zeigten Im et al., das ein H--AChR 1-210 ¨ Fragment eine deutlich nativere Struktur ausbildet, als ein H--AChR1-205 -Fragment (Im et al., 2000). 68 5. Klonierung, Expression und Isolierung von H--AChR 4-208 Tab. 5.1: Vergleich der aus den SDSGelen bestimmten Molekularmassen (MSDS ) mit den aus den Aminosaurese¨ quenzen berechneten Molekularmassen (Mkal k. ). (Schrattenholz et al., 1998), (Hossann, 2001) Mkalk. (Da) HisE0 -H--AChR4-208 1 H--AChR4-208 T--AChR1-209 26.817,3 24.159,6 24.796,3 MSDS (kDa) 27,6 26,0 26,0 ¨ Isolierung mit Nickel-Affinitatschromatographie Durch eine Analyse des Zelllysates und der inclusion bodies mit Hilfe einer SDS-PAGE, wurde deutlich, dass HisE0 -H--AChR4-208 nach der Expression im Zelllysat vorlag. Nur dort konnte ein Pro1 tein mit der gesuchten Molekularmasse von ca. 27 kD nachgewiesen werden. Zur Isolierung wurde das Zelllysat auf mit Nickel-Ionen beladenes NiCAM Saulenmaterial aufgetragen und im Batch¨ Verfahren eluiert. Bei der Elution mit steigender Imidazol-Konzentration konnte das gewunschte Pro¨ tein isoliert werden, allerdings mit einer großen Anzahl von weiteren hoher- und niedermolekularen ¨ ¨ Proteinen verunreinigt. Die Elution mit Enterokinase lieferte H--AChR 4-208 in großerer Reinheit, allerdings immer noch durch zwei weitere hohermolekulare Proteine verunreinigt. Moglicherweise ¨ ¨ kam es zu einer unspezifischen Spaltung hohermolekularer Peptide aufgrund der langen Inkuba¨ ¨ ¨ tionsdauer. Eine Datenbanksuche nach E.coli-Proteinen mit Schnittstellen fur Enterokinase fuhrte allerdings zu keinem positiven Ergebnis. Durch Optimierung der Aufreinigung sollte allerdings eine ¨ ¨ Isolierung von nicht verunreinigtem H--AChR4-208 moglich sein. Ein zusatzlicher Waschschritt mit Imidazolkonzentrationen um 200 mM konnte die Menge der unspezifisch gebundenen Proteine ¨ reduzieren und die Spezifitat der Enterokinasereaktion erhohen. Dies wurde im Rahmen dieser Ar¨ ¨ beit nicht mehr durchgefuhrt. In Tab. 5.1 sind die aus den SDS-Gelen bestimmten Molekularmassen ¨ mit den aus der Aminosauresequenz berechneten Molekularmassen gezeigt, Die Masse von H-¨ ¨ ¨ AChR4-208 stimmte mit der fur T--AChR1-209 bestimmten Masse uberein (Hossann, 2001). Faltung ¨ Uberraschenderweise fand sich das exprimierte HisE0 -H--AChR4-208 nativ im Zelllysat und nicht 1 in den inclusion bodies. Die native Faltung von His E0 -H--AChR4-208 bzw. H--AChR4-208 ließ 1 sich mit Hilfe eines ELISA mit mAb 35 Antikorpern nachweisen. Diese konformationsabhangigen ¨ ¨ Antikorper erkennen nur die nativ gefaltete MIR und ergaben eine deutlich positive Reaktion. Die ¨ Schnittstelle fur Enterokinase in HisE0 -H--AChR4-208 war intakt, da die Abspaltung des HisTag ¨ 1 direkt auf der Saule gelang. Untersuchte man die Saulenfraktionen beider Isolationsmethoden im ¨ ¨ ELISA, so fand sich bei der Elution mit Imidazol das His E0 -H--AChR4-208 -Fragment in der Frak1 tion, die mit 500 mM Imidazol eluiert wurde. Bei der Untersuchung der Fraktionen der Enterokinaseelution befand sich H--AChR4-208 ausschließlich in der Fraktion, die mit Enterokinase eluiert wurde. Die restlichen, noch gebundenen Proteine wurden danach mit 500 mM Imidazol von der Saule ¨ eluiert und zeigten im ELISA keine Reaktion. 5.7. Diskussion H--AChR4-208 Literatur H--AChR4-181 (Hossann, 2001) M--AChR1-210 (West jr. et al., 1997) Maus Xenopus Eizellen i.b. k.A. E.Coli human Maus T--AChR1-209 (Schrattenholz et al., 1998) T--AChR1-209 (Alexeev et al., 1999) H--AChR1-207 (Tsouloufis et al., 2000) M--AChR1-211 (Yao et al., 2002) AChBP (Brejc et al., 2001) Expression Ursprung human E.Coli Torpedo californica E.Coli Torpedo californica E.Coli human Lymnaea stagnalis Hefe (Pichia pastoris) loslich ¨ k.A. Wirt E.Coli Ausbeute (mg/l Schuttelkultur) ¨ Tag n.g. k.A. 0,04 0,2 10 / 0,2 loslich ¨ n.g. N-terminal 10xHis i.b. n.g. N-terminal 10xHis loslich ¨ µg Maßstab GPI-Anker i.b. ca. 10 C-terminal 6xHis i.b. ca. 10 N-terminal 6xHis max. Konzentration (mg/ml) 0,1 Hefe (Pichia pastoris) loslich ¨ 3 N-terminal FLAG + C-terminal His 30 20 Struktur Mber. (Da) Mexp. (kD) Glykosylierung Bildung von Oligomeren 23.987.0 24,5 nein n.g. n.g. n.g. n.g. n.g. n.g. 12 51 18 20 3 15 45 k.A. k.A. 4 k.A. 31,5 ja nein 24.796,3 26 / 26,0 nein k.A. / ja 29.380 29.568 nein Dimer (MS) / Oligomer (HPLC) 351 /362 561 /322 01 /202 101 /112 141 26.817,3 27,6 nein ja k.A. k.A. nein k.A. n.g. n.g. n.g. n.g. sehr schwach3 k.A. 31 ja Monomer 14 46 21 19 0,2 24.649 26.544 (MALDI) ja Pentamer n.g. n.g. n.g. n.g. 3,5 CD Spektren, -Helix (%) -Faltblatt (%) -Schleife (%) random coil (%) -Bgtx-Bindung, KD (nM) n.g. n.g. n.g. n.g. n.g. ¨ ELISA / Immunprazipitation mAb 35-Bindung + n.g. / - + n.g. + + n.g. Tab. 5.2.: Vergleich von H--AChR4-208 mit den in der Literatur beschriebenen Expressionen von -AChR ex -Fragmenten; Verwendete Abkurzungen: i.b.: inclusion bodies, GPI: Glykophosphatidylinositol, +: positiv, -: negativ, n.g.: nicht getestet, k.A.: keine Angabe. ¨ (Hossann, 2001), 1 Tris-HCl-Puffer (pH 8), 2 PBS-Puffer (pH 7,3), 0,2% SDS, 3 H-AChR bindet -Bgtx um eine Großenordnung schwacher ¨ ¨ als T-AChR (Vincent et al., 1998). 69 70 5. Klonierung, Expression und Isolierung von H--AChR 4-208 Die Versuche der nativen Isolierung von H--AChRex -Fragmenten im Arbeitskreis schlug bisher fehl (Rousselle, 1996; Kreilinger, 2001). Die erfolgreiche Expression von His E0 -H--AChR4-181 konnte 1 zwar massenspektrometrisch nachgewiesen werden (Hossann, 2001), doch konnte das Fragment nicht ruckgefaltet werden. Das Fehlen des cys-loop bei den Aminosauren 192/193 wurde als mogliche Ur¨ ¨ ¨ sache diskutiert. Die bisher in der Literatur beschriebenen Expressionen von -AChR ex -Fragmenten in E.coli fuhrten jeweils zur Bildung von inclusion bodies, obwohl in allen Isolierungen der cys¨ loop vorlag. Tsouloufis et al. konnten dabei die gewunschten Fragemente nur in Konzentrationen um ¨ 40 µg/ml isolieren. Das uns von Schrattenholz zur Verfugung gestellte T-AChR 1-209 -Fragment war, ¨ entgegen der in der Literatur angegeben Konzentration von 10 mg/ml (Schrattenholz et al., 1998), nur bis Konzentrationen von 0,2 mg/ml stabil (Hossann, 2001). ¨ ¨ Da HisE0 -H--AChR4-208 nativ isoliert werden konnte, enthielt es alle Aminosauren, die fur die 1 korrekte Faltung des Proteins notwendig waren. Proteine falten sich aufgrund der Wechselwirkung einer kleinen Anzahl von Schlusselresten, um die sich die ubrige Struktur verdichtet (Fersht, 2000; ¨ ¨ Dobson, 2003). Bei Proteinen mit mehr als 100 Aminosauren erfolgt die Faltung uber Intermediate ¨ ¨ und auch unabhangig in einzelnen Domanen (Sanchez und Kiefhaber, 2003; Roder und Colon, 1997). ¨ ¨ Der Ausschluss von Wasser aus dem Kern des neu gefalteten Proteins ist der letzte Schritt der Faltung (Cheung et al., 2002). Bildung von Oligomeren Die Abtrennung hohermolekularer Verunreinigungen, durch die Verwendung von Amicon Ultra Kon¨ zentratoren mit einer Membran, die nur Proteine unter 30 kD durchließen, scheiterte. Ursache konnte ¨ die Bildung von Oligomeren des H--AChR4-208 gewesen sein. Die Bildung von Oligomeren bei T--AChR1-209 wurde bereits gezeigt (Hossann, 2001). Auch beim AChBP wurde eine Oligomerenbildung gefunden. Wurde es in Hefe rekombinant exprimiert und unter nativen Bedingungen chromatographisch untersucht, so eluierte es als losliches Protein mit einer Molekularmasse von ca. ¨ 160 kD (Smit et al., 2001). In der Rontgenstrukturanalyse zeigte sich die Bildung von Homopen¨ tameren (Brejc et al., 2001). Die Bildung von Homo- und Heteropentameren bei neuronalen AChR wurde sowohl in vivo, als auch in vitro gezeigt (Drisdel und Green, 2000; Green, 1999). Die native Faltung von H--AChR4-208 war erst durch die zusatzlichen Aminosauren moglich. Diese ¨ ¨ ¨ bilden in der Struktur des AChBP ein -Faltblatt (Brejc et al., 2001), welches moglicherweise bei der ¨ Ausbildung der oligomeren Struktur beteiligt ist. Durch intermolekulare Wechselwirkungen zwischen solchen Strukturen konnte die native Faltung des Proteins begunstigt werden. Strukturelle Monomere ¨ ¨ von oligomeren Proteinen besitzen in freier Form eine andere Struktur als im Gesamtprotein (Jaenicke und Rudolph, 1986; Bennett und Huber, 1984). Sie falten sich erst in Gegenwart der anderen Untereinheiten richtig. Dies liegt daran, dass sich die Umgebungen in beiden Formen stark unterscheiden konnen. Ein Abschirmung von hydrophoben Oberflachenstrukturen in oligomeren Proteinen erhoht ¨ ¨ ¨ deutlich deren Faltungseffizienz (Jaenicke und Rudolph, 1986). 71 6. Isolierung von His(T)-Gelonin1-246-H--AChR4-181 6 6.1. Aufgabenstellung Li gelang die Synthese eines Expressionsvektors fur ein His (T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 -Fus¨ 6 ionsprotein, sowie die anschließende Expression in E.coli und Aufreinigung durch klassische Chromatographiemethoden (Li, 2002). Das Protein lag nach der Expression in inclusion bodies vor und musste denaturierend aufgearbeitet werden. Bei der Ruckfaltung durch Verdunnung in Renaturier¨ ¨ ungspuffer aggregierten bis zu 90 % der Proteine und es kam zu erheblichen Proteinverlusten. Die Aufreinigung mit Großenausschluss- und Ionenaustauscherchromatographie ergab reines Protein, un¨ ter hohem materiellem Aufwand und Ausbeuteverlust. Die Klonierung der Information fur das Fusionsprotein in den kauflich erhaltlichen pET28a-Vektor ¨ ¨ ¨ (Fa. Novagen) fuhrte zu der Frage, warum der im Vektor kodierte N-terminale HisTag nicht zur ¨ Aufreinigung verwendet wurde. Dieser ermoglicht eine Isolierung mit Hilfe von Nickel-Affinitatschro¨ ¨ matographie. Daher sollte die Klonierungsstrategie von Li uberpruft werden. War der HisTag vorhan¨ ¨ den, sollte das Fusionsprotein mit Hilfe der Nickel-Affinitatschromatographie aufgereinigt, der HisTag ¨ abgespalten und das Protein mit Hilfe von SDS-PAGE, Western Blot, ELISA und Toxizitatstest ¨ charakterisiert werden. Das Fusionsprotein konnte aufgrund des Fehlens eines S2-Labors nicht exprimiert werden. Li gelang die Expression des Fusionsproteins mit dem Expressionsvektor pET-GA in BL21(DE3) Zellen, im Rahmen ihrer Dissertation an der Shanxi-University, Taiyuan, China. Zur Untersuchung der Isolationsmethode wurden uns die inclusion bodies und vorgereinigtes Fusionsprotein zur Verfugung ¨ gestellt. Li lysierte nach der Expression die Zellen durch Lysozym und mit Ultraschall. Sie trennte die inclusion bodies und Zelltrummer durch Zentrifugation von den loslichen Proteinen und ¨ ¨ wusch das Pellet mehrmals mit B-Per-Reagenz. Anschließend konnte sie die inclusion bodies in 6 M Guanidin-hydrochlorid, 20 mM Tris, 5 mM DTT, 2 mM EDTA, pH 8 losen und von den unloslichen ¨ ¨ Zelltrummern durch Zentrifugation abtrennen. ¨ 6.2. Untersuchung der Klonierungsstrategie von Li ¨ Der letzte Schritt der Klonierung des Fusionsproteins erfolgte durch Offnen eines kauflich erhaltlichen ¨ ¨ pET28a-Vektors (Fa. Novagen) und des Klonierungsvektors pGel-AChR, der die Information fur das ¨ 72 6. Isolierung von His(T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 6 pGelAChR (NdeI geschnitten): _NdeI_ TATGGGCCTGGATACCGTG... MetGlyLeuAspThrVal... - Fusionsprotein - pET 28a (NdeI geschnitten): _NcoI_ _NdeI_ ...ACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCATAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCA MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySer ---------------- HisTag --------------------------------pET-GA (ligiert): _NdeI_ ...CATCATAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGGCCTGGATACCGTGAGCTTCAGC... HisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHisMetGlyLeuAspThrValSerPheSer + Abb. 6.1.: Klonierung der DNA-Information fur das Fusionsprotein in den pET28a-Vektor uber ¨ ¨ die NdeI Schnittstelle. Dabei wurde die DNA-Sequenz f ur das Fusionsprotein C-Terminal an ¨ die DNA-Sequenz des HisTag in den Vektor pET28a einkloniert. Abb. 6.2.: Das His6 -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 -Fusionsprotein enthielt eine am CTerminus um 5 Aminosauren verkurzte Form von Gelonin (schwarz), welches an den N¨ ¨ Terminus eines Fragmentes des extrazellul aren Teils der -Untereinheit des nikotinischen AChR ¨ (weiß) gekoppelt wurde. Die Sequenz enthielt die MIR (WNPDDYGGVK). N-terminal wurde ein 6xHisTag fusioniert (schraffiert), der uber eine Schnittstelle fur Thrombin verfugte (Pfeil). Die ¨ ¨ ¨ 4 Aminosauren LSNN am C-Terminus gehoren zum Vektor (grau). ¨ ¨ (T ) Fusionsprotein enthielt. Dabei wurden die Restriktionsenzyme EcoRI und NdeI verwendet (Li, 2002). In Abb. 6.1 ist dieser Schritt fur die NdeI Schnittstelle dargestellt. Es war zu erkennen, dass die DNA¨ Information fur das Fusionsprotein C-terminal an die DNA-Sequenz fur den HisTag in den Vek¨ ¨ tor pET28a einkloniert wurde. Das exprimierte Protein sollte daher uber einen N-terminalen HisTag ¨ verfugen, der die Isolierung des Proteins mittels Nickel-Affinitatschromatographie ermoglichen wurde. ¨ ¨ ¨ ¨ Die im Anhang dargestellte Plasmidkarte (Abb. A.7) wurde auf Grundlage der Klonierungsinformation von Li erstellt und konnte nicht durch den Verdau des Vektors mit Hilfe von Restriktionsenzymen bestatigt werden. Das Projekt wurde als S2 eingestuft und es stand kein geeignetes S2¨ Labor zur Kultivierung von pET-GA in E.coli zur Verfugung. Die Primarsequenz des Fusionspro¨ ¨ teins ist schematisch in Abb. 6.2 dargestellt. Das H--AChR 4-181 -Fragment war an den C-Terminus des Gelonin1-246 -Fragmentes fusioniert. Die C-terminalen Aminosauren LSNN gehorten zum Vek¨ ¨ tor. Zur Aufreinigung des Fusionsproteins war ein N-terminaler HisTag mit 6 Histidin-Resten und einer Schnittstelle fur Thrombin fusioniert. Das H--AChR4-181 -Fragment enthielt die MIR, aller¨ dings fehlte der strukturbildende cys-loop, der die native Expression von H--AChR 4-208 ermoglichte ¨ (Kap. 5). 6.3. Isolierung 73 Abb. 6.3: Elutionsdiagramm einer Fusionsprotein-Isolierung aus den vorgereinigten inclusion bodies. Aufgezeichnet wurde die Absorbtion bei einer Wellenlange von 280 nm. - (1) De¨ naturierungspuffer zum Equilibrieren der Nickel-Affinitatssaule. (2) Pro¨¨ teinlosung. (3) Denaturierungspuffer ¨ zum Entfernen ungebundener Proteine. (4) Elutionspuffer zur Elution des Fusionsproteins. (5) Regenerierungspuffer. (6) Wasser zum Entfernen aller Pufferbestandteile. (7) 20 % Ethanol zum Lagern der Saule bei ¨ Raumtemperatur. 6.3. Isolierung 6.3.1. Aufreinigung des vorgereinigten Fusionsproteins Li reinigte die gelosten inclusion bodies durch Großenausschlusschromatographie an Sephacryl S¨ ¨ 200 Saulen. Die Fraktionen mit dem Fusionsprotein wurden uns von ihr zur weiteren Verarbeitung ¨ zur Verfugung gestellt. ¨ Vor dem Beladen der HiTrap Chelating Affinitatssaule, musste zum vorgereinigten Fusionsprotein ¨¨ festes Natriumchlorid und Imidazol zugegeben werden, dass eine Konzentration von 0,5 M bzw. 20 mM vorlag. Natriumchlorid unterdruckte die Ionenaustauschereigenschaften des Saulenmaterials, ¨ ¨ und das Imidazol verhinderte, in dieser Konzentration, die unspezifische Bindung eines Teils der Proteine. Die Proteinlosung wurde steril filtriert und auf die mit Nickel-Ionen beladene und mit De¨ naturierungspuffer (6 M Guanidin-hydrochlorid, 0,5 M Natriumchlorid, 20 mM Tris-HCl, 20 mM Imidazol, pH 8,0) equilibrierte HiTrap Chelating Affinitatssaule aufgetragen. Nachdem nicht gebundene ¨¨ Proteine mit Denaturierungspuffer von der Saule gewaschen wurden, konnte mit Imidazol-haltigem ¨ Elutionspuffer (6 M Guanidin-hydrochlorid, 0,5 M Natriumchlorid, 500 mM Tris-HCl, 20 mM Imidazol, pH 8,0) das Fusionsprotein von der Saule eluiert werden. Durch eine Proteinbestimmung wurde ¨ 74 6. Isolierung von His(T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 6 (a) (b) Abb. 6.4.: SDS-PAGE der Saulenfraktionen und zeitlicher Verlauf der Renaturierung - (a) ¨ SDS-PAGE (12 %iges Trenngel), Bahn 1: Proteinmarker, Bahn 2: Durchlauf (5 µg), Bahn 3: Eluat (15 µg), (b) Zeitlicher Verlauf der Ruckfaltung des Fusionsproteins. Die Konzentration ¨ entspricht den in loslicher Form vorliegenden Proteinen. ¨ festgestellt, dass alle Proteine quantitativ von der Saule eluiert werden konnten. Der Reinheitsgrad ¨ des eluierten Fusionsproteins wurde mit Hilfe einer SDS-PAGE uberpruft (Abb. 6.4(a)). Nur das ¨ ¨ gewunschte Fusionsprotein war in der Elutionsfraktion enthalten. ¨ 6.3.2. Ruckfaltung des Fusionsproteins ¨ Methode nach Li Da das Fusionsprotein unter denaturierenden Bedingungen aufgearbeitet werden musste, lag es nach der Isolierung in inaktiver, ungefalteter Form vor. Die Renaturierung erfolgte nach der Vorschrift von Li, bei der das gereinigte Fusionsprotein (ca. 0,5 - 1,5 mg/ml) durch Zugabe von Renaturierungspuffer I (20 mM Tris, 5 mM DTT, 2 mM EDTA, 2 mM GSH, 0,2 mM GSSG, pH 8) auf 100 µg/ml verdunnt, ¨ kurz gevortext und dann 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Die bei der Renaturierung ausgefallenen, falsch-gefalteten Proteinaggregate wurden bei 4.166 xg abzentrifugiert und es wurde ¨ das nativ gefaltete Protein im Uberstand mit einer Konzentration von ca. 10 µg/ml erhalten. Der Erfolg der Renaturierung zeigte sich im ELISA mit konformationsabhangigen mAb 35 und polyklonalen ¨ Anti-Gelonin Antikorpern (Tab. 6.1). ¨ 6.3. Isolierung 75 Renaturierungspuffer I (5 mM DTT) B Abs405nm ¨ mAb 35 Antikorper (native MIR, 1:4000) (T) His6 -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 0,399 ± 0,240 T-AChR 0,104 ± 0,071 BSA 0,036 ± 0,006 anti-Gelonin (polyklonal, 1:2000) His(T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 6 Gelonin BSA 0,272 ± 0,004 0,737 ± 0,058 0,083 ± 0,050 Renaturierungspuffer II (0 mM DTT) Abs405nm B + + - 0,430 ± 0,168 0,797 ± 0,400 0,046 ± 0,024 0,323 ± 0,013 0,496 ± 0,093 0,060 ± 0,047 + + - + + - + + - Tab. 6.1.: ELISA zum Vergleich der verschiedenen Renaturierungsmethoden durch Verwendung verschiedener Puffer; Renaturierungspuffer I (20 mM Tris, 5 mM DTT, 2 mM EDTA, 2 mM GSH, 0,2 mM GSSG, pH 8), Renaturierungspuffer II (20 mM Tris, 2 mM EDTA, 2 mM GSH, (T ) 0,2 mM GSSG, pH 8); His6 -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 (2 µg), T-AChR (5 µg), Gelonin (5 µg), Rinderserumalbumin (BSA, 5 µg), Abs 405nm : Absorbtion bei 405 nm, B: Bewertung. Ruckfaltung ohne DTT im Puffer ¨ Da bei der Ruckfaltung nur ca. 10 % des Fusionsproteins renaturiert werden konnten, sollte die Me¨ thode zur Verbesserung der Ausbeute optimiert werden. In einem ersten Versuch wurde die Renaturierung ohne DTT im Puffer durchgefuhrt. DTT ist in der Lage Disulfidbrucken im Protein zu ¨ ¨ reduzieren und wird daher bei der Ruckfaltung von Proteinen eingesetzt, die keine Disulfidbrucken ¨ ¨ in der nativen Form besitzen (Rudolph und Lilie, 1996). Bei Proteinen mit Disulfidbrucken, wie beim ¨ Fusionsprotein, sollte daher das System aus oxidiertem und reduziertem Glutathion (GSSG/GSH) zum Herstellen der richtigen Disulfidkombination im Protein ausreichen. Die Verdunnung des gereinigten Fusionsproteins mit Renaturierungspuffer II (20 mM Tris, 2 mM ED¨ TA, 2 mM GSH, 0,2 mM GSSG, pH 8) auf 100 µg/ml, Inkubation fur 24 Stunden bei Raumtemperatur ¨ ¨ und Zentrifugation, ergab eine Ausbeute des Fusionsproteins im Uberstand von 22-27 µg/ml. Der Erfolg der Renaturierung wurde im ELISA mit den konformationsabhangigen mAb 35 Antikorpern ¨ ¨ ersichtlich (Tab. 6.1). Die nach beiden Methoden ruckgefalteten Fusionsproteinproben zeigten eine ¨ deutlich positive Reaktion. Recycling der ausgefallenen Proteinaggregate Auch bei der verbesserten Renaturierungsmethode fielen noch 70-75 % des Fusionsproteins als falschgefaltete Aggregate aus. Diese wurden durch Zentrifugation vom nativ gefalteten Fusionsprotein abgetrennt und erneut in Denaturierungspuffer (5 M Guanidin-hydrochlorid, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M Natriumchlorid, pH 8,0) aufgenommen. Zum Auflosen der bei der Renaturierung gebildeten Disul¨ fidbrucken wurde von einer 1 M DTT-Stammlosung zugegeben, bis eine Konzentration von 30 mM ¨ ¨ 76 6. Isolierung von His(T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 6 Abb. 6.5.: ELISA des Fusionsproteins (FP) nach der Renaturierung in PBS-Puffer. Die verwendeten Antikorper wurden in einer Verdunnung von 1:1000 eingesetzt. Als Negativkontrolle ¨ ¨ wurde Rinderserumalbumin verwendet, alle Proben enthielten 5 µg Protein. erreicht war. Nach einer vierundzwanzigstundigen Inkubation bei Raumtemperatur unter leichtem ¨ Ruhren, war das Fusionsprotein denaturiert und konnte einer erneuten Ruckfaltung unterzogen wer¨ ¨ den. Das Recycling der ausgefallenen Proteinaggregate war zwei bis dreimal moglich. Danach ließen ¨ sich die Proteinaggregate nicht mehr losen. Bei der Renaturierung des nach dieser Methode wieder ¨ verwerteten Fusionsproteins wurde dieses in den gleichen Ausbeuten wie bei der ersten Renaturierung erhalten. Mit dem Einsatz dieser Methode ließ sich die Ausbeute an Fusionsprotein deutlich erhohen. ¨ Renaturierung des Fusionsproteins in PBS-Puffer Es sollte untersucht werden, ob das Fusionsprotein auch in physiologischem PBS-Puffer (130 mM Natriumchlorid, 4,5 mM di-Natriumhydrogenphosphat, 2,5 mM Natriumdihydrogenphosphat, pH 7,2) stabil war, um die Ratten bei der Therapie mit dem Fusionsprotein nicht ubermaßig zu belasten. ¨ ¨ Dazu wurde mit Nickel-Affinitatschromatographie aufgereinigtes Fusionsprotein in PBS-Renaturier¨ ungspuffer mit oxidiertem und reduziertem Glutathion (130 mM Natriumchlorid, 4,5 mM di-Natriumhydrogenphosphat, 2,5 mM Natriumdihydrogenphosphat, 4 mM GSH, 0,4 mM GSSG, pH 7,2) renaturiert. Die loslichen Proteine wurden von den falsch gefalteten Proteinaggregaten durch Zentrifuga¨ tion abgetrennt. Die Ausbeute an loslichem Protein betrug dabei 15 %. Die Losung konnte auf eine ¨ ¨ maximale Konzentration von 85 µg/ml aufkonzentriert werden. Bei Versuchen eine hohere Konzen¨ tration zu erreichen, kam es zu einem Verlust des großten Teils des Proteins. ¨ Die Charakterisierung des ruckgefalteten Proteins erfolgte mit einem ELISA, unter Verwendung von ¨ polyklonalen Anti-Gelonin, Anti-HisTag und mAb 35 Antikorpern (Abb. 6.5). Das Fusionsprotein ¨ zeigte nur mit den polyklonalen Anti-Gelonin Antikorpern eine deutlich positive Reaktion. Die Anti¨ HisTag Antikorper reagierten nur sehr schwach, wahrend die konformationsabhangigen mAb 35 An¨ ¨ ¨ 6.3. Isolierung 77 (a) (b) Abb. 6.6.: Isolierung und Charakterisierung des Fusionsproteins aus den inclusion bodies - (a) SDS-PAGE (10 %iges Trenngel) der Aufreinigung mit Nickel-Affinit atschromatographie; Bahn ¨ 1: Proteinmarker, Bahn 2: geloste inclusion bodies (40 µg), Bahn 3: Durchlauf (40 µg), Bahn ¨ 4: Waschfraktion mit 100 mM Imidazol (40 µg), Bahn 5: Elutionsfraktion mit 500 mM Imidazol (20 µg), (b) ELISA mit mAb 35 (1:500) und polyklonalen-anti-Gelonin Antik orpern (1:1000) ¨ zum Nachweis der nativen Struktur des Fusionsproteins (FP, 4 µg). Als Positivkontrolle diente T-AChR (mAb 35, 20 µg) bzw. naturliches Gelonin (polyklonale Anti-Gelonin Antik orper, 2 µg), ¨ ¨ als Negativkontrolle wurde BSA (10 µg) verwendet. tikorper gar nicht mit dem Fusionsprotein reagierten. Die MIR lag nicht richtig gefaltet vor, somit ¨ gelang eine Renaturierung in PBS-Puffer nicht. 6.3.3. Isolierung aus inclusion bodies Da die Verwendung einer Großenauschlusschromatographie zur Vorreinigung zeitaufwendig war, ¨ wurde untersucht, ob das Fusionsprotein auch direkt aus den inclusion bodies mit Hilfe der NickelIonen Affinitatschromatographie isoliert werden konnte. ¨ Dazu wurden die inclusion bodies in Denaturierungspuffer (5 M Guanidin-hydrochlorid, 0,5 M Natriumchlorid, 20 mM Tris-HCl, 20 mM Imidazol, pH 8) gelost und mit der Ultrazentrifuge zentrifugiert. ¨ ¨ Der Uberstand wurde direkt auf die mit Nickel-Ionen beladene und mit Denaturierungspuffer equilibrierte HiTrap Chelating Affinitatssaule aufgetragen. Nach dem Spulen der Saule mit Denaturier¨¨ ¨ ¨ ungspuffer zum Entfernen von ungebundenen Proteinen, wurden unspezifisch gebundene Proteine mit Waschpuffer (Denaturierungspuffer mit 100 mM Imidazol) eluiert. Das Fusionsprotein konnte anschließend mit Elutionspuffer (Denaturierungspuffer mit 500 mM Imidazol) von der Saule eluiert ¨ werden. Alle Fraktionen des Saulenganges wurden auf ein SDS-Gel aufgetragen (Abb. 6.6). Man erkannte ¨ deutlich den Erfolg der Isolierung. Wahrend im Durchlauf (Bahn 3) nahezu kein Fusionsprotein ¨ 78 6. Isolierung von His(T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 6 vorhanden war, fand es sich in der Wasch- und Elutionsfraktion. In der Waschfraktion befand sich allerdings neben dem Fusionsprotein noch eine große Menge weiterer Proteine. Die Elutionsfraktion enthielt das Fusionsprotein neben zwei niedermolekularen Verunreinigungen, die nicht abgetrennt werden konnten. Das so isolierte Fusionsprotein wurde direkt einer Renaturierung unterzogen und der Erfolg mit Hilfe eines ELISA bestimmt. Dabei zeigte die Fraktion mit dem Fusionsprotein sowohl mit den anti-Gelonin, als auch mit den mAb 35 Antikorpern eine stark positive Reaktion (Abb. 6.6(b)). ¨ Eine Aufkonzentration des Fusionsproteins bis auf 0,15 mg/ml war moglich. ¨ 6.4. Versuche zur Abspaltung des HisTag Wie HisT -Gelonin1-251 besaß das Fusionsprotein eine Schnittstelle fur Thrombin, um die Abspal¨ 6 tung des HisTag zu ermoglichen. Das frisch zuruckgefaltete und aufkonzentrierte Fusionsprotein ¨ ¨ (0,1 mg/ml) wurde dazu mit Thrombin (0,14 U) fur 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Trug ¨ man die Losung zusammen mit ungeschnittenem Fusionsprotein auf ein SDS-Gel auf, so war kein ¨ Masseunterschied zu erkennen (nicht gezeigt). Daraus konnte geschlossen werden, dass die Abspaltung nicht erfolgreich war. Da sich im Puffer nach der Renaturierung immer noch ca. 0,3 M Guanidinhydrochlorid befand, sollte dessen mogliche Hemmwirkung auf Thrombin mit einem Testprotein un¨ tersucht werden. 6.4.1. Einfluss von Guanidin-hydrochlorid auf Thrombin ¨ Als Testprotein eignete sich His T -Gelonin1-251 , da die benotigten Bedingungen zur Abspaltung des 6 HisTag bereits ermittelt waren (Kap. 4.5.2). Zur Untersuchung wurden jeweils 15 µg des rekombinanten Gelonins mit 56 mU Thrombin bei unterschiedlichen Guanidin-hydrochlorid-Konzentrationen ¨ im Puffer eingesetzt. Die Losungen wurden fur 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, die Pro¨ teine durch Trichloressigsaure gefallt und auf ein SDS-Gel aufgetragen. Die prozentuale Menge an ¨ ¨ geschnittenem Gelonin wurde durch densitometrische Analyse des SDS-Gels bestimmt (Abb. 6.7). Bis zu einer Konzentration von 250 mM Imidazol entfernte Thrombin ungehindert den HisTag von HisT -Gelonin1-251. Bei einer Konzentration von 1 M Guanidin-hydrochlorid wurden immer noch 6 knapp 37 % geschnitten. Da nach der Renaturierung das Fusionsprotein in Puffern mit Guanidinhydrochlorid-Konzentrationen unter 1 M vorlag, sollte zumindest ein Teil des Fusionsproteins geschnitten werden. Moglicherweise lag eine Mutation in der Erkennungssequenz von Thrombin im Protein vor. Aufgrund ¨ der Einstufung als S2-Projekt, war allerdings keine Sequenzierung des Expressionsvektors pET-GA moglich. Eine weitere Moglichkeit war die sterische Hinderung der Thrombin-Schnittstelle. Dies ¨ ¨ sollte in einem weiteren Versuch untersucht werden. 6.5. Charakterisierung 79 Abb. 6.7: Bestimmung der Hemmwirkung von Thrombin bei verschiedenen Guanidin-hydrochloridKonzentrationen im Reaktionspuffer. Die Werte wurden durch densitometrische Analyse des SDS-Gels bestimmt. Pro Bahn wurden 15 µg HisT -Gelonin1-251 aufgetragen. 6 ¨ 6.4.2. Bestimmung der sterischen Zuganglichkeit des HisTag Denaturiertes Fusionsprotein band an immobilisierte Nickel-Ionen. Da sich der HisTag nach einer Renaturierung nicht abspalten lies, lag dieser moglicherweise fur Thrombin unzuganglich vor. Daher ¨ ¨ ¨ sollte untersucht werden, ob der HisTag auch nach einer Renaturierung noch an, auf einer HiTrap Chelating Affinitatssaule, immobilisierten Nickel-Ionen binden konnte. Dazu wurde renaturiertes Fu¨¨ sionsprotein in Bindungspuffer (0,3 M Guanidin-hydrochlorid, 0,5 M Natriumchlorid, 100 mM Tris, pH 8) auf eine mit Nickel-Ionen beladene HiTrap-Chelating Affinitatssaule aufgetragen. Die Saule ¨¨ ¨ wurde nach dem Entfernen aller ungebundenen Proteine mit Elutionspuffer (Bindungspuffer mit 200 mM Imidazol) inkubiert. Die aufgefangenen Fraktionen wurden mit Lowry und SDS-PAGE untersucht. Nur eine geringe Proteinmenge band an die HiTrap Chelating Affinitatssaule. In der ent¨¨ sprechenden Fraktion war auf dem SDS-Gel kein Fusionsprotein zu erkennen. Wurde der Durchlauf durch die Saule untersucht, so befand es sich in dieser Fraktion (nicht gezeigt). ¨ Offensichtlich war der N-terminale HisTag im Fusionsprotein sterisch gehindert oder nicht an der Oberflache des Proteins lokalisiert. Dies war aufgrund seiner Polaritat erstaunlich. Im rekombinanten ¨ ¨ Gelonin, das den gleichen N-terminalen HisTag besaß, lag dieser in nativer Form zuganglich an der ¨ Oberflache des Proteins vor. Da der HisTag am Fusionsprotein nicht abgespalten werden konnte, ließ ¨ sich dessen Einfluss auf die Toxizitat des Fusionsproteins nicht bestimmen. ¨ 6.5. Charakterisierung 6.5.1. Western Blot Mit einem Western Blot sollte untersucht werden, ob die Bande bei ca. 51 kD auf dem SDS-Gel immunologisch als His T -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 -Fusionsprotein nachgewiesen werden kon6 nte. Dazu wurden die Proteine vom SDS-Gel durch Elektrophorese auf eine Nitrozellulose-Membran 80 6. Isolierung von His(T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 6 (a) (b) Abb. 6.8.: Charakterisierung des Fusionsproteins. (a) Western Blot des Fusionsproteins mit polyklonalen Anti-Gelonin-Antik orpern (1:1000), Bahn 1: SDS-PAGE (5 µg), Bahn 2: Western ¨ Blot (5 µg). (b) Toxizitatstest des Fusionsproteins im Vergleich mit nat urlichem und rekombi¨ ¨ nantem Gelonin (Gelonin1-251 ). Als Negativkontrolle diente Rinderserumalbumin. (IC100 = 1.981 cpm, IC50 = 991 cpm). ubertragen und die Membran mit polyklonalen Anti-Gelonin Antikorpern behandelt. In Abb. 6.8(a) ¨ ¨ ist die Farbung der ca. 51 kD großen Bande zu erkennen. Damit konnte diese eindeutig als His T ¨ 6 Gelonin1-246 -H--AChR4-181 -Fusionsprotein nachgewiesen werden. Ein Western Blot mit Anti-His Antikorpern schlug fehl. Die Antikorper reagierten nur sehr schwach mit dem Fusionsprotein (nicht ¨ ¨ gezeigt). Ein Western Blot mit mAb 35 Antikorpern gegen die -Untereinheit des AChR war nicht ¨ ¨ ¨ moglich, da diese konformationsabhangigen Antikorper nur die nativ gefaltete MIR erkennen. ¨ ¨ 6.5.2. Toxizitatstest Wie in Kap. 4.6.3 beschrieben, wurde ein Toxizitatstest mit dem Fusionsprotein durchgefuhrt. Nur ¨ ¨ wenn das Fusionsprotein toxische Eigenschaften besitzen wurde, ware ein Einsatz in der antigen¨ ¨ spezifischen Immunsuppression sinnvoll. Sollte sich das Fusionsprotein nicht toxisch genug zeigen, so musste in den in vivo Versuchen eine sehr hohe Dosis gegeben werden. ¨ ¨ Der Toxizitatstest wurde mit Konzentrationen von 1· 10 -7,5 bis 1· 10-12,5 mol/l durchgefuhrt. Dazu ¨ wurde eine Verdunnungsreihe mit 6 Proben angesetzt. Als Negativkontrolle diente Rinderserumalbu¨ min (BSA). Fur das Fusionsprotein konnte eine Toxizitat von 46 ng/ml ermittelt werden (Abb. 6.8(b)). ¨ ¨ Zum Vergleich sind die Messwerte von naturlichem und rekombinantem Gelonin eingezeichnet. Deut¨ lich erkennt man die geringere Toxizitat des Fusionsproteins. ¨ 6.6. Diskussion 81 6.6. Diskussion Isolierung Nach der Expression lag das Fusionsprotein in Form von unloslichen inclusion bodies vor. Diese ¨ wurden mit Hilfe von Guanidin-hydrochlorid gelost. Guanidin-hydrochlorid eignet sich besonders ¨ fur das Denaturieren von unloslichen Proteinaggregaten, da in konzentrierter Losung keine oder nur ¨ ¨ ¨ wenige Elemente der Sekundarstruktur ubrig bleiben (Tanford et al., 1966). Auf die Verwendung von ¨ ¨ Harnstoff als denaturierendes Mittel wurde aufgrund der moglichen, kovalenten Modifizierung von ¨ Amino- und Thiolgruppen in Proteinen verzichtet (Stark et al., 1960). Das Fusionsprotein ließ sich aus den gelosten inclusion bodies durch Nickel-Affinitatschromatogra¨ ¨ phie unter denaturierenden Bedingungen isolieren. Dazu wurde die HiTrap Chelating Affinitatssaule ¨¨ mit Nickel-Ionen beladen, mit Denaturierungspuffer equilibriert und die gelosten inclusion bodies di¨ rekt auf die Saule aufgetragen. Durch die Verwendung von Puffern mit steigender Imidazolkonzentra¨ tion konnte das Fusionsprotein erhalten werden. Dennoch ließ sich das Fusionsprotein nicht von allen Verunreinigungen abtrennen. Auf dem SDS-Gel konnten zwei niedermolekulare Proteine schwach detektiert werden. Mit Hilfe dieser Methode konnte His (T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 allerdings 6 in hoher Ausbeute isoliert werden. Durch Verwendung eines einzigen Saulenschritts konnte auch der ¨ Zeitaufwand im Vergleich mit der Methode von Li erheblich reduziert werden. Wurde eine Vorreinigung durch Großenausschlusschromatographie verwendet, dann traten keine sicht¨ baren Verunreinigungen auf dem SDS-Gel auf. Allerdings war dies mit einem großen materiellen Aufwand und Verlust an Fusionsprotein verbunden. Aufgrund der begrenzten, zur Verfugung stehen¨ den Menge an Fusionsprotein, wurde zur Isolierung auf die Nickel-Affinitatschromatographie direkt ¨ aus den gelosten inclusion bodies zuruckgegriffen und die Verunreinigungen toleriert. ¨ ¨ Ruckfaltung ¨ Das das Fusionsprotein unter denaturierenden Bedingungen isoliert werden musste, war eine Ruckfal¨ tung in die native Form notwendig. Eine Renaturierung des Fusionsproteins gelang bei Raumtemperatur durch eine Verdunnung mit Renaturierungspuffer auf eine Konzentration von 100 µg/ml. Durch ¨ den Verzicht von DTT im Renaturierungspuffer konnte die Ausbeute an Fusionsprotein deutlich erhoht werden. DTT ist in der Lage, Disulfidbrucken zu reduzieren und wird daher nur bei der Ruck¨ ¨ ¨ faltung von Proteinen ohne Disulfidbrucken in der nativen Struktur eingesetzt (Rudolph und Lilie, ¨ 1996). Die Ausbildung der richtigen Disulfidbrucken-Bindungen wurde durch ein System aus oxi¨ diertem und reduziertem Glutathion (GSSG/GSH) erreicht. Allerdings konnten pro Renaturierungsschritt nur ca. 25 % an Fusionsprotein in nativer Form isoliert werden. Die Verdunnung in Renaturierungspuffer geschah sehr schnell, um hohe lokale Proteinkonzentratio¨ nen zu vermeiden (Jaenicke und Rudolph, 1986). Es wurde gezeigt, das inaktive Aggregate partiell 82 6. Isolierung von His(T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 6 strukturiert sein konnen (Zettlmeissl et al., 1979). Kommt es bei der Renaturierung zu intermoleku¨ laren Wechselwirkungen zwischen solchen Strukturen, ware eine Aggregation des Proteins die Folge. ¨ Fur den extrazellularen Teil der -Untereinheit des nikotinischen AChR bestimmten West et al. ¨ ¨ einen -Faltblatt-Anteil von 51 % (West jr. et al., 1997). Ein Zusammenlagern dieses sekundaren ¨ Strukturmerkmals zu unloslichen Plaques, wie es fur Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson ¨ ¨ beschrieben wurde (Sunde und Blake, 1997; Dobson, 2003), konnte die Ausbildung von unloslichen, ¨ ¨ unvollstandig gefalteten Aggregaten bei der Renaturierung zur Folge haben und die Tendenz des Fu¨ sionsproteins zur Ausbildung von inclusion bodies bei der Expression erklaren. ¨ Bei der Ruckfaltung wurde trotz Optimierung der Methode immer noch ein Proteinverlust von bis zu ¨ 75 % durch Bildung von unloslichen Aggregaten beobachtet. Um den Proteinverlust zu minimieren, ¨ wurde eine Methode entwickelt, die falsch-gefalteten, unloslichen Proteinaggregate erneut zu dena¨ turieren und ruckzufalten. Dazu wurden die unloslichen Aggregate abzentrifugiert in einem dena¨ ¨ turierenden Puffer gelost und erneut renaturiert. Dies konnte bis zu dreimal durchgefuhrt und die ¨ ¨ Ausbeute an Fusionsprotein damit deutlich erhoht werden. ¨ Kontrolle der nativen Struktur Zur Kontrolle der nativen Struktur des H--AChR-Fragmentes im Fusionsprotein, wurden die konformationsabhangigen, monoklonalen Anti-MIR Antikorper mAb 35 eingesetzt. Diese Antikorper ¨ ¨ ¨ binden sehr schwach die denaturierte -Untereinheit von einigen Spezies, allerdings nicht die des humanen AChR (Tzartos et al., 1998; Tzartos et al., 1981). Daher eignete sich dieser Antikorper sehr gut ¨ zur Kontrolle der Proteinfaltung. Eine positive Reaktion zeigte das Vorliegen der nativen Struktur der MIR. Allerdings konnte uber andere Bereiche auf dem H--AChR-Fragment keine Aussage getroffen ¨ werden. Die korrekte Faltung des -AChR-Fragmentes im Fusionsprotein war uberraschend. Wurde ¨ das -AChR4-181 -Fragment allein exprimiert, so lag es ausschließlich in den inclusion bodies vor und konnte nicht renaturiert werden (Rousselle, 1996; Kreilinger, 2001). Die Fusion des -AChR 4-181 Fragments an Gelonin ermoglichte offensichtlich die native Faltung. Die Verbesserung der in vit¨ ro Faltung von Proteinen durch genetische Kombination mit einem hydrophilen Fusionspartner ist bekannt (Samuelsson et al., 1991). Hydrophile Peptidfragmente beeinflussen die Wasserloslichkeit ¨ von teilgefalteten Polypeptidketten und erhohen somit die Faltungseffizienz. Die richtige Faltung der ¨ MIR war aber von entscheidender Bedeutung, da nur dann ein Einsatz des Proteins im Tierversuch sinnvoll ist. Ziel des Fusionsproteins sind in vivo die autoreaktiven B-Lymphozyten, die fur die Sez¨ ernierung der autoreaktiven Anti-AChR Antikorper verantwortlich sind. ¨ Die Toxizitat des Fusionsproteins im in vitro Translationstest, sowie die positive Reaktion mit den ¨ polyklonalen Anti-Gelonin Antikorpern zeigte die korrekte Faltung des Gelonin-Fragmentes. ¨ Eine Moglichkeit die Bildung von unloslichen Proteinaggregaten bei der Renaturierung zu umge¨ ¨ hen, ware die Renaturierung des immobilisierten Fusionsproteins direkt auf der HiTrap Chelating ¨ Affinitatssaule gewesen (Colangeli et al., 1988). Doch durch die Bindungsexperimente des nativen ¨¨ 6.6. Diskussion 83 Fusionsproteins an die Nickel-Affinitatssaule konnte gezeigt werden, dass der HisTag im Fusionspro¨¨ tein nach der Ruckfaltung nicht mehr zuganglich war. Daher wurde auf eine Renaturierung direkt auf ¨ ¨ der Saule verzichtet. ¨ Faltung in physiologischem Kochsalzpuffer Beim in vivo Einsatz des Fusionsproteins ware die Verwendung einer physiologischen Kochsalzlo¨ ¨ sung bei der Applikation des Proteins wunschenswert. Ruckfaltungsexperimente in diesem Puffer ¨ ¨ schlugen allerdings fehl. Das Protein wurde nur zu 15 % in loslicher Form erhalten, wahrend der Rest ¨ ¨ als unlosliche Aggregate ausfiel. Die maximale Konzentration des Fusionsproteins betrug dabei nur ¨ bis zu 0,09 mg/ml. Außerdem zeigte es keine Reaktion mit den konformationsabhangigen mAb 35 ¨ Antikorpern. Daher wurde bei den in vivo Versuchen auf das mit Tris-haltigem Renaturierungspuffer ¨ ruckgefaltete Protein zuruckgegriffen (Kap. 8). ¨ ¨ Einfluss des HisTag Im Rahmen dieser Arbeit gelang es nicht, den HisTag vom Fusionsprotein abzuspalten. Guanidinhydrochlorid lag im Puffer in einer Konzentration vor, die Thrombin nicht hemmen konnte. Dies ¨ wurde anhand der Versuche mit HisT -Gelonin1-251 gezeigt. Eine mogliche sterische Hinderung kon6 nte durch die Bindungsversuche von renaturiertem Fusionsprotein an die Nickel-Affinitatssaule ge¨¨ zeigt werden. Aber auch eine Mutation in der DNA-Sequenz im Bereich der Thrombinschnittstelle, welche die Abspaltung des HisTag verhindern wurde, konnte nicht ausgeschlossen werden. Aufgrund ¨ der vergleichbaren Lage des N-terminalen HisTag, war, wie beim rekombinanten Gelonin, allerdings kein Einfluss auf die Toxizitat zu erwarten. ¨ ¨ Toxizitat Fur das Fusionsprotein wurde in einem in vitro Translationstest eine Toxizitat von 46 ng/ml be¨ ¨ stimmt. Wurde die aus der Aminosauresequenz berechnete Molekularmasse von 50.869 Da beruck¨ ¨ sichtigt, so betrug die Toxizitat 900 pM. Fur Gelonin 1-251 wurde ein IC50-Wert von 80 pM gemessen. ¨ ¨ Somit zeigte sich das rekombinante Gelonin um den Faktor 11 toxischer als das Fusionsprotein. Dies ließ sich durch die Betrachtung der Rontgenstruktur des zu Gelonin homologen RIP Ricin ¨ erklaren. Die Bindungstasche fur das Substrat liegt in der Nahe des C-Terminus (Abb. 1.9). Beim Fu¨ ¨ ¨ sionsprotein His(T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 wurde das Rezeptorfragment an den C-Terminus 6 des Gelonin-Fragmentes fusioniert. Moglicherweise uberdeckte das H--AChR4-181 -Fragment die ¨ ¨ Bindungstasche, was zu einer sterischen Hinderung fuhren wurde. Die Einfuhrung eines Protein¨ ¨ ¨ linkers aus hydrophilen Aminosauren konnte moglicherweise nicht nur die Toxizitat des Gelonin¨ ¨ ¨ ¨ ¨ ¨ Fragmentes, sondern auch die Antigenitat des H--AChR4-181 -Fragmentes erhohen. So fuhrte die ¨ Verwendung eines Linkers zwischen zwei Proteinfragmenten in einem Fusionsprotein zu einer erheblichen Bindungssteigerung an einen Rezeptor in vitro (Chandler et al., 1998). 84 6. Isolierung von His(T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 6 Faktor Literatur Fusionsproteine His(T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 6 hFGF-Saporin HBEGF-Saporin Chemisch gekoppelte Konjugate Gelonin-gp330 Gelonin-HRP RIP-Antikorper-Konjugate ¨ 11 10 23 1,1 1,2 35 (McDonald et al., 1996) (Chandler et al., 1998) (Misquith und Surolia, 1995) (Schafer, 1995) ¨ (Barbieri et al., 2000) Tab. 6.2.: Vergleich der Toxizitatsverluste von RIP in Fusionsproteinen - Der Faktor gibt den ¨ Toxizitatsverlust im Vergleich mit freiem Toxin an. ¨ Die niedrigere Toxizitat von Fusionsproteinen bzw. chemisch gekoppelten Konjugaten im Verglei¨ ch mit ungekoppeltem Toxin ist bekannt. Barbieri et. al. koppelten verschiedene RIP an Antikorper ¨ (Barbieri et al., 2000). Die Bedingungen wurden so gewahlt, dass ein Antikorpermolekul mit 1-2 ¨ ¨ ¨ RIP-Molekulen gekoppelt wurde. Dabei kam es zu einem mittleren Aktivitatsverlust um den Faktor ¨ ¨ 35. Als Ursache wurde von Barbieri et. al. sterische Hinderung des aktiven Zentrums diskutiert. Der Einsatz von RIP in Fusionsproteinen war in der Literatur bekannt (Chandler et al., 1998; Arora und Leppla, 1994; al Jaufy et al., 1994; McDonald et al., 1996). Chandler et al. klonierten zwei Fusionsproteine aus dem RIP Saporin und einem Heparin-bindenden epidermalen Wachstumsfaktor (HBEGF, engl.: heparin-binding epidermal growth factor), zum gezielten Ausschalten von Tumorzellen. Beide Proteine unterschieden sich nur durch die Verwendung, bzw. des Fehlens eines ¨ ¨ flexiblen Linkers von 22 Aminosauren zwischen beiden Domanen. Fur natives Saporin wurde eine ¨ Toxizitat von 7 pM bestimmt, wahrend die Fusionsproteine eine um den Faktor 23 niedrigere Tox¨ ¨ izitat von ca. 160 pM im zellfreien Assay besaßen. Der Linker zeigte dabei keinen Einfluss auf die ¨ Toxizitat. Wurden die beiden Proteine in der Zellkultur getestet, zeigte das Fusionsprotein mit vorhan¨ denem Linker eine großere Bindungsaffinitat gegenuber dem HBEGF-Rezeptor. Als Ursache wurde ¨ ¨ ¨ die sterische Hinderung, verursacht durch das Toxinfragment, bei der Bindung an den Rezeptor diskutiert. In vivo zeigte nur das Fusionsprotein mit Linker eine Hemmwirkung auf das Tumorwachstum. 85 7. Isolierung des AChR aus Torpedo californica 7.1. Aufgabenstellung Um die Induzierung der EAMG in Ratten zu ermoglichen, musste der komplette AChR aus dem ¨ elektrischen Organ des Zitterrochens Torpedo californica isoliert werden. Das spannungserzeugende elektrische Organ aus Fischen, wie z.B. dem Zitterrochen Torpedo californica, ist aus sog. Elektroplaques aufgebaut, die sich im Laufe der Evolution aus Muskelzellen entwickelt haben. Aufgrund ihres Reichtums an cholinergen postsynaptischen Membranen und des Fehlens eines kontraktilen Apparates kommt es zum Aufbau eines elektrischen Potentials von 150 mV pro Zelle. Die Reihenschaltung einer großen Anzahl solcher Zellen erlaubt die Bildung sehr hoher Spannungen. Aufgrund der großen Anzahl an T-AChR eignen sich diese Organe besonders zu dessen Isolierung. Im Arbeitskreis gelang Urbatsch die Isolierung mittels Dichtegradientenzentrifugation (Urbatsch, 1990). Grundlage der Isolation war ein Verfahren, das erstmals von Hertling-Jaweed beschrieben wurde (Hertling-Jaweed et al., 1988). Allerdings konnte der T-AChR nicht komplett von Verunreinigungen befreit werden. So trat bei 80-90kD im SDS-Gel eine Bande auf, die einer ATPase zugeordnet wurde. Sehnert setzte in einer Modifikation zusatzlich zur Dichtegradientenzentrifugation eine ¨ Affinitatschromatographie nach einem Verfahren von Mosckovitz ein (Sehnert, 1994; Mosckovitz und ¨ Gershoni, 1988). Der AChR besitzt eine hohe Bindungsaffinitat zu Schlangengiften wie -Bungaro- oder -Cobratoxin. ¨ Diese Gifte binden an den N-terminalen Teil der -Untereinheit und blockieren die Bindung des Neurotransmitters Acetylcholin. Bindet man -Cobratoxin kovalent an eine feste Matrix, eignet es sich zur Reinigung des AChR. Das Saulenmaterial war bis vor kurzem kauflich erhaltlich (Fa. Sigma). Es ¨ ¨ ¨ handelte sich um mit CNBr-aktivierter Sepharose, an die das 7 kD schwere -Cobratoxin gekoppelt war. Die Elution des immobilisierten Rezeptors von der Saule gelingt durch Carbamylcholin-haltigen ¨ Puffer. Aufgrund des Aufwands einer Dichtegradientenzentrifugation eliminierte Sehnert diese probeweise und konnte ebenfalls gereinigten Rezeptor isolieren. Auch nach langer Lagerung bei 4 C in 20 %iger ethanolischer Losung konnte das Saulenmaterial noch zur Isolierung von T-AChR verwen¨ ¨ det werden (Hossann, 2001). 86 7. Isolierung des AChR aus Torpedo californica Abb. 7.1: Elektrisches Organ des Zitterrochens Torpedo californica. Das EppendorfReaktionsgefaß dient als Großenvergleich. ¨ ¨ 7.2. Aufarbeitung des elektrischen Organs Das tiefgefrorene elektrische Organ (Abb. 7.1) wurde bei Raumtemperatur aufgetaut, zerkleinert und mit Puffer bei 4 C in einem Mixer bei maximaler Leistung homogenisiert. Zur Vermeidung von ¨ Uberhitzung wurde die Homogenisierung in kleinen Intervallen und mit großen Abstanden durchge¨ fuhrt. Durch die Filtration des Homogenisats uber ein Mulltuch konnten grobe Gewebestucke abge¨ ¨ ¨ trennt werden. Das Filtrat wurde anschließend fur sechzig Minuten bei 13.000 xg zentrifugiert und ¨ das erhaltene Pellet je nach verwendeter Isolationsmethode weiter verarbeitet. ¨ 7.3. Isolierung mit -Cobratoxin-Affinitatschromatographie 7.3.1. Durchfuhrung der Isolierung im Durchflussverfahren ¨ Das Pellet wurde in Cholat-haltigem Puffer unter Ultraschallbehandlung resuspendiert und fur 2 ¨ Stunden geschuttelt. Nach erneuter Zentrifugation befand sich der Rezeptor aufgrund des Natrium¨ ¨ ¨ cholat im Uberstand. Der Uberstand wurde direkt auf eine -Cobratoxin-Saule gegeben. Nach dem ¨ Spulen der Saule und 45 minutiger Inkubation, wurde der Rezeptor mit 1 mM Carbamylcholinchlorid¨ ¨ ¨ haltigem Puffer von der Saule eluiert. Eine zweite Fraktion an Rezeptor erhielt man nach 20 stundiger ¨ ¨ Inkubation der Saule im gleichen Puffer. Nach zweimaliger Dialyse gegen 5 l Dialysepuffer wurden ¨ beide Fraktionen durch SDS-PAGE und ELISA charakterisiert. Die Saule wurde anschließend mit ¨ verdunnter Essigsaure und Tris-gepufferter Kochsalzlosung regeneriert. ¨ ¨ ¨ Es konnten in der ersten Fraktion 0,9 und in der zweiten Fraktion 0,8 mg T-AChR aus 100 g elektrischem Organ isoliert werden. Beide Fraktionen zeigten im SDS-PAGE das erwartete Bandenmuster und reagierten im ELISA mit mAb 35 Antikorpern positiv (nicht gezeigt). ¨ Wahrend der chromatographischen Aufreinigung setzte sich das -Cobratoxin-Saulenmaterial lang¨ ¨ sam zu, bis kein Durchlauf mehr moglich war. Die Saule musste daraufhin neu gegossen werden. ¨ ¨ Moglicherweise war das Saulenmaterial aufgrund der nicht durchgefuhrten Vorreinigung der aufge¨ ¨ ¨ 7.3. Isolierung mit -Cobratoxin-Affinitatschromatographie ¨ 87 Abb. 7.2: Isolierung von TAChR im Batch-Verfahren - (a) SDS-PAGE (10 %iges Trenngel), Bahn 1: Proteinstandard, Bahn 2: T-AChR (30 µg). (b) ELISA mit mAb 35 Antikorpern ¨ (1:1000), Sekundarantikorper ¨ ¨ Anti-Ratte IgG-AP-Konjugat (1:1000), 1. und 2. Fraktion je 2 µg, Negativkontrolle: Rinderserumalbumin (20 µg). (a) (b) tragenen Proteinlosung zu stark verunreinigt. In weiteren Versuchen wurde uberpruft, ob das Saulen¨ ¨ ¨ ¨ material noch im Batch-Verfahren verwendet werden konnte. 7.3.2. Durchfuhrung der Isolierung im Batch-Verfahren ¨ Das Pellet wurde, wie oben beschrieben, unter Ultraschallbehandlung in Cholat-haltigem Puffer re¨ suspendiert. Nach der Zentrifugation wurde der Uberstand direkt zum -Cobratoxin-Saulenmateri¨ al gegeben. Um die Bindung des T-AChR zu ermoglichen, wurde die Suspension fur eine Stunde ¨ ¨ unter leichtem Schutteln inkubiert. Danach erfolgte eine Zentrifugation bei 4.170 xg. Die Zentrifu¨ gation bei 4.170 xg war zwar ausreichend um das Saulenmaterial im Pellet zu erhalten, allerdings ¨ ¨ zeigte sich dieses sehr labil. Der Uberstand musste sehr vorsichtig mit einer Pipette entfernt wer¨ den. Ein Dekantieren des Uberstands war nicht moglich. Das Saulenmaterial wurde nacheinander mit ¨ ¨ den Puffern A, B und C gewaschen. Anschließend wurde der Rezeptor mit 4 ml Puffer D eluiert. Zusatzlich wurde das Saulenmaterial mit Puffer D uber Nacht unter leichtem Schutteln inkubiert und ¨ ¨ ¨ ¨ eine 2. Fraktion erhalten. Beide Proteinfraktionen wurden nach der Elution sofort zweimal gegen 5 l Dialysepuffer dialysiert. Durch eine Proteinbestimmung wurde die Ausbeute an T-AChR bestimmt. In Fraktion 1 befanden ¨ sich 96 µg Protein, wahrend durch die Ubernachtinkubation 544 µg Protein isoliert werden konnte. ¨ Damit ergab sich eine Gesamtausbeute von 0,64 mg aus 100 g elektrischem Organ. Auf dem SDSPAGE zeigte sich das typische Bandenmuster des T-AChR (Abb. 7.2(a)). Durch die denaturierenden Bedingungen wurden die 4 Untereinheiten getrennt und als einzelne Banden bei 39 kDa (), 47 kDa (), 51 kDa () und 60 kDa () sichtbar. Bei 43 kDa war eine Verunreinigung sichtbar. Durch einen ELISA mit den konformationsabhangigen, Anti-MIR Antikorpern mAb 35 konnte in beiden Fraktio¨ ¨ nen der T-AChR immunologisch nachgewiesen werden (Abb. 7.2(b)). Beide Fraktionen zeigten eine 88 7. Isolierung des AChR aus Torpedo californica UE (a) MSDS (kDa) 39 47 51 60 Mkalk (kDa) 50,1 53,7 56,3 57,6 MMS (kDa) 53,0 56,5 62,9 65,3 (Sehnert, 1994) (Milosavljevic, 1998) (Hossann, 2001) Durchflussverfahren Batch-Verfahren (b) Ausbeute (mg) 4,3 3,7 4,3 1,7 0,64 Tab. 7.1.: Isolierung des T-AChR - Molekularmassen der Untereinheiten und Vergleich der Ausbeuten - (a) Molekularmassen der Untereinheiten des T-AChR - M SDS : aus dem SDS-Gel bestimmte Molekularmasse, Mkal k : aus der Aminosauresequenz berechnete Molekularmasse, ¨ MM S : durch Massenspektrometrie bestimmte Molekularmasse (Kasheverov et al., 1998). (b) Vergleich der Ausbeuten vergangener Isolierungen (pro 100 g elektrisches Organ). starke positive Reaktion im Vergleich mit der Negativkontrolle. 7.4. Diskussion Aus dem elektrischen Organ von Torpedo californica ließ sich T-AChR durch -Cobratoxin-Affinitatschromatographie isolieren. Sowohl die kontinuierliche Elution, als auch die Elution im Batch¨ Verfahren war erfolgreich. Allerdings zeigte das Saulenmaterial eine deutlich verringerte Bindungska¨ ¨ ¨ pazitat fur T-AChR, im Vergleich mit bereits durchgefuhrten Isolierungen. Wahrend mit der neuen ¨¨ Affinitatssaule aus 100 g elektrischem Organ ublicherweise bis zu 4,3 mg T-AChR isoliert wurden ¨¨ ¨ (Sehnert, 1994), nahm die Ausbeute nach Regenerierung und Lagerung des Saulenmaterials ab (Tab. ¨ 7.1(b)). Ein Ausbeuteverlust aufgrund der langen Lagerung des elektrischen Organs bei -80 °C konnte ausgeschlossen werden, da fur die Isolierung im Batch-Verfahren frisch erworbenes elektrisches ¨ Organ verwendet wurde. Die erfolgreiche Isolierung konnte durch das typische Bandenmuster auf dem SDS-Gel und durch die positive Reaktion mit mAb 35 Antikorper im ELISA gezeigt werden. Wurde die aus dem SDS-Gel ¨ bestimmten Molekularmassen der Untereinheiten mit den aus der Aminosauresequenz und Massen¨ spektrometrie bestimmten Molekularmassen verglichen, so zeigten sich die, aus der Literatur bekannten, Massendifferenzen (Utkin et al., 2000). Die Unterschiede lassen sich durch die unterschiedlich stark ausgepragte posttranslationale Modifizierung der Untereinheiten erklaren. So ist die elektro¨ ¨ phoretische Wanderung der Proteine abhangig vom Grad der posttranslationalen Modifizierung. Die ¨ 43 kD schwere Verunreinigung ist bekannt (Frail et al., 1988). Es handelt sich um Rapsyn (engl.: receptor associated protein of SYNapse), ein Protein, dass bei der Ausbildung der AChR-Cluster (Froehner et al., 1990) und deren Bindung an das Zytoskelett beteiligt ist (Apel et al., 1995). 89 8. Versuche zur antigenspezifischen Immunsuppression in vivo 8.1. Aufgabenstellung Wie bereits in der Problemstellung beschrieben, findet bei der Autoimmunerkrankung Myasthenia gravis nur eine Behandlung der Symptome statt. Eine spezifische, gegen die Ursache der Erkrankung gerichtete Therapie ist bis heute nicht bekannt. Spezifische, immunsuppressive Ansatze sind Gegen¨ stand der Forschung (Kap. 1.3). Im Arbeitskreis von Prof. Dr. W. E. Trommer gelang die Synthese eines chemisch gekoppelten T-AChR-Gelonin-Konjugats (Brust et al., 1987). Es konnte gezeigt werden, dass eine Gabe des Konjugats in vivo die Zahl der funktionsfahigen AChR deutlich steigerte (Urbatsch et al., 1993). Die ¨ Wirkungsweise war dabei antigenspezifisch, da das Immunsystem eine normale Reaktion gegen Kontrollantigene zeigte. Ein Anstieg des Antikorpertiters gegen den AChR, vermutlich ausgelost durch ¨ ¨ die Immunantwort gegen pathologisch irrelevante Teile des Rezeptors, konnten aufgrund der Verwendung des kompletten Rezeptors nicht verhindert werden. Li gelang die Synthese eines Expressionssystems fur ein gentechnisch gekoppeltes Fusionsprotein aus einem Gelonin 1-246 - und einem ¨ H--AChR4-181 -Fragment (Li, 2002). Im Rahmen dieser Arbeit konnte das Protein unter denaturierenden Bedingungen mit Hilfe der Nickel-Affinitatschromatographie isoliert werden (Kap. 6). Eine ¨ Renaturierung war moglich, nach der das Protein eine native Faltung der MIR und eine Toxizitat ¨ ¨ gegenuber eukaryontischen Ribosomen zeigte. ¨ Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine mogliche antigenspezifische, immunsuppressive Wirkung des ¨ Fusionsproteins in vivo untersucht werden. Dazu sollten weibliche Lewis-Ratten mit T-AChR immunisiert werden. Diese sollten EAMG ausbilden und das Vorliegen der Erkrankung durch repetitive Nervenstimulation (RNS) des Nervus ischiadicus nachgewiesen werden. Dazu sollten die Versuche in Homburg im Arbeitskreis von PD Dr. S Jung (Nervenklinik und Poliklinik, Neurologie, Universitatskliniken des Saarlandes) erlernt und danach in Kaiserslautern etabliert werden. Beim Vorliegen ¨ der Erkrankung sollte das Fusionsprotein den erkrankten Ratten appliziert und dessen Einfluss auf die Erkrankung untersucht werden. 90 8. Versuche zur antigenspezifischen Immunsuppression in vivo Abb. 8.1.: Verlauf der in vivo Versuche. Nach der ersten Immunisierung (Priming) mit T-AChR am 1. Tag wurde den Ratten eine zweimalige Auffrischung (Boost) appliziert (Tag 22 und 91). Am Tag 126 wurde der Erfolg der Immunisierung durch RNS getestet und anschließend die Therapie durch Gabe des Fusionsproteins (FP) gestartet. 8.2. Verlauf der Tierversuche Die Tierversuche wurden nach dem in Abb. 8.1 aufgefuhrten Schema durchgefuhrt. Nach der ersten ¨ ¨ Immunisierung (Priming) der Ratten mit T-AChR, sollte nach drei Wochen eine Auffrischungsinjektion (Boost) gegeben werden. Da die Ratten nach dem Boost keine Symptome der Erkrankung zeigten, wurde ein weiteres Mal geboostet. Am 126 ten Versuchstag wurde der Erfolg der Immunisierung durch RNS uberpruft. Nach der Therapie mit Fusionsprotein wurde dessen Wirkung auf die ¨ ¨ Erkrankung erneut durch RNS uberpruft. ¨ ¨ 8.2.1. Verwendete Ratten Fur die in vivo Versuche wurden 21 weibliche Lewis-Ratten (Fa. Charles River, Sulzfeld) verwendet. ¨ Bei Lieferung waren die Tiere 12 Wochen alt. Sie wurden in zwei Gruppen eingeteilt. 12 Ratten wurden zur Ausbildung von EAMG mit T-AChR immunisiert (Gruppe I), die restlichen 9 Ratten wurden nicht behandelt (Gruppe K) und dienten als Negativkontrolle. 8.2.2. Haltungsbedingungen Die Haltung der Ratten erfolgte im Tierhaus der Technischen Universitat Kaiserslautern. Zur Un¨ terscheidung der Tiere, wurden jeweils zwei Ratten in einem Kafig (ca. 21 x 38 x 17 cm) gehal¨ ten und eine durch eine Ohrmarke aus Metall gekennzeichnet. Nach der Lieferung akklimatisierten sich die Tiere fur eine Woche in ihrer neuen Umgebung, ohne dass Versuche durchgefuhrt wurden. ¨ ¨ Als Nahrung erhielten sie eine Standard-Diat fur Ratten und Mause (Fa. Atromin), sowie Wasser ¨¨ ¨ aus Trinkflaschen. Zur Kontrolle des Gesundheitszustands wurde in regelmaßigen Abstanden das ¨ ¨ Korpergewicht der Ratte uberpruft. ¨ ¨ ¨ 8.3. Immunisierung der Ratten 91 opt. Bew. + ++ +++ Beschreibung keine Symptome allgemeine Schwache bei Belastung ¨ Schwache, charakteristische Korperhaltung mit dem Kopf ¨ ¨ auf den Fußen ¨ Gewichtsverlust, Zittern, Gabe von Mestinon zur Stabilisierung erforderlich Tab. 8.1: Optische Bewertung (opt. Bew.) der myasthenen Symptome. 8.2.3. Bewertung der Erkrankung Die Bewertung der Erkrankung erfolgte optisch und durch repetitive Nervenstimulation. Wahrend ¨ bei der optischen Bewertung auf die typisch myasthenen Symptome, wie Korperhaltung, Schwache ¨ ¨ und Muskelzittern geachtet wurde (Tab. 8.1), erfolgte die Bewertung mittels RNS durch Auswertung von Elektromyogrammen (EMG), die durch eine repetitive Nervenstimulation erhalten wurden. Wird der Ischiasnerv bei einer gesunden Ratte repetitiv gereizt, so bleibt die detektierte Amplitudenhohe ¨ konstant. Bei myasthenen Ratten nimmt die Amplitude innerhalb den ersten Reizungen ab und pendelt sich dann auf einem konstanten Wert ein. Diese prozentuale Abnahme der Amplitudenhohe ist ein ¨ direktes Maß fur die Starke der Erkrankung und wird als Dekrement (D) bezeichnet. Ein Dekrement¨ ¨ wert uber 10 % wird als pathologisch eingestuft (Seybold et al., 1976; Thompson et al., 1992). ¨ 8.3. Immunisierung der Ratten Vor der Immunisierung der Ratten (Gruppe I) musste der T-AChR (Kap. 7) in einem geeigneten Puffer vorliegen. Dazu wurde die Proteinlosung gegen physiologischen PBS-Puffer dialysiert und an¨ schließend auf ca. 1 mg/ml aufkonzentriert. Zur ersten Immunisierung (Priming) wurden die Tiere mit 30 µg T-AChR und 20 µg Ovalbumin, emulgiert im 4 fachen Volumen kompletten Freund's Adjuvans (CFA), immunisiert. Danach wurde die Emulsion auf Raumtemperatur erwarmt und langsam ¨ intraperitoneal (i.p.) gespritzt. Ovalbumin diente als Kontrollantigen. Das Auffrischen (Boosten) erfolgte analog, allerdings wurde die Proteinlosung in inkomplettem Freund's Adjuvans emulgiert. ¨ 8.4. Elektrophysiologische Untersuchungen - Repetitive Nervenstimulation 8.4.1. Narkose Vor der Durchfuhrung der Versuche mussten die Ratten narkotisiert werden. Das fur die repetitive ¨ ¨ TM war nicht mehr erhaltlich. Daher wurde auf ¨ Nervenstimulation ubliche Narkosemittel Hypnorm ¨ 92 8. Versuche zur antigenspezifischen Immunsuppression in vivo (a) (b) Abb. 8.2.: Platzierung der Reiz- und Ableitungselektroden zur Messung der RNS am Ischiasnerv (Nervus ischiadicus). (RE) Reizelektroden. (AE) Ableitungselektroden. (M) Masse-Elektrode. Die EEG-Nadelelektroden wurden auch zur Fixierung der Ratte auf einer Styropor- bzw. Wachsplatte verwendet. 7 %ige Chloralhydrat-Losung als Narkosemittel zuruckgegriffen. Die Gabe erfolgte nach Korperge¨ ¨ ¨ wicht der Ratte (400 µg/kg) durch intraperitoneale Injektion. Die so behandelte Ratte wurde zum Einschlafen in einen ruhigen und dunklen Raum gebracht, da durch Stress die Wirkung des Narkosemittels beeintrachtigt werden konnte. Nach ca. 30 Minuten war die Ratte immobilisiert und konnte ver¨ ¨ messen werden. Ublicherweise schliefen die Ratten bis zu 4 Stunden und zeigten sich am folgenden Tag noch benommen. 8.4.2. Versuchsaufbau Fur die repetitive Nervenstimulation des Nervus ischiadicus wurde eine distale Stimulation gewahlt. ¨ ¨ Verwendung fanden EEG-Nadelelektroden (l = 1,2 cm, = 0,4 mm) der Firma Neurokard GmbH. Vor der Platzierung der Elektroden musste uberpruft werden, ob die Ratte vollstandig immobilisiert war. ¨ ¨ ¨ Durch einen Drucktest mit den Fingernageln in den Hinterlauf der Ratte konnte uberpruft werden, ¨ ¨ ¨ ob das Tier noch Reaktionen zeigte. War das der Fall, musste eine geringe Menge Chloralhydrat nachgespritzt werden. Die Platzierung der Elektroden am Hinterlauf erfolgte wie in Abb. 8.2 gezeigt. Zuerst wurden die Reizelektroden am Unterschenkel gesetzt, wobei die Nadeln durch die Muskulatur gesteckt und die Ratte auf einer Styropor- bzw. Wachsplatte fixiert wurde. Die Ableitelektroden wurden durch die Hinterhand gesteckt. Dabei war darauf zu achten, das sowohl die beiden Reiz-, als auch die beiden 8.4. Elektrophysiologische Untersuchungen - Repetitive Nervenstimulation 93 Ableitelektroden nahe zusammen saßen. Der Abstand der Reiz- und Ableitelektroden zueinander war ebenfalls ausschlaggebend. Je geringer der Abstand der Elektroden war, desto großer war das detek¨ tierte Ableitungssignal (nicht gezeigt). 8.4.3. Versuchsparameter Zur Reizung wurde ein Reizgerat verwendet, dass von der Elektronikwerkstatt der Technischen Uni¨ versitat Kaiserslautern angefertigt wurde. ¨ Die Reizung erfolgte mit dem in Abb. 8.3 schematisch dargestellten Pulssignal. Es wurden Frequenzen von 2, 4 und 10 Hz verwendet. Die Detektion erfolgte mit einem Oszilloskop, dessen Bild (EMG) elektronisch zur spateren Auswer¨ tung auf eine Diskette gespeichert werden konnte. Die Skalen der Achsen, der in dieser Arbeit dargestellten EMG, ist bei den jeweiligen Abbildungen in der Form Wert/div angegeben. Div entspricht dabei einem Kastchen im EMG. ¨ In ersten Vorversuchen, mit je einer Ratte aus beiden Gruppen, wurden die optimalen Einstellungen fur die Durchfuhrung der RNS getestet. ¨ ¨ Es stellte sich heraus, dass mit einer Pulshohe ¨ von 20 V und einer Pulsdauer von 0,2 ms die besten Ergebnisse bei den eingestellten Frequenzen von 1, 2, 4 und 10 Hz erhalten wurden. Die Absolutwerte der Amplituden im EMG zeigten eine starke Abhangigkeit von der Lage der Elek¨ troden (nicht gezeigt). Eine Berucksichtigung der ¨ Absolutwerte bei der Auswertung war daher nicht Abb. 8.3.: Schematische Darstellung von Puls (oben) und Antwort (unten) bei der repetitiven Nervenstimulation. t L : Latenzzeit. x = Pulsabstand in ms, x = 0,5 entspricht z.B. 2 Hz. moglich. Auch musste darauf geachtet werden, dass bei sehr nahe zusammen liegenden Elektroden ¨ ein Stuck Papier als Isolierung dazwischen gesteckt wurde. Die Folge war eine Reduzierung des ¨ Grundrauschens der abgeleiteten Signale im EMG. ¨ 8.4.3.1. Uberprufung des Pulssignals ¨ ¨ Das Ausgangssignal des Reizgerats wurde zur Uberprufung mit dem Oszilloskop detektiert. Getestet ¨ ¨ wurde mit einer Frequenz von 4 Hz, einer Pulsdauer von 0,2 ms und einer Pulshohe von 20 V. Dies ¨ 94 8. Versuche zur antigenspezifischen Immunsuppression in vivo (a) (b) Abb. 8.4.: Einfluss der Masse-Elektrode auf die Auswertung der RNS. (a) Messung des Grundsignals der Ableitelektrode ohne Reizung. Nach 5 s erfolgte die Zuschaltung der MasseElektrode. (b) Messung mit einer Frequenz von 4 Hz mit (schwarz) und ohne (grau) MasseElektrode. Mittelwerte der Amplituden: A mit = 368 ± 21 mV, Aohne = 360 ± 22 mV. entsprach den Bedingungen, die bei den durchgefuhrten Untersuchungen verwendet wurden. Die ¨ gemessene Amplitudenhohe betrug 20,0 ± 0,2 V mit einer Frequenz von 4,0 ± 0,1 Hz. ¨ 8.4.3.2. Einfluss einer Masse-Elektrode Bei der Demonstration der repetitiven Nervenstimulation in Homburg wurde zusatzlich zu den Reiz¨ und Ableitelektroden eine Masse-Elektrode an einem Hinterlauf der Ratte platziert. Deren Notwendigkeit wurde durch eine Versuchsreihe in Kaiserslautern uberpruft (Abb. 8.4). Durch das Zuschalten ¨ ¨ der Masse-Elektrode konnte das Grundrauschen von 149 ± 8 mV auf 63 ± 9 mV reduziert werden. Eine Auswirkung auf die repetitive Nervenstimulation wurde durch eine Stimulation mit 4 Hz untersucht. Die Auswertung der Amplitudenhohen zeigte, dass eine Masse-Elektrode nicht fur die ¨ ¨ Durchfuhrung der Messung notwendig war. Beide Messmethoden fuhrten zu vergleichbaren Werten. ¨ ¨ Wahrend die mittlere Amplitude mit Masse-Elektrode zu 368 ± 21 mV bestimmt wurde, ergab sich ¨ ohne Masse-Elektrode eine Amplitude von 360 ± 22 mV. Die Abweichung von 2,2 % war vernachlassigbar. Daher wurde bei den weiteren Versuchen auf eine Masse-Elektrode verzichtet, auch ¨ um die Belastung der Tiere so gering wie moglich zu halten. ¨ 8.4.3.3. Einfluss der Nadelposition ¨ Zur Uberprufung der Reproduzierbarkeit der Daten, wurden mehrere Ratten mit unterschiedlichen Po¨ sitionen der Reiz- und Ableitelektroden stimuliert und die erhaltenen Diagramme ausgewertet (Tab. 8.2). Es wurden je zwei Ratten der Gruppe I und K verwendet. Fur die Messung wurden 3 ver¨ schiedene Nadelpositionen pro Ratte untersucht und der Mittelwert von D berechnet. 8.4. Elektrophysiologische Untersuchungen - Repetitive Nervenstimulation 95 I8 D (%) 12 13 8 D (%) Ratte I9 K2 47 61 47 6 -4 2 K9 -11 -17 1 Tab. 8.2: Einfluss der Nadelposition bei der RNS. Durchgefuhrt wurden pro Ratte drei Mes¨ sungen mit unterschiedlichen Nadelpositionen. D: Mittelwert von D. 11 ± 3 51 ± 8 Frequenz (Hz) 10 10 4 4 4 2 1 ± 5 -9 ± 9 Tab. 8.3: Einfluss der Frequenz auf den Dekrementwert. Ratte I11 wurde mehrmals einer repetitiven Nervenstimulation bei verschiedenen Frequenzen unterzogen und die Dekrementwerte bestimmt. Der Mittelwert uber alle Messwerte betrug ¨ 59 ± 4 %. Messung 1 2 3 4 5 6 D (%) 62 60 60 52 64 55 8.4.3.4. Einfluss der Stimulationsfrequenz Eine Ratte der Kontrollgruppe K wurde einer repetitiven Nervenstimulation mit verschiedenen Frequenzen unterzogen. Bei einer Stimulationsfrequenz von 2 Hz waren die abgeleiteten Signale sehr gut aufgelost (Abb. 8.5(a)). Stimulierte man mit einer Frequenz von 4 Hz, so war diese Bedingung ¨ ¨ immer noch erfullt (Abb. 8.5(b)). Die Stimulation mit 10 Hz fuhrte zu einer Uberlagerung der Sig¨ ¨ nale im EMG (Abb. 8.5(c)). Die Messung war unter diesen Bedingungen nicht mehr auswertbar. In Abb. 8.5(d) ist ein Diagramm zu sehen, bei dem nach den ersten Signalen ein Dekrement vorzuliegen schien. Nach sechs Sekunden zeigte sich allerdings ein Anstieg der Signalamplituden. Dies ist mog¨ ¨ berlagerung der Signale zuruckzufuhren. Interessant war allerdings, dass eine licherweise auf die U ¨ ¨ weitere Messung bei 10 Hz bei einer anderen Ratte auswertbar war. Es zeigte sich bei Verwendung der gleichen Messparameter ein auswertbares Diagramm (Abb. 8.5(e)). Zur Entscheidung, ob eine Auswertung bei Stimulationen mit 10 Hz moglich war, musste eine Messung mindestens 10 Sekun¨ den dauern. Auf dies wurde allerdings mit Rucksicht auf die Tiere verzichtet. Die repetitive Nerven¨ stimulation wurde bei allen weiteren Versuchen mit einer Frequenz von 4 Hz durchgefuhrt. ¨ 8.4.4. Auswertung Fur die Berechnung des Dekrementwerts, war eine Auswertung der Amplituden notwendig. Der Wert ¨ berechnet sich durch die prozentuale Abnahme der Amplitude von der ersten zur vierten (Rubin et al., 2004), bzw. funften Antwort (Thompson et al., 1992). Bei der Messung stellte sich allerdings heraus, ¨ 96 8. Versuche zur antigenspezifischen Immunsuppression in vivo (a) (b) (c) (d) (e) Abb. 8.5.: Einfluss der Frequenz auf die Auswertbarkeit der RNS. Die Stimulation erfolgte mit einer Amplitude von 20 V und einer Pulsdauer von 0,2 ms. - (a) Stimulationsfrequenz von 2 Hz bei 2 s Messzeit. (b) Stimulationsfrequenz von 4 Hz bei 2 s Messzeit. (c) Stimulationsfrequenz von 10 Hz bei 2 s Messzeit. (d) Ratte K5: Stimulationsfrequenz von 10 Hz bei 20 s Messzeit. (e) Ratte I11: Stimulationsfrequenz von 10 Hz bei 10 s Messzeit. dass eine Auswertung des ersten Signals der RNS nicht immer moglich war (Abb. 8.6). Es zeigte ¨ sich, dass beim Starten der RNS durch das Reizgerat, haufig ein zu großes erstes Signal im EMG ¨¨ detektiert wurde. Wurden nur Einzelreizungen durchgefuhrt, waren die detektierten Signale immer ¨ im erwarteten Messbereich (nicht gezeigt). Das es sich bei diesem Signal um ein Artefakt handelte, wurde durch ein Vermessen der Signalabstande deutlich. War der Abstand zwischen dem ersten und ¨ zweiten Signal kleiner als bei den Folgesignalen, konnte vom Vorliegen eines Artefakts ausgegangen werden (Abb. 8.6(a) und 8.6(b)). Um einfacher entscheiden zu konnen, ob es sich beim ersten Signal der RNS um ein Artefakt han¨ delte, wurde bei jeder Messung vor der RNS mehrere Einzelpulse gemessen (Abb. 8.6(c)). Waren die Einzelsignale genauso groß wie das erste Signal der repetitiven Nervenstimulation, dann wurde aus diesen Werten der Mittelwert (A1S ) gebildet. Nach ca. 10 Stimulationen waren die gemessenen 8.4. Elektrophysiologische Untersuchungen - Repetitive Nervenstimulation 97 (a) (b) (c) Abb. 8.6.: Das erste Signal der RNS zeigte haufig eine starke Abweichung, moglicherweise ¨ ¨ ausgelost durch den Reizgenerator. Vermessen wurde eine gesunde Ratte der Kontrollgruppe ¨ (a) Hochauflosender Ausschnitt eines EMG. Das erste und zweite Signal lagen deutlich n aher, ¨ ¨ als die Folgesignale. (b) Messung der RNS uber 20 s. Erstes Signal zeigte eine deutlich zu hohe ¨ Amplitude. Der Abstand zwischen dem ersten und dem zweiten Signal war kleiner als bei den Folgesignalen. (c) Durch Messung zweier Einzelpulse vor der RNS konnte entschieden werden, ob das erste Signal der RNS durch ein Artefakt verf alscht wurde. ¨ Amplituden konstant. Aus mindestens 5 dieser Amplituden (A nS ) wurde der Mittelwert AnS berechnet und der Dekrementwert mit Formel 8.1 bestimmt. 1 D[%] = 100 - 00 · AnS A1S ( 8.1) Zeigte das erste Signal der RNS ein Artefakt, so wurden nur die Einzelpulse bei der Berechnung von A1S verwendet. 8.4.5. Versuche zur Bestimmung der Latenzzeit Zur Messung der Latenzzeit wurde sowohl das Ableitungs-, als auch das Reizsignal im Oszilloskop ¨ detektiert. Zur Vermeidung einer Uberlagerung der beiden Signale, wurde die Polaritat des Reizsig¨ nals umgedreht. Vermessen wurde die Ratte K2 mit 2 Hz. Detektiert wurde uber einen Bereich von ¨ 200 ms. Wie in Abb. 8.8 gezeigt, war in dieser Auflosung die Latenzzeit nicht bestimmbar. Das ¨ Ableitungssignal war im gleichen Augenblick wie das Pulssignal im EMG detektierbar. Wurde der Messbereich unter 200 ms verkleinert, um die Auflosung zu erhohen, waren beide Sig¨ ¨ nale nicht mehr detektierbar. Ursache war, dass das detektierte Signal auf dem Oszilloskop manuell eingefroren werden musste. Trotz zahlreicher Versuche konnte kein auswertbares Signal mit hoherer ¨ Auflosung detektiert werden. ¨ 98 8. Versuche zur antigenspezifischen Immunsuppression in vivo (a) (b) (c) (d) Abb. 8.7.: Beispiele fur Elektromyogramme bei der repetitiven Nervenstimulation - (a) Ratte ¨ K2: optisch keine Symptome, optimal auswertbar, Dekrement: 0 ± 4 %. (b) Ratte I6: optisch keine Symptome, Erster Peak der Messung durch Artefakt verf alscht, Dekrement: -1 ± 10 %. ¨ (c) Ratte I12: Optisch schwache Symptome erkennbar, optimal auswertbar, Dekrement: 24 ± 10 %. (a) Ratte I11: Optisch schwache Symptome erkennbar, optimal auswertbar, Dekrement: 59 ± 5 %. - Die Dekrementwerte geben die Mittelwerte mehrerer Messungen an. 8.4.6. Einfluss der RNS auf die Ratte Bei der Kontrolle der Korpergewichte fiel auf, dass die RNS belastend fur die Ratte war. In Abb. 8.9 ¨ ¨ sind die Korpergewichte der Kontrollratten vor und nach einer RNS dargestellt. Die Ratten die einer ¨ RNS unterzogen wurden, verloren innerhalb von 6 Tagen im Mittel 12 g ihres Korpergewichts, bevor ¨ sie sich wieder stabilisierten. Die Ratten die keiner RNS unterzogen wurden zeigten im gleichen Zeitraum keinen Gewichtsverlust. 8.5. Krankheitsverlauf 99 Abb. 8.8: Versuche zur Bestimmung der Latenzzeit tL . Messung einer RNS mit 2 Hz bei Ratte K2. Kanal 1: Ableitungssignal, Kanal 2: Reizsignal. Zur besseren ¨ Ubersichtlichkeit, wurde die Polarit at der ¨ Reizung umgedreht, damit es zu keiner ¨ Uberlagerung der beiden Signale kam. Abb. 8.9: Einfluss der RNS auf die Rattengewichte. Nur bei den Kontrollratten, die einer RNS unterzogen wurden, zeigte sich ein Gewichtsverlust in den Folgetagen. 8.5. Krankheitsverlauf Nach der Immunisierung der Ratten (Gruppe I) wurde der Krankheitsverlauf durch optische Bewertung und Messung des Korpergewichts kontrolliert. ¨ 8.5.1. Ratte I5 Sieben Tage nach dem Boost zeigte Ratte I5 myasthene Symptome. Bei Belastung kam es zu starkem Zittern der kompletten Korpermuskulatur, anschließend legte sich die Ratte mit dem Kopf auf den ¨ Fußen hin. Ein kontinuierlicher Gewichtsverlust von 20 % innerhalb von zwei Wochen zeigte die ¨ deutliche Verschlechterung des gesundheitlichen Zustands (Abb. 8.10(a)). Durch die orale Gabe von 0,3 mg Mestinon in 1,5 ml Wasser besserten sich die Symptome innerhalb weniger Minuten. Die Ratte bewegte sich schneller, das Zittern schwachte sich deutlich ab. Durch Gabe von Mestinon uber das ¨ ¨ Trinkwasser (50 mg/l) wurden die Symptome weitestgehend unterdruckt. Trotz regelmaßiger oraler ¨ ¨ Gabe von Mestinon konnte der Gewichtsverlust, abgesehen von einer leichten Steigerung am 36 ten Versuchstag, nicht gestoppt werden. Ab dem 42 ten Tag, nachdem die Ratte innerhalb von 21 Tagen 37 % ihres Gewichtes verloren hatte, kam es zu einem plotzlichen Anstieg des Gewichtes. Allerdings ¨ verstarb sie Tage spater. ¨ 100 8. Versuche zur antigenspezifischen Immunsuppression in vivo (a) (b) (c) (d) Abb. 8.10.: Gewichtskontrolle der Ratten - (a) Gewichtsverlauf der Ratte I5. Die Pfeile ohne Beschriftung zeigen den Zeitpunkt einer oralen Mestinon-Gabe. Die Ratte verstarb am 46 ten Versuchstag. (b) Gewichtsverlauf der Ratte I6. Die Ratte zeigte ab dem 52 ten Versuchstag myasthene Symptome und wurde mit Mestinon behandelt. Ab dem 120 ten Versuchstag wurde Mestinon abgesetzt. Bei der RNS zeigte die Ratte keinen pathologischen Dekrementwert. (c) Gewichtsverlauf der Ratten I2, I3 und I10. (d) Gewichtsverlauf der Ratten I4, I9 und I11. 8.5.2. Ratte I6 Nach der Immunisierung mit T-AChR zeigte Ratte I6 ab Tag 41 eine Gewichtsabnahme (Abb. 8.10(b)). Außerdem war eine allgemeine Schwache und Zittern bemerkbar. Die Ratte konnte nur schwer den ¨ Kopf anheben und das Kinn und die Ellbogen tendierten Richtung Boden. Unter Belastung verschlechterten sich die Symptome. Die Gabe von Mestinon war notwendig. Eine orale Gabe zeigte Wirkung und die Symptome besserten sich deutlich (opt. Bew.: +++). Durch die Gabe von 50 mg/l Mestinon uber das Trinkwasser ab Tag 52 kam es zu einer kontinuierlichen Gewichtszunahme und ¨ die myasthenen Symptome waren verschwunden. Mestinon konnte am 120 ten Versuchstag abgesetzt werden. Die myasthenen Symptome traten ab diesem Zeitpunkt nicht mehr auf. Bei der Kontrolle der 8.5. Krankheitsverlauf 101 Erkrankung durch RNS zeigte die Ratte einen Dekrementwert von -1 ± 10 %. Daher wurde die Ratte als gesund eingestuft (opt. Bewertung: -). 8.5.2.1. Ratte I2, I3 und I10 Nachdem die Ratten I5 und I6 nach dem ersten Boost bereits EAMG ausgebildet hatten, entwickelten die Ratten I2, I3 und I10 erst ein bis zwei Wochen nach dem zweiten Boost sehr starke myasthene Symptome. Nach einem erheblichen Gewichtsverlust von bis zu 57 g in drei Wochen, war ab Versuchstag 114 die Gabe von Mestinon notwendig (Abb. 8.10(c)). Der Gewichtsverlust wurde dadurch gestoppt (opt. Bew.: +++). Zwei Tage vor den elektrophysiologischen Untersuchungen wurde Mestinon abgesetzt, um die Messung zu ermoglichen. Am Tag der Messung zeigten sich erneut starke ¨ myasthene Symptome. Nach der Gabe von Chloralhydrat zum Immobilisieren verstarben alle drei Ratten bevor eine Messung moglich war. ¨ 8.5.3. Ratte I4, I7, I9, I11 und I12 Die Ratten I4, I7, I11 und I12 zeigten bis zur Kontrolle der Erkrankung am Versuchstag 126 keinen Gewichtsverlust. Allerdings waren deutliche myasthene Symptome, wie Schwache bei Belastung zu ¨ sehen. Die Gabe von Mestinon war allerdings nicht notwendig (opt. Bew.: ++). Bei der ersten RNS zeigten alle einen pathologischen Dekrementwert (Tab. 8.4). Die Ratte I9 verlor 18 Tage nach dem 2. Boost innerhalb von einer Woche 8 g Korpergewicht und ¨ zeigte sehr starke myasthene Symptome. Nach der Gabe von Mestinon uber das Trinkwasser stabil¨ isierte sich der Gesundheitszustand und die Ratte nahm wieder zu (opt. Bew.: +++). Zwei Tage vor der Krankheitskontrolle wurde das Mestinon abgesetzt. Ein gemessener Dekrementwert von 59 % bestatigte die optische Beurteilung. ¨ 8.5.4. Ratte I1, I6 und I8 ¨ Die Ratten I1, I6 und I8 zeigten auch nach dem 2. Boost nur eine allgemeine Schwache der Korper¨ muskulatur (opt. Bew.: +). Bei der Krankheitskontrolle zeigte keine der Ratten einen pathologischen Dekrement. 102 8. Versuche zur antigenspezifischen Immunsuppression in vivo 8.6. Therapie 8.6.1. Durchfuhrung ¨ Anhand der Ergebnisse der Krankheitskontrolle durch RNS wurden die Ratten in vier neue Gruppen eingeteilt. Die Ratten I4, I9 und I11 zeigten einen hohen Dekrementwert (> 45 %) und wurden der Therapiegruppe (Gruppe I-T) zugeteilt. Ihnen wurde das Fusionsprotein appliziert. Die Ratten I7 und I12 zeigten einen Dekrementwert, wurden allerdings nicht mit Fusionsprotein behandelt und dienten als Kontrolle (Gruppe I-D). Die restlichen Ratten der Gruppe I (I1, I6 und I8) zeigten keinen Dekrementwert und wurden der Gruppe I-O zugeteilt. Diese Ratten wurden weiter beobachtet und auf Symptome der EAMG kontrolliert. In Anlehnung an die Versuche von Urbatsch et al. (Urbatsch et al., 1993) wurde den Ratten der Gruppe I-T zweimal je 200 µg His(T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 Fusionsprotein i.p. gespritzt. Die Gabe 6 erfolgte im Abstand von einer Woche. Da das Fusionsprotein in einer Konzentration von 0,12 mg/ml vorlag, musste die Dosis an zwei aufeinander folgenden Tagen gegeben werden. Das maximale Volumen fur eine i.p. Injektion bei Ratten betragt zwar 10 ml pro kg Korpergewicht (Sharp und La Regina, ¨ ¨ ¨ 1998), allerdings sollten die Ratten nicht ubermaßig durch große Volumina belastet werden. ¨ ¨ 8.6.2. Therapiekontrolle durch optische Beobachtung Eine Woche nach der ersten i.p. Gabe von Fusionsprotein zeigten die Ratten I4 und I11 eine deutlich gesteigerte Aktivitat. Die Symptome der EAMG waren verschwunden und es war keine Schwache ¨ ¨ mehr bemerkbar (opt. Bew.: -). Ratte I9 zeigte sich immer noch schwach und bekam bis 4 Tage vor der zweiten RNS Mestinon uber das Trinkwasser. Das Verhalten und die hell-rosa farbigen Augen ließen ¨ eine Erblindung der Ratte vermuten. Ob dies im Zusammenhang mit der Therapie stand, konnte nicht gesagt werden. Nach dem Absetzen des Acetylcholinesterasehemmers konnte nur eine allgemeine Schwache beobachtet werden (opt. Bew.: +). Die Ratten der Gruppen I-O und I-D zeigten ebenso ¨ eine leichte Schwache (opt. Bew.: +). ¨ 8.6.3. Therapiekontrolle durch RNS Der Erfolg der Therapie wurde am 143 ten Versuchstag durch eine erneute RNS uberpruft. Die Ergeb¨ ¨ nisse sind in Tab. 8.4 und in Abb. 8.11 aufgefuhrt. Fur die Ratten der Gruppe I-0, die bei der Krank¨ ¨ heitskontrolle keine pathologischen Dekrementwerte zeigten, konnten jetzt pathologische Werte nachgewiesen werden. Die Ratten der Kontrollgruppe I-D zeigten eine deutliche Verringerung bei den Dekrementwerten. So reduzierte sich bei Ratte I7 der Dekrement von 52 auf 11 % und bei Ratte I12 von 24 auf 11 %. Beide Werte konnten allerdings noch als pathologisch eingestuft werden. Die Rat- 8.7. Diskussion 103 Ratte T-AChR FP vor Therapie opt. D (%) ++ ++ ++ +++ ++ + + + +++ +++ +++ +++ 2±2 0±4 -4±13 4±20 4±6 2±8 52±8 24±10 45±6 51±8 59±5 -5±4 -1±10 0±2 nach Therapie opt. D Bemerkung (%) + + + + + + -1±17 4±5 Gruppe K K1 nein nein K2 nein nein K6 nein nein K7 nein nein K8 nein nein K9 nein nein Gruppe I-D I7 ja nein I12 ja nein Gruppe I-T I4 ja ja I9 ja ja I11 ja ja Gruppe I-O I1 ja nein I6 ja nein I8 ja nein Gestorbene Ratten I2 ja nein I3 ja nein I5 ja nein I10 ja nein -7±15 11±7 11±5 0±4 3±9 -1±1 21±2 12±4 13±3 bei Narkose gestorben am 46 ten Tag gestorben bei Narkose gestorben bei Narkose gestorben ¨ Tab. 8.4.: Ubersicht uber die Ratten des in vivo Versuchs. Opt. Bew.: Optische Bewertung der ¨ myasthenen Symptome (Tab. 8.1). ten der Therapiegruppe I-T zeigten bei der Therapiekontrolle keinen pathologischen Dekrementwert (D < 3 %), wahrend sie bei der Krankheitskontrolle deutliche pathologische Dekrementwerte gezeigt ¨ hatten (D > 45 %). 8.7. Diskussion Vorteile und Nachteile des eingesetzten Fusionsproteins Wahrend bei den Versuchen von Urbatsch et al. keine komplette Abtrennung des ungekoppelten T¨ AChR vom chemisch gekoppelten Konjugat moglich war und so eine Reimmunisierung der Tiere ¨ mit ungekoppeltem T-AChR, bzw. Kreuzreaktionen gegen pathologisch irrelevante Teile nicht auszuschließen waren (Urbatsch et al., 1993), verfugte das von Li synthetisierte (Li, 2002) und in dieser Ar¨ beit durch Nickel-Affinitatchromatographie aufgereinigte und ruckgefaltete Fusionsprotein nur uber ¨ ¨ ¨ 104 8. Versuche zur antigenspezifischen Immunsuppression in vivo Abb. 8.11.: Ergebnisse der RNS vor und nach der Therapie mit dem Fusionsprotein. Der Schwellenwert von 10 % fur die Unterscheidung eines normalen von einem pathologischen ¨ Dekrement ist eingezeichnet. geringe Verunreinigungen. Außerdem war nur der fur EAMG hauptsachlich verantwortliche Bereich ¨ ¨ des AChR im AChR-Fragment enthalten. Es enthielt den extrazellulares Fragment der -Untereinheit, ¨ mit der hauptimmunogenen Region (MIR), an die der großte Teil der Autoantikorper im Blut myas¨ ¨ thener Patienten binden (Tzartos et al., 1988). Ein Nachteil des eingesetzten Fusionsproteins war der fusionierte HisTag. Eine Abspaltung war nicht moglich. Die stark polaren Reste konnten einen Ein¨ ¨ fluss auf das Immunsystem der Tiere haben. Eine gesteigerte Antwort des Immunsystems gegen das Protein ware die Folge. Ein Einsatz des Fusionsproteins uber einen langeren Zeitraum ware so nicht ¨ ¨ ¨ ¨ moglich. Gegen das Fusionsprotein gebildete Antikorper konnten zu dessen Komplexierung fuhren ¨ ¨ ¨ ¨ und die Halbwertszeit im Korper senken. Eine Gabe von immer hoheren Dosen bei der Therapie ware ¨ ¨ ¨ die notwendige Folge. Die Reduzierung der Immunogenitat und Erhohung der Halbwertszeit in vivo ¨ ¨ konnte durch Kopplung des Fusionsproteins mit Polyethylenglykol erreicht werden, wie es in der Lit¨ eratur bereits fur Antikorper und kleine Proteine beschrieben wurde (Kitamura et al., 1991; Chapman ¨ ¨ et al., 1999; Trakas und Tzartos, 2001). Induktion von EAMG Das Tiermodell von Myasthenia gravis konnte durch Immunisierung von weiblichen Lewis-Ratten mit T-AChR erfolgreich induziert werden. Allerdings reichte eine Auffrischung der Immunisierung mit T-AChR nicht aus. Ein zweiter Boost war notwendig, um deutlich sichtbare optische Symptome 8.7. Diskussion 105 in einem Großteil der Ratten (opt. Bew.: ++/+++ bei 75 bzw. +++ bei 42 %) zu induzieren. Diese Heterogenitat der Ausbildung von EAMG wurde auch von Kreilinger beobachtet (Kreilinger, 2001). ¨ Die Wahl des Rattenstamms war von entscheidender Bedeutung. So konnten Zoda und Krolick zeigen, dass nach der Immunisierung von verschiedenen Rattenstammen mit AChR große Unterschiede bei ¨ der Ausbildung von EAMG auftraten (Zoda und Krolick, 1993). Einige Rattenstamme zeigen sich ¨ immun gegen die Induzierung der EAMG. Der Vergleich des Wistar Furth mit dem Lewis Stamm zeigte, dass eine erhohte enzymatische Stickstoffmonoxid-Produktion moglicherweise fur die Re¨ ¨ ¨ sistenz gegenuber der EAMG-Induktion verantwortlich war (Garcia et al., 2003). Auch genetische ¨ Unterschiede werden zur Erklarung der unterschiedlichen Empfindlichkeit gegenuber der EAMG¨ ¨ Induktion angefuhrt (Christadoss et al., 1985; Bellone et al., 1991). Daher wurden fur die Ver¨ ¨ suche weibliche Lewis-Ratten verwendet, die bekannt fur die erfolgreiche Induktion der EAMG sind ¨ (Patrick et al., 1973; Seybold et al., 1976; Lindstrom et al., 1988; Christadoss, 1989). Repetitive Nervenstimulation Zum Nachweis der EAMG wurde die Methode der repetitiven Nervenstimulation etabliert. Bei dieser Methode wird ein Nerv (Ischiasnerv, Nervus ischiadicus) durch Nadelelektroden im Oberschenkel gereizt und das Ableitungssignal am Fuß der Ratte detektiert. Das Auftreten von Dekrementwerten > 10 % bei der repetitiven Nervenstimulation gilt als eindeutiger Nachweis der Myasthenie (Lennon et al., 1975; Thompson et al., 1992) und wird auch bei der Diagnose von Myasthenia gravis beim Menschen routinemaßig eingesetzt (Rubin et al., 2004). ¨ Eine Fixierung der Ratten durch die Elektroden auf einer Styropor- bzw. Wachsplatte war notwendig, um ein mogliches Auftreten von Bewegungsartefakten in der Ableitung zu verhindern (Rubin et al., ¨ 2004). Die Reizung fuhrte zu deutlich sichtbarer Muskelarbeit. Durch Untersuchung der Messpa¨ rameter wurden die optimalen Bedingungen fur die RNS herausgefunden. Bei der Durchfuhrung der ¨ ¨ Versuche war darauf zu achten, dass die Reiz- bzw. Ableitungsnadeln nahe zusammen saßen, um ein gut auswertbares EMG zu bekommen. Die Verwendung einer Masse-Elektrode war nicht notwendig. Zwar konnte das Grundrauschen deutlich reduziert werden, allerdings war kein Einfluss auf die Amplituden der im EMG detektierten Signale erkennbar. Um die Belastung der Tiere zu reduzieren, wurde auf die Verwendung einer Masse-Elektrode bei den Versuchen verzichtet. Um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu uberprufen, wurden Stimulationen bei verschiedenen ¨ ¨ Nadelpositionen durchgefuhrt. Es stellte sich heraus, dass die Nadelposition einen geringen Einfluss, ¨ auf die aus den EMG berechneten Dekrementwerte, besaß. Die Standardabweichung lag bei < 9 %. Bei Messungen, die mit einer konstanten Frequenz von 4 Hz, einer Pulshohe von 20 V und einer Puls¨ dauer von 0,2 ms durchgefuhrt wurden, waren ebenfalls Standardabweichungen bis zu 5 % vorhan¨ den. Und dies, obwohl die Nadelposition nicht variiert wurde. Aufgrund dieser Ergebnisse erfolgte die Ableitung der EMG bei der Krankheits- und Therapiekontrolle durch die Messung bei konstanten Messparametern und unterschiedlicher Nadelposition, um den geringen Einfluss der Nadelposition zu 106 8. Versuche zur antigenspezifischen Immunsuppression in vivo berucksichtigen. ¨ Bei der Messung wurde in vielen Fallen ein ubermaßig großes erstes Signal im EMG detektiert. Dies ¨ ¨ ¨ war auf ein Artefakt beim Einschalten des Reizgenerators zuruckzufuhren. Wurde eine Reihe von ¨ ¨ Einzelpulsen vermessen, so trat dies nicht auf. Da die Amplitude des ersten Signals fur die Auswer¨ tung des EMG und die Berechnung des Dekrements von entscheidender Bedeutung war, musste eine Methode entwickelt werden, zu entscheiden, ob es sich beim ersten Signal im EMG um ein Artefakt handelte. Zum einen konnte durch Ausmessen der Signalabstande eine Entscheidung getroffen ¨ werden. War der Abstand zwischen dem ersten und zweiten Signal kleiner, als bei den Folgesignalen, dann konnte vom Vorliegen eines Artefakts ausgegangen werden. Einfacher war allerdings das Vorschalten von Einzelpulsen. War das erste Signal großer als die Amplituden der Einzelpulse, konnte ¨ ebenfalls vom Vorliegen eines Artefakts ausgegangen werden. Die RNS war belastend fur die Ratte. Die vermessenen Kontrollratten der Gruppe K zeigten einen ¨ deutlichen Gewichtsverlust nach der RNS. Eine Gewichtszunahme wurde im Mittel erst nach 6 Tagen wieder beobachtet. Ursache dafur durfte die Narkose gewesen sein, da die Tiere auch einen Tag ¨¨ danach noch deutlich benommen waren. Eine direkte Auswirkung der RNS, z.B. durch die Schadi¨ gung der Muskulatur, wurde nicht beobachtet. Die Ratten konnten sich sofort nach dem Aufwachen aus der Narkose problemlos und ohne sichtbare Einschrankung bewegen. ¨ Narkose Zur Durchfuhrung der RNS mussten die Ratten vollstandig immobilisiert werden. Um dies zu errei¨ ¨ chen, wurde den Tieren Chloralhydrat i.p. gespritzt. Die Verwendung von Hypnorm ware allerdings ¨ Chloralhydrat vorzuziehen gewesen, war aber nicht moglich, da nicht mehr erhaltlich. Hypnorm war ¨ ¨ ein Kombinationspraparat mit den Wirkstoffen Fentanyl und Fluanison. Fluanison sediert die Ratte, ¨ wahrend Fentanyl schmerzlindernd wirkt (Sharp und La Regina, 1998). Chloralhydrat zahlt zu den ¨ ¨ leichten Betaubungsmitteln. Nach der i.p. Injektion ist die Ratte fur drei bis vier Stunden immobil¨ ¨ isiert, kann aber auf schmerzhafte Stimulation reagieren (Sharp und La Regina, 1998). Die behandelnde Tierarztin Frau Dr. Westermilies empfahl uns den Wirkstoff Propofol zur Narkose. Propofol ist ¨ ebenfalls ein leichtes Betaubungsmittel, das bei Hunden zur Durchfuhrung wenig schmerzhafter und ¨ ¨ kurzer Eingriffe verwendet wird. Allerdings hatte das Praparat i.v. gespritzt werden mussen, um eine ¨ ¨ ¨ Narkosedauer von bis zu 10 Minuten zu erreichen (Sharp und La Regina, 1998). Aufgrund der sehr kurzen Wirkdauer von Propofol, und da eine i.v. Gabe schwerer durchzufuhren ist als eine i.p. Gabe, ¨ wurde auf das einfacher zu handhabende Chloralhydrat bei den Versuchen zuruckgegriffen. ¨ Krankheitsverlauf Bei Ratten die starke myasthene Symptome in Verbindung mit Gewichtsverlust zeigten, war die Gabe von Mestinon uber das Trinkwasser notwendig. Dass sich bei diesen Ratten nach der Gabe von Mesti¨ non die Symptome deutlich besserten, war ein eindeutiger Hinweis auf das Vorliegen von EAMG. 8.7. Diskussion 107 Bei Menschen wird die Gabe von Acetylcholinesterasehemmern dazu verwendet, das Vorliegen von Myasthenia gravis zu diagnostizieren (Pascuzzi, 2001). Die Gabe des Mestinon musste kontinuierlich uber das Trinkwasser erfolgen, da nach oraler Verabreichung der Wirkstoff Pyridostigminbromid ¨ innerhalb von 24 Stunden uber Niere und Darm ausgeschieden wird (Husain et al., 1968). ¨ Bei Ratte I6 konnte bei der Krankheitskontrolle am Tag 126 kein pathologischer Dekrementwert gemessen werden. Der Wert von -1 ± 10 % ließ nicht auf eine ausgebrochene EAMG schließen. Dies war uberraschend, da sie ab Tag 41 die typischen, myasthenen Symptome zeigte (Seybold ¨ et al., 1976). Dass die Ratte zu diesem Zeitpunkt an EAMG erkrankt war, zeigte sich auch durch die Wirkung von Mestinon. Nach der Gabe uber das Trinkwasser zeigte sie keine Symptome mehr ¨ und nahm wieder an Gewicht zu. Ab Tag 120 war kein Mestinon mehr notwendig. Erst bei der Therapiekontrolle zeigte sich ein pathologischer Dekrementwert von 12 %. Die Ratten I4, I7 und I11 zeigten einen sehr hohen Dekrementwert (> 45 %) bei der Krankheitskontrolle, allerdings keine starken myasthenen Symptome (opt. Bew.: ++). Die Beobachtung, dass selbst bei hohen Dekrementwerten optisch keine myasthenen Symptome sichtbar sein mussen, zeigte Kreilinger bei ihren RNS¨ Untersuchungen an Ratten (Kreilinger, 2001). Lennon et al. zeigten, dass selbst bei einer Blockade von 60 % der AChR in Ratten, optisch keine Symptome der Schwache sichtbar werden mussen ¨ ¨ (Lennon et al., 1978). Therapie Das Fusionsprotein zeigte schon wenige Tage nach der ersten Gabe Wirkung bei den Ratten der Gruppe I-T. Zwei der drei Ratten wirkten lebhafter und zeigten keine sichtbaren Symptome mehr. Dies konnte bei der Therapiekontrolle eine Woche nach der zweiten Gabe von Fusionsprotein im EMG bestatigt werden. Beide Ratten wiesen keinen pathologischen Dekrementwert mehr auf. Die ¨ dritte Ratte zeigte noch eine allgemeine Schwache, allerdings war auch hier kein pathologischer ¨ ¨ Dekrementwert messbar. Daher wurden die Ratten als gesund eingestuft. Ob eine Uberwindung der EAMG erfolgt war, ließ sich durch die Kurze des Versuchs nicht uberprufen. In diesem Fall waren ¨ ¨ ¨ ¨ Langzeitstudien erforderlich. Im gleichen Zeitraum kam es bei den Ratten der Gruppe I-D, die nicht mit Fusionsprotein therapiert wurden, zu einer deutlichen Abnahme des Dekrementwertes. Allerdings waren die gemessenen Werte bei der Therapiekontrolle noch als pathologisch einzustufen. Die Ratten der Gruppe I-0 zeigten bei der Krankheitskontrolle keinen pathologischen Dekrementwert. Bei der Therapiekontrolle wurden sie erneut vermessen und bei allen drei Ratten war jetzt ein pathologischer Dekrementwert detektierbar. Moglicherweise setzte die Wirkung des 2. Boost erst spater bei diesen ¨ ¨ Ratten ein. Die sehr schnelle Genesung der Ratten der Gruppe I-T bzw. die Verbesserung der Dekrementwerte bei den Ratten der Gruppe I-D konnte durch die schnelle Wiederherstellung einer ausreichenden AChR¨ Zahl im synaptischen Spalt erklart werden. Im Verlauf der EAMG fanden Asher et al. eine spezifische ¨ Erhohung der mRNA-Level fur die -UE des AChR (Asher et al., 1993). Der Rezeptorverlust in ¨ ¨ 108 8. Versuche zur antigenspezifischen Immunsuppression in vivo der postsynaptischen Membran ware nach dem Ausschalten der autoreaktiven B-Lymphozyten bzw. ¨ Antikorper sehr schnell ausgeglichen. Dies wird auch bei Myasthenia gravis im Menschen beobachtet. ¨ Nach der Entfernung der Autoantikorper durch Plasmapherese oder der Gabe von IVIg besserten sich ¨ die Symptome der Patienten innerhalb kurzer Zeit (Dalakas, 1999; Pascuzzi, 2001). Der in vivo bzw. in vitro Einsatz von RIP zur Ausschaltung von spezifischen Zellen ist bekannt (Kap. 6.6) (Chandler et al., 1998; Arora und Leppla, 1994; al Jaufy et al., 1994; McDonald et al., 1996). Weiterhin wurden auch Proteine bakteriellen Ursprungs in Fusionsproteinen eingesetzt. Chaudhary et al. verwendeten ein Exotoxin-Fragment aus Pseudomonas, welches nach der Fusion mit rekombinantem humanen CD4 in vitro das selektive Abtoten von HIV-infizierten Zellen ermoglichte (Chaudhary ¨ ¨ et al., 1988). Der vielversprechende Ansatz wurde 1992 von Aullo et al. bestatigt (Aullo et al., 1992). ¨ Bei der Verwendung eines rekombinanten Fusionsproteins aus humanem CD4 und einem Fragment des Diptherie-Toxins konnten HIV-infizierte Zellen in vitro abgetotet werden. ¨ Fazit Eine eindeutige Aussage uber die Wirksamkeit des Fusionsproteins bei der antigenspezifischen Im¨ munsuppression der EAMG war mit diesen Ergebnissen nicht moglich. Als Ursache fur die klar ¨ ¨ nachgewiesene Genesung der therapierten Ratten konnten die folgenden Mechanismen diskutiert wer¨ den. 1. Das Fusionsprotein wirkte und fuhrte zu einer Immunsuppression. Dafur gibt es zwei mogliche ¨ ¨ ¨ Mechanismen. Eine Ausschaltung autoreaktiver B-Lymphozyten wurde die Produktion von ¨ autoreaktiven Antikorpern stoppen. Allerdings mussten alle Klone ausgeschaltet werden, um ¨ ¨ einen erneuten Ausbruch der Erkrankung zu verhindern. Neben der Ausschaltung der autoreaktiven B-Lymphozyten, ware auch eine Komplexierung durch pathogene Anti-AChR Antikorper ¨ ¨ moglich. Dies wurde die Immunreaktion gegen den AChR abstoppen, ohne allerdings die Ur¨ ¨ sache zu beheben (McIntosh et al., 1998). Dies konnte durch eine vorherige Plasmapherese ¨ verhindert werden. Die humoralen Komponenten des Immunsystems wurden entfernt werden, ¨ so dass das Fusionsprotein nicht Gefahr lauft, von den Antikorpern komplexiert zu werden. ¨ ¨ Eine Aussage, ob das Protein auf humoraler oder zellularer Ebene wirkt, konnte mit diesen Ver¨ suchen nicht uberpruft werden. Der Wirkmechanismus des Fusionsproteins muss daher durch ¨ ¨ in vitro Versuche an antigenspezifischen B-Lymphozyten uberpruft werden. Die antigenspez¨ ¨ ifische immunsuppressive Wirkung von Gelonin-T-AChR-Konjugaten wurden bereits in vivo von Urbatsch et al. gezeigt (Urbatsch et al., 1993). Die Gabe fuhrte zu einem Therapieerfolg, ¨ ohne die Immunreaktion gegen Kontrollantigene zu unterdrucken. ¨ 2. Eine weitere Erklarung fur das Ergebnis des in vivo Versuchs ware die spontane Genesung der ¨ ¨ ¨ Ratten. Dieses Phanomen ist bekannt und tritt bei schwacher Auspragung der akuten bzw. chro¨ ¨ nischen Phase der EAMG auf (Lindstrom et al., 1988; Lindstrom et al., 1998). Dagegen spricht allerdings, dass vor der Therapie 45 % der Tiere sehr starke myasthene Symptome zeigten. 8.7. Diskussion 109 Bei den Ratten der Gruppe I-D war auch bei der Therapiekontrolle noch ein pathologischer Dekrement nachweisbar. Die Ratten der Gruppe I-0 zeigten nur schwache myasthene Symptome, was sie zu optimalen Kandidaten fur die spontane Genesung gemacht hatte. Allerdings ¨ ¨ wurde bei ihnen eine Ausbildung der EAMG mit den pathologischen Dekrementwerten bei der Theapiekontrolle nachgewiesen und keine Remission beobachtet. Die Problematik der spontanen Remission bei Myasthenia gravis, wurde schon 1937 von Kennedy und Moersch erkannt. Sie vertraten die These, dass eine genaue Aussage, ob eine Therapie greift, oder eine spontane Remission beobachtet wurde, sehr schwer zu treffen sei (Kennedy und Moersch, 1937) Welche Ursache der Genesung zugrunde lag, muss durch weiterfuhrende Untersuchungen uberpruft ¨ ¨ ¨ werden. Als abschließende Aussage laßt sich allerdings sagen, dass durch das Fusionsprotein eine ¨ deutliche Verbesserung des Krankheitszustandes auftrat. Die Ratten I4 und I11 der Therapiegruppe zeigten keine Ansatze der Muskelschwache mehr und zeigten auch bei der Theraphiekontrolle keinen ¨ ¨ pathologischen Dekrementwert mehr. Dagegen zeigten die Ratten der Therapiekontrollgruppe I-D immer noch myasthene Symptome und einen pathologischen Dekrementwert. 110 8. Versuche zur antigenspezifischen Immunsuppression in vivo 111 9. Zusammenfassung 9.1. Chemische Deglykosylierung von naturlichem Gelonin ¨ Naturliches Gelonin, isoliert aus den Samen von Gelonium multiflorum, konnte mit Hilfe von Triflu¨ ormethansulfonsaure (TFMS) chemisch deglykosyliert werden. Aus einem SDS-Gel errechnete sich ¨ ein Masseverlust von 4,4 %, wie er auch in der Literatur gefunden wurde (Falasca et al., 1982). Es werden zwei mogliche Aminosauresequenzen fur naturliches Gelonin diskutiert (Nolan et al., 1993; ¨ ¨ ¨ ¨ Rosenblum et al., 1995). Unter Einbeziehung der Ergebnisse der Deglykosylierung und der massenspektrometrischen Untersuchungen von Daubenfeld (Daubenfeld, 2003), scheint die Aminosaurense¨ quenz von Nolan et al. im naturlichen Gelonin vorzuliegen. ¨ Durch Auswertung des Massenspektrums von naturlichem Gelonin (Hossann, 2001) konnte ein Vor¨ schlag fur ein mogliches Glykosylierungsmuster erstellt werden. So deckten sich die kalkulierten mit¨ ¨ tleren molekularen Massen sehr gut mit den im ESI-Massenspektrum gefundenen Massen, wenn eine Glykosilierung von GlcNAc2 Manx Xyl1 (x = 2-5) angenommen wurde. Dieses Glykosylierungsmuster enthalt die Kern-Struktur des paucimannosidischen Typs. Glykoproteine dieses Typs kommen unter ¨ anderem in Pflanzensamen vor (Lerouge et al., 1998). 9.2. Expression und Isolierung von rekombinantem Gelonin Unter Verwendung des Expressionsvektors pET-gel konnte rekombinantes Gelonin in hohen Ausbeuten und Reinheit aus E.coli isoliert werden. Dazu wurde das Expressionsplasmid in kompetente BL21(DE3) Zellen transformiert, in LBK-Medium kultiviert und das Protein exprimiert. Die Lyse der Zellen erfolgte nach Inkubation mit Lysozym und durch Ultraschall. Das Zelllysat konnte nach einem Ultrazentrifugationsschritt direkt auf die Nickel-Affinitatssaule aufgetragen werden und His T ¨¨ 6 ¨ ¨ Gelonin1-251 durch eine schrittweise Erhohung der Imidazolkonzentration vom großten Teil der Verunreinigungen abgetrennt werden. Mit 500 mM Imidazol im Puffer gelang die Elution von der Saule. Es wurden ca. 2,4 mg Protein aus 1 l Schuttelkultur erhalten. ¨ ¨ Eine zweite Moglichkeit zur Isolierung bestand durch die direkte Abspaltung des HisTag auf der ¨ Saule. Der großte Teil der unspezifisch gebundenen Proteine konnte mit Imidazol-haltigem Wasch¨ ¨ puffer von der Saule gewaschen werden. Zur Elution von Gelonin1-251 wurden die gebundenen Pro¨ teine mit Thrombin inkubiert, der HisTag abgespalten und das Protein spezifisch eluiert. Die Methode 112 9. Zusammenfassung Isolationsmethode Ionenaustauscher (Li, 2002) Ionenaustauscher (Buttner, 2002) ¨ Nickel-Affinitatschromatographie (Elution mit Imidazol) ¨ Nickel-Affinitatschromatographie (Elution mit Thrombin) ¨ Reinheit (%) n.b. 92 95 99 Ausbeute (mg/l) n.b. 1,6 2,4 2,6 ¨ Toxizitat (pM) 1150 100 80 n.b. Tab. 9.1.: Vergleich der Reinheit, Ausbeute und Toxizit at der Isolierung von rekombinantem ¨ Gelonin bei verschiedenen Isolationsmethoden. Die Reinheit wurde durch densitometrische Analyse der SDS-Gele bestimmt. Ausbeute in mg pro l Sch uttelkultur; n.b. : nicht bestimmt, ¨ bei abgespaltenem HisTag. fuhrte zu großerer Reinheit des isolierten Proteins (Tab. 9.1). Die Ausbeute an reinem Protein betrug ¨ ¨ 2,6 mg aus 1 l Schuttelkultur. Da Thrombin durch 0,5 M Natriumchlorid gehemmt wird, musste die ¨ doppelte Menge zur Abspaltung des HisTag verwendet werden. Durch ESI-FT-MS konnte HisT -Gelonin1-251 als 30.512 Da bzw. 30.334 Da schweres Protein identi6 fiziert werden. Die Masse von 30.512 Da stimmte mit der berechneten Molekularmasse von 30.496 Da uberein, wenn eine Oxidation eines Schwefelatoms (+16 Da) im Protein angenommen wurde. Die ¨ Masse von 30.334 Da entsprach HisT -Gelonin1-251 bei abgespaltenem Formyl-Methionin. 6 ¨ Im ELISA und Western Blot zeigte HisT -Gelonin1-251 mit polyklonalen Anti-Gelonin Antikorpern 6 eine, mit naturlichem Gelonin, vergleichbare Reaktivitat. Somit konnte vom Vorliegen einer nativen ¨ ¨ Struktur ausgegangen werden. Deutlich gezeigt werden konnte die Immunogenitat des HisTag beim ¨ Test mit polyklonalen Anti-Gelonin Antikorpern. Bei gleicher eingesetzter Proteinmenge zeigte His T ¨ 6 Gelonin1-251 eine deutlich positivere Reaktion als Gelonin 1-251. ¨ In einem in vitro Translationstest zeigte sich Gelonin 1-251 um den Faktor 2 toxischer als naturliches Gelonin. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der HisTag keinen Einfluss auf die Toxizitat des ¨ Proteins besitzt. 9.3. Klonierung, Expression und Isolierung von H--AChR4-208 Mit Hilfe von synthetischen Oligonukleotiden gelang die Synthese des Expressionsvektors fur H-¨ AChR4-208 . Aus zwei Olikonukleotiden wurde eine 100 bp Box synthetisiert, welche die Sequenz fur H--AChR182-208 enthielt. Nach der Umklonierung der DNA-Sequenz fur H--AChR4-181 in ¨ ¨ den Klonierungsvektor pBDH-VU1, wurde der erhaltene Vektor erneut mit Restriktionsenzymen geoffnet, die 100 bp-Box eingebaut und mit T4-DNA Ligase ligiert. Das Vorliegen der richtigen DNA¨ Sequenz fur H--AChR4-208 wurde dabei durch Sequenzierung eines Teils des Klonierungsvektors ¨ pUCHE706ext nachgewiesen. Nach der Umklonierung der DNA-Sequenz fur H--AChR4-208 in ¨ einen Expressionsvektor wurde pHE706ext erhalten. Der Expressionsvektor verfugte uber einen N¨ ¨ terminalen HisTag mit 10 Histidinresten und einer Schnittstelle fur Enterokinase. ¨ 9.4. Isolierung von His(T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 6 113 Nach der Expression in E.coli und der Lyse der Zellen durch Lysozym und mit Ultraschall, fand sich das exprimierte Protein nicht wie erwartet in den inclusion bodies, sondern als losliches, na¨ tiv gefaltetes Protein im Zelluberstand. Dies ließ sich durch die deutlich positive Reaktion mit den ¨ konformationsabhangigen Anti-MIR Antikorpern mAb 35 nachweisen. Eine Isolierung uber Nickel¨ ¨ ¨ ¨ Affinitatschromatographie fuhrte aber nicht zu sauberem H--AChR4-208 . Wahrend bei der Isolierung ¨ ¨ durch die schrittweise Elution mit Imidazol in der 500 mM-Fraktion noch eine große Zahl von unspezifisch gebundenen Proteinen vorhanden war, war die Elution durch Enterokinase erfolgreicher. Allerdings zeigten sich auf einem SDS-Gel noch zwei weitere Proteine neben H--AChR4-208 . Um hohermolekulare Verunreinigungen abzutrennen, wurde H--AChR4-208 durch eine Membran ¨ mit einem Ausschlussvolumen von 30 kD zentrifugiert. Allerdings passierte das 24 kD schwere Protein nicht die Membran. Daher wurde eine Oligomerenbildung diskutiert, wie es auch bei anderen exprimierten -AChRex -Fragmenten gefunden wurde. Im Rahmen dieser Arbeit war keine Optimierung der Isolierungsmethode mehr moglich. ¨ Die Charakterisierung des exprimierten Proteins war nur durch ELISA und Molekularmassenbestimmung der SDS-PAGE Fraktionen moglich. Ein Western Blot mit Anti-HisTag Antikorpern war ¨ ¨ nicht erfolgreich. Wahrend die Antikorper im ELISA mit der 500 mM-Imidazol, bzw. Enterokinase¨ ¨ Fraktion der Nickel-Affinitatschromatographie, deutlich positiv reagierten, zeigten sie im Western ¨ Blot keine eindeutige Reaktion. 9.4. Isolierung von His(T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 6 Mit Hilfe der Nickel-Affinitatschromatographie gelang die Isolierung des His (T) -Gelonin1-246 -H¨ 6 -AChR4-181 Fusionsproteins. Eine direkte Isolierung uber Nickel-Affinitatschromatographie nach ¨ ¨ dem Losen der inclusion bodies in denaturierendem Puffer war moglich. Da das Fusionsprotein de¨ ¨ naturierend aufgearbeitet wurde, musste es renaturiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Ruckfaltungsmethode von Li deutlich optimiert werden. Durch die Ruckfaltung ohne DTT im Puffer ¨ ¨ erhohte sich die Ausbeute von 10 auf bis zu 27 %. Die bei der Ruckfaltung ausgefallenen, falsch¨ ¨ gefalteten Aggregate konnten wieder in denaturierendem Puffer aufgelost und erneut renaturiert wer¨ den. Durch diese Recycling-Methode konnte die Ausbeute noch einmal erhoht werden. Nach der ¨ Ruckfaltung konnte das Fusionsprotein bis auf Konzentrationen von 0,15 mg/ml aufkonzentriert wer¨ den. Das Fusionsprotein wurde durch SDS-PAGE, ELISA, Western Blot und einen in vitro Translationstest charakterisiert. Es zeigte sich, dass im renaturierten Protein das H--AChR4-181 -Fragment nativ gefaltet vorlag. Dies war uberraschend, da die Expression und Isolation des H--AChR 4-181 ¨ Fragments ohne Gelonin als Fusionspartner bisher nicht zu nativem Protein fuhrte. Die korrekte Fal¨ tung der MIR wurde durch die Bindung von konformationsabhangigen Anti-MIR Antikorper gezeigt. ¨ ¨ 114 9. Zusammenfassung In einem Toxizitatstest zeigte sich die richtige Faltung des Gelonin 1-246 -Fragments. Das Fusionspro¨ tein war um den Faktor 11 weniger toxisch als das rekombinante Gelonin. Dies ließe sich durch eine sterische Hinderung des aktiven Zentrums des Gelonin-Fragments durch das AChR-Fragment erklaren. ¨ Der HisTag war nicht abspaltbar und somit der Einfluss auf die Toxizitat nicht bestimmbar. Ursache ¨ konnte eine sterische Hinderung der Thrombin-Schnittstelle gewesen sein, da ruckgefaltetes Fusions¨ ¨ protein nicht mehr an immobiliserte Nickel-Ionen band. Eine Ruckfaltung in physiologischem PBS-Puffer fuhrte nicht zum Erfolg. Das Fusionsprotein zeigte ¨ ¨ nach der Renaturierung keine Reaktion mit den konformationsabhangigen Anti-MIR Antikorpern. ¨ ¨ Außerdem aggregierte es bei Konzentrationen uber 90 µg/ml. Daher wurde bei den in vivo Versuchen ¨ auf das mit Tris-Renaturierungspuffer ruckgefaltete Fusionsprotein zuruckgegriffen. ¨ ¨ 9.5. Isolierung des AChR aus Torpedo californica Aus dem elektrischen Organ von Torpedo californica konnte T-AChR in ausreichenden Mengen zur Induktion der EAMG in Ratten isoliert werden. Dabei gelang die Affinitatschromatographie an ¨ Cobratoxin-Saulen sowohl im Durchfluss-, als auch im Batch-Verfahren. Eine Verunreinigung bei ¨ 43 kD wurde aufgrund der geringen Menge vernachlassigt. ¨ 9.6. Versuche zur antigenspezifischen Immunsuppression in vivo Mit Hilfe von aus Torpedo californica isoliertem T-AChR gelang die Induktion von EAMG in weiblichen Lewis-Ratten. Die Ratten zeigten optisch myasthene Symptome wie Schwache, Zittern und die ¨ typische Korperhaltung. Die Auspragung variierte von Ratte zu Ratte. Das Vorliegen der Erkrankung ¨ ¨ konnte durch eine repetitive Nervenstimulation des Ischiasnerv nachgewiesen werden, deren Etablierung im Rahmen dieser Arbeit gelang. Zur Therapie wurde drei stark myasthenen Ratten das His(T)-Gelonin1-246 -H--AChR4-181 Fusions6 protein gespritzt. Nach einer Woche zeigte sich eine deutliche Besserung des Gesundheitszustands ¨ von zwei Ratten. Bei der Uberprufung des Therapieerfolgs mit RNS war bei keiner der therapierten ¨ Ratten ein pathologischer Dekrementwert feststellbar. Allerdings zeigten auch die myasthenen Ratten, die nicht mit dem Fusionsprotein therapiert wurden, eine Abnahme in den Dekrementwerten. Allerdings waren diese immer noch als pathologisch einzustufen. Die mit T-AChR immunisierten Ratten die bei der Krankheitskontrolle keine pathologischen Dekrementwerte zeigten, entwickelten EAMG. 9.6. Versuche zur antigenspezifischen Immunsuppression in vivo 115 Aufgrund dieser Ergebnisse konnte eine therapeutische Wirkung des Fusionsproteins auf EAMG nachgewiesen werden. Allerdings ließen sich keine Aussagen uber den Wirkmechanismus treffen. ¨ 116 9. Zusammenfassung 117 10. Experimenteller Teil 10.1. Materialien ¨ 10.1.1. Gerate und Verbrauchsmaterialien Bei der Durchfuhrung der Versuche wurden die folgenden Gerate verwendet: ¨ ¨ Autoklav: Chromatographie: Sitram Dampfkochtopf Beckman System Gold Nouveau (HPLC-System) Beckman Solvent Module 125 Beckman Detector Module 168 Pharmacia Peristaltikpumpe P-1 Pharmacia Peristaltikpumpe P-3 Densitometer: Durchflussphotometer: EIA-Plattenreader: Elektrophoresezubehor: ¨ Hirschmann Elscript 400 LKB Pharmacia 2238 Uvicord S Bio-Rad Typ 2550 Elektrophoresekammern (Eigenbau der Kunststoff-verarbeitenden Werkstatt, Universitat Kaiserslautern) ¨ Lichtbank Rex Sofortbildkamera Polaroid DS34 Gefriertrocknung: Inkubatoren: Leybold-Heraeus Lyovac GT-2 Luftschuttler New Brunswick Incubator Shaker Innova 4000 ¨ Wasserschuttler Infors AG HTBTR 112 ¨ Kanulen: ¨ Konzentratoren: Stericam 0,60 x 25 mm (23G x 1") Millipore Amicon Ultra (10.000 und 30.000 MWCO) Millipore Centriprep YM-10 (10.000 MWCO) Kuvetten: ¨ Brand Plastibrand (Vis) Hellma Suprasil (UV) 118 10. Experimenteller Teil Mixer: Oszilloskop: pH-Meter: Rotoren: Waring Blendor Typ 8011 Yokogawa DL 1540 Knick AG StB Beckman Type 70Ti Beckman JA10, JA14 und JA20 Heraeus Rotor 2250 Spannungsgerate: ¨ BIO-RAD Power Pac 300 BIO-RAD Power Pac 3000 Zentro-Elektrik 150 V/0,5 A Frobel TFX-20.M ¨ Branson Sonifier B-12 Brandelin Ultraschallbad Sonorex RK 106 Beckman DU 640 Feinwaage Sartorius 1601 MP8-1 Sartorius L 610 D Transilluminator: Ultraschall: UV/VIS-Spektrophotometer: Waagen: Zentrifugen: Beckman Optima LE-80k Ultrazentrifuge Beckman J2-21 Eppendorf Zentrifuge 5415C Heraeus Minifuge T 10.1.2. Chemikalien Aceton Agarose Agarose (Metaphor) Agarose (NEEO, Rotigarose) L-Aminosauren-Kit ¨ Ammoniumhydrogencarbonat Ammoniumpersulfat Ampicillin Bacto Agar Bacto Peptone BCA Protein Assay Reagenz A und B BCIP/NBT-Blue Liquid Substrat System Merck Roth Biowhittaker Molecular Applications Roth Sigma Serva Sigma Roth Difco Difco Pierce Sigma 10.1. Materialien 119 Borsaure ¨ Bromphenolblau Butanol Calciumchlorid Carbamoylcholinchlorid Cholat, Natrium-Salz Coomassie Brilliant Blue R 250 Creatinphosphat, Natriumsalz DEA DTT EDTA EGTA Essigsaure ¨ Ethanol Ethidiumbromid Folin-Ciocalteau-Phenol-Reagenz Formaldehyd Freund's Adjuvans, inkomplett Freund's Adjuvans, komplett Glutathion, oxidiert Glutathion, reduziert Glycerin Glycin Guanidin-hydrochlorid Hefe-Extrakt Hemin Imidazol IPTG Kaliumacetat Kaliumhexacyanoferrat(III) Kaliumhydroxid Kanamycin-Sulfat Kaninchen Retikulozyten Lysat, unbehandelt Kupfer(II)sulfat Magnesiumchlorid Manganchlorid -Mercaptoethanol Merck Sigma Riedel-de Haen Riedel-de Haen Sigma Sigma Serva Serva Merck Gerbu Biotechnik GmbH Serva Serva Roth Roth USB Merck Roth Sigma Sigma Roth Roth Caldic Deutschland Serva Gerbu Biotechnik GmbH Difco Serva Sigma Gerbu Biotechnik GmbH Riedel-de Haen Merck Riedel-de Haen Gerbu Biotechnik GmbH Promega Sigma Merck Merck Fluka 120 10. Experimenteller Teil Milchpulver Roth Mestinon 10, Filmtabletten (Wirkstoff: Pyridostigminbromid) ICN MOPS Sigma Natriumazid Merck Natriumcarbonat Natriumchlorid Natriumcholat Natriumdeoxycholat Natriumdihydrogenphosphat Natriumdihydrogencarbonat di-Natriumhydrogenphosphat Natriumhydroxid Natrium-/Kaliumtartrat Natriumthiosulfat Nickelsulfat 4-Nitrophenylphosphat PMSF Pyridin Rotiszint ecoplus Rubidiumchlorid SDS Silbernitrat TEMED TFMS Trichloressigsaure ¨ Tris Triton X-100 Tween 20 L-Valin L-[U-14 C]Valin Wasserstoffperoxid Riedel-de Haen Riedel-de Haen Sigma Sigma Riedel-de Haen Riedel-de Haen Riedel-de Haen Merck Fluka Merck Merck Boehringer Mannheim ICN Biomedicals Merck Roth Sigma Roche Merck Sigma Sigma Roth Sigma Sigma Sigma Sigma Amersham Pharmacia Biotech Riedel-de Haen 10.1.3. DNA- und Proteinmarker Es wurden die folgenden DNA-Marker verwendet. Die Große der Fragmente in (bp) ist angegeben. ¨ Alle DNA-Marker stammten von der Fa. Fermentas. 10.1. Materialien 121 -DNA Eco47I (AvaII) 8.126, 6.555, 6.442, 3.676, 2.606, 2.555, 2.134, 2.005, 1.951, 1.611, 1.420, 1.284, 985, 974, 894, 597, 590, 513, 511, 433, 398, 345, 310, 308, 272, 242, 215, 151, 88, 73, 67, 45, 42, 32, 29, 23 23.130, 9.416, 6.557, 4.361, 2.322, 2.027, 564, 125 10.000, 8.000, 6.000, 5.000, 4.000, 3.000, 2.500, 2.000, 1.500, 1.031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 80 10.000, 8.000, 6.000, 5.000, 4.000, 3.000, 2.500, 2.000, 1.500 1.031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 80 1.031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 80 908, 659, 656, 521, 403, 281, 257, 226, 100, 90, 63, 57, 49, 46, 19, 15, 11 -DNA HindIII DNA Ladder (Broad Range) DNA Ladder (High Range) DNA Ladder (Low Range) pBR322 BsuRI pBR322 AluI Fur SDS-PAGE und Western Blot wurden die folgenden Proteinmarker verwendet. Die Zahlen geben ¨ die Große in (kDa) der Proteine im Standard an. ¨ Bio-Rad (Broad range) Roti-Mark Prestained Roti-Mark Standard 205, 116, 80, 49,5, 32,5, 27,5, 18,5, 6,5 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 17 200, 119, 66, 43, 29, 20, 14,5 Bio-Rad Roth Roth Fermentas Protein-Ladder 10-200kD 200, 150, 120, 100, 85, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10 ¨ 10.1.4. Saulenmaterial Zur chromatographischen Aufreinigung wurde das folgende Saulenmaterial verwendet: ¨ -Cobratoxin immobilisiert an CNBr-aktivierter Agarose Sigma HiTrap Chelating Amersham Pharmacia Biotech HiTrap SP FF Amersham Pharmacia Biotech Ni-CAM HC Resin Sigma ¨ 10.1.5. E.coli-Stamme und Plasmide Fur die gentechnischen Arbeiten wurden die folgenden E.coli-Stamme verwendet (Genotyp nach ¨ ¨ Sambrook et al., 1989). BL21(DE3) DH5 F- ompT hsdSB (r- , m- ) gal dcm (DE3) B B F- (80d(lacZ)M15) recA1 endA1 gyrA96 thi1 hsdR17 (r - , m- ) supE44 relA1 k k deoR (lacZYA-argF)U169 122 10. Experimenteller Teil GM2163 F- dcm-6 dam-13::Tn9 araC14 leuB6 fhuA13 lacY1 tsx-78glnV44(0c) galT22 LAM- mcrA0 hisG4(0c) rfbD1 rpsL136(strR) xylA5 mtl-12 thi-1 mcrB9999 hsdR2 Fur die Klonierungs- und Expressionsversuche wurden die folgenden Plasmide verwendet: ¨ pHE706 pHE706ext pBDH-VU1 pET19b pET-gel pET-GA 6.196 bp Ampicillin 6.014 bp Ampicillin 4.432 bp Ampicillin 5.717 bp Ampicillin (Hossann, 2001) Kap. 5.3.5 (Jehl, 2002) Fa. Novagen 6.089 bp Kanamycin (Li, 2002) 6.870 bp Kanamycin (Li, 2002) Kap. 5.3.2 Kap. 5.3.4 pUCHE706 4.073 bp Ampicillin pUCHE706ext 3.891 bp Ampicillin Der Vektor pHE706 wurde uns freundlicherweise von Dr. D. Beeson (Institute of Molecular Medicine, Oxford, England) zur Verfugung gestellt. ¨ 10.1.6. Proteine und Enzyme Die fur die Versuche verwendeten, kauflich erhaltlichen, Enzyme und Proteine sind in den folgenden ¨ ¨ ¨ Tabellen aufgelistet. Creatin-Phosphokinase, Typ I (aus Hasenmuskel) Sigma Glucose-Dehydrogenase Roche Enterokinase, rekombinant (1,7 U/µl) Lysozym aus Huhnereiweiß (130.000 U/mg) ¨ Rinderserumalbumin (BSA) T4 DNA Ligase (5 U/µl) T4 Polynucleotide Kinase (10 U/µl) Thrombin (1,4 U/µl) Novagen Sigma Gerbu Biotechnik GmbH MBI Fermentas MBI Fermentas Novagen Fur die durchgefuhrten Restriktionsreaktionen wurden die mitgelieferten Pufferlosungen verwendet. ¨ ¨ ¨ In Klammern sind die Prototypen der Restriktionsendonukleasen angegeben. BclI BglII Eco32I (EcoRV) Eco130I (StyI) 15 U/µl New England Biolabs 10 U/µl MBI Fermentas 10 U/µl MBI Fermentas 10 U/µl MBI Fermentas 10.1. Materialien 123 EcoO109I (DraII) 10 U/µl MBI Fermentas EcoRI HincII (HindII) HindIII MboII NcoI NdeI ScaI Van91I (PflMI) XhoI 10 U/µl MBI Fermentas 10 U/µl MBI Fermentas 10 U/µl MBI Fermentas 5 U/µl MBI Fermentas 10 U/µl New England Biolabs 10 U/µl MBI Fermentas 10 U/µl MBI Fermentas 10 U/µl MBI Fermentas 10 U/µl MBI Fermentas ¨ 10.1.7. Antikorper Fur die immunologischen Untersuchungen wurden die in Tab. 10.10 aufgefuhrten Antikorper ver¨ ¨ ¨ wendet. Der Antikorper mAb 35 stammte aus der im Arbeitskreis vorhandenen Hybridomzelllinie ¨ (ATCC, HB-8857), die polyklonalen Anti-Gelonin Antikorper wurden im Arbeitskreis durch die Im¨ munisierung von Mausen mit Gelonin produziert. Alle anderen Antikorper waren kauflich erworben. ¨ ¨ ¨ 10.1.8. Oligonukleotide Zur Synthese des Plasmides pHE706ext wurden die in der folgenden Tabelle aufgefuhrten synthe¨ tischen Oligonukleotide eingesetzt. Die Oligonukleotide ext1 bis ext5 stammten von der Fa. MWG, wahrend ext123 und ext45 von der Fa. Operon synthetisiert wurden. ¨ ext1 ext2 ext3 5'-GATCAAGGAGTCCCGTGGCTGGAAACATAG-3' 5'-CGTGACCTATAGCTGCTGCCCGGATACCCCGTATCTGGA-3' 5'-ATTACCTATCATTTCGTGATGCAGTAACTG-3' ext4 5'-AATTCAGTTACTGCATCACGAAATGATAGGTAATATCCAGATACGGGGTATCCG-3' ext5 5'-GGCAGCAGCTATAGGTCACGCTATGTTTCCAGCCACGGGACTCCT-3' ext123 5'-GATCAAGGAGTCCCGTGGCTGGAAACATAGCGTGACCTATAGCTGCTGCCCGG... ...ATACCCCGTATCTGGAATTACCTATCATTTCGTGATGCAGTAACTG-3' ext45 5'-AATTCAGTTACTGCATCACGAAATGATAGGTAATATCCAGATACGGGGTATCCG... ...GGCAGCAGCTATAGGTCACGCTATGTTTCCAGCCACGGGACTCCT-3' 124 10. Experimenteller Teil 10.2. Allgemeine Arbeitsmethoden 10.2.1. Konzentrationsbestimmungen 10.2.1.1. UV/VIS-Bestimmung Proteine beinhalten aromatische Gruppen, die bei einer Wellenlange von 280 nm eine Absorptions¨ bande aufweisen. Durch Messung der Absorption und Einbeziehung des molaren Extinktionskoeffizienten lasst sich die Proteinkonzentration bestimmen (Peterson, 1977). Die Anwesenheit anderer ¨ Proteine stort dabei die Messung. In der folgenden Tabelle sind die molaren Extinktionskoeffizienten ¨ () und Extinktionen bei einer Konzentration von 1 mg/ml (E c ) der verwendeten Proteine aufgefuhrt. ¨ Protein Rinderserumalbumin Gelonin, aus Gelonin multiflorum AChR, aus Torpedo californica (cm2 /mmol) Ec 45.400 0,667 20.100 0,670 477.500 1,910 10.2.1.2. BCA-Test Der BCA-Test dient zur Bestimmung der Proteinmenge mit Hilfe eines Testsystems der Firma Pierce. Mit einem Gemisch aus 4,4'-Dicarboxy-2,2'-bichinolinnatriumsalz (BCA, Reagenz A) und Kupfer(II)sulfat (Reagenz B) erhalt man eine Losung, die zur Proteinbestimmung herangezogen werden ¨ ¨ kann. Die Cu2+ -Ionen werden dabei durch oxidierbare Gruppen im Protein zu Cu+ -Ionen reduziert, die dann von BCA komplexiert und durch photometrische Bestimmung detektiert werden konnen ¨ (Smith et al., 1985). 10.2.1.3. Methode nach Lowry Analog zum BCA-Test liegt bei der Proteinbestimmung nach Lowry die Reduktion von Cu 2+ -Ionen zu Grunde. Die entstandenen Cu+ -Ionen bilden mit dem Folin-Ciocalteau Reagenz einen instabilen blauen Komplex. Dieser dient als Maß fur die Proteinkonzentration. Wahrend die BCA-Methode ¨ ¨ durch reduzierende Substanzen (Thiolreagenzien, Lipide, SDS, u.s.w) gestort wird, zeigt sich die ¨ Methode nach Lowry, aufgrund der vorher durchgefuhrten TCA-Fallung, unempfindlich. Die Pro¨ ¨ teinbestimmung erfolgte nach der von Peterson modifizierten Methode (Lowry et al., 1951; Peterson, 1977). 10.2. Allgemeine Arbeitsmethoden 125 10.2.2. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Mit Hilfe der SDS-PAGE lassen sich Proteine aufgrund ihrer Molekularmassen trennen und charakterisieren. Die Methode geht auf Laemmli zuruck (Laemmli, 1970). Sie wurde geringfugig modifiziert: ¨ ¨ In Abwandlung der Literaturvorschrift wurde eine Elektrophoresekammer von 10 x 7,5 x 0,2 cm verwendet und die Elektrophorese bei einer konstanten Stromstarke von 20-28 mA durchgefuhrt. Es ¨ ¨ wurden 4,5 %ige Sammel- und 10, 12 und 15 %ige Trenngele verwendet. Aufgrund ihrer geringen Konzentration war es bei einigen Proben erforderlich die Proteine vor Einbringen in die Taschen des Gels mit TCA (Kap. 10.2.4.2) zu fallen. ¨ ¨ Coomassie-Farbung Eine zur Farbung von SDS-Gelen weit verbreitete Methode ist die Farbung mit Coomassie Brilliant¨ ¨ blau R 250. Sie zeichnet sich vor allem durch die Linearitat der Proteinfarbung und geringe Hinter¨ ¨ grundfarbung aus. Dies ermoglicht z.B. die quantitative Proteinbestimmung mit Hilfe einer densito¨ ¨ metrischen Analyse. Nachteil im Vergleich mit der Silberfarbung ist die geringere Nachweisgrenze. ¨ Es konnen mit der Coomassie-Farbung noch etwa 2 µg Protein detektiert werden (de Groth et al., ¨ ¨ 1963). Auf eine Fixierung mit Hilfe einer 12,5 %igen TCA-Losung wurde verzichtet. ¨ ¨ Silberfarbung Die Silberfarbung ist empfindlicher als die Coomassie-Farbung. Es lassen sich noch 0,5-1 µg Pro¨ ¨ tein nachweisen. Allerdings ist die Hintergrundfarbung starker und die Farbung zeigt eine geringere ¨ ¨ ¨ Linearitat (Heukeshoven und Demick, 1983). ¨ Molekulargewichtsbestimmung Das Molekulargewicht der Proteine lasst sich auf SDS-Gelen durch den Vergleich mit den bekannten ¨ Molekulargewichten von Standardproteinen bestimmen. Dazu werden der Logarithmus der Molekulargewichte der Standards gegen die Laufstrecke aufgetragen. Man erhalt eine Eichgerade. Das ge¨ suchte Molekulargewicht der Probe(n) kann dann mit Hilfe der Regressionsgeraden berechnet werden. 10.2.3. Dialyse Die Dialyse von Proteinlosungen dient zum Pufferwechsel, bzw. zum Entfernen von niedermoleku¨ laren Substanzen. 126 10. Experimenteller Teil Durchfuhrung: ¨ Der Dialyseschlauch (Visking Size 1-8/32" Fa. Fischer) wird im Dialysepuffer fur 10 Minuten inku¨ biert, an einem Ende verknotet und die Proteinlosung eingefullt. Nach dem Verknoten des anderen ¨ ¨ Endes wird der Schlauch in 5 l Dialysepuffer gegeben und uber Nacht, unter leichtem Ruhren des ¨ ¨ Puffers, inkubiert. Am nachsten Tag wird der Dialysepuffer zweimal gewechselt und jeweils fur ca. 2 ¨ ¨ Stunden inkubiert. 10.2.4. Proteinkonzentration 10.2.4.1. Aufkonzentration mit Amicon-Konzentratoren Zur Aufkonzentration von Proteinlosungen konnen Membranen mit definierten Porengroßen verwen¨ ¨ ¨ C, ca. 1 min/ml) der Losung durch die Membran det werden. Durch die Zentrifugation (4.170 xg, 20 ¨ werden kleinere Molekule durchgelassen, Molekule mit großerem Durchmesser als die Pore werden ¨ ¨ ¨ zuruckgehalten und aufkonzentriert. ¨ ¨ ¨ 10.2.4.2. Fallung mit Trichloressigsaure Die Fallung und anschließende Wiederaufnahme von Proteinen in geringeren Volumina ist eine der ¨ ¨ effektivsten Methoden der Proteinkonzentration. Die Fallung von Proteinen mit Trichloressigsaure ¨ (TCA) (Bensadoun und Weinstein, 1976) ist allerdings aufgrund der Irreversibilitat nur in Verbindung ¨ mit Lowry und SDS-PAGE sinnvoll. ¨ ¨ Benotigte Losungen: DOC: 0,15 g Natriumdeoxycholat ad 100 ml Wasser TCA: 72 g Trichloressigsaure ¨ ad 100 g Wasser Durchfuhrung: ¨ Die zu fallende Proteinprobe wird mit Wasser auf 1 ml verdunnt, mit 100 µl DOC-Losung versetzt, ¨ ¨ ¨ gut durchmischt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Zugabe von 100 µl der TCA-Losung wird die Probe gevortext und fur 20 Minuten bei 14.000 U/min (4 C) in der Eppendorf¨ ¨ ¨ zentrifuge zentrifugiert. Der Uberstand wird entfernt und das Gefaß vorsichtig ausgeklopft. ¨ Bei Guanidin-hydrochlorid-haltigen Proben wird das Pellet nach der Zentrifugation mit 100 µl eisgekuhltem Ethanol gewaschen, um die Reste zu entfernen. Es wird kurz abzentrifugiert und der ¨ 10.3. Gentechnische Methoden 127 ¨ Uberstand entfernt. Das Gefaß wird erneut ausgeklopft und das Pellet weiterverarbeitet (SDS-PAGE, ¨ Lowry). 10.3. Gentechnische Methoden Die hier beschriebenen Arbeitsmethoden folgen den Vorschriften von Sambrook et al. (Sambrook et al., 1989). Bei den Arbeiten wurden die folgenden Fest- und Flussigmedien verwendet: ¨ ¨ ¨ Benotigte Losungen Luria-Bertani (LB)-Medium: 5 g Hefe-Extrakt 10 g Bacto-Trypton (Trypton-Pepton) 10 g Natriumchlorid pH 7,5 (NaOH) ad 1 l Wasser autoklavieren Ampicillin-Stammlosung: ¨ 130 mM Ampicillin uber 0,22 µm steril filtrieren ¨ Kanamycin-Stammlosung: ¨ 45 mM Kanamycin uber 0,22 µm steril filtrieren ¨ Dem LB-Flussigmedium werden 1,5 % Agar zugesetzt und ¨ autoklaviert. Die Zugabe des Antibiotikums (1 µl /ml Medium) erfolgt bei ca. 50 C. Die Petrischalen werden mit warmer Losung befullt und langsam auf RT abgekuhlt. ¨ ¨ ¨ IPTG-Stammlosung: ¨ 0,5 M IPTG uber 0,22 µm steril filtrieren ¨ Agar-Platten: 10.3.1. Allgemeine Arbeitsmethoden ¨ 10.3.1.1. Sterilisation von Geraten Bei der Durchfuhrung der Versuche ist steriles Arbeiten erforderlich. Dazu mussen alle Gerate keim¨ ¨ ¨ frei sein. Dies wurde durch Autoklavieren erreicht. Nicht autoklavierbare Gegenstande wurden mit ¨ Alkohollosungen (70 %iges Ethanol-Wasser-Gemisch) desinfiziert. ¨ 128 10. Experimenteller Teil 10.3.1.2. Kulturbedingungen Aus einer Glycerinkultur (Kap. 10.3.1.4) wird ein Verdunnungsausstrich auf einer Agarplatte an¨ C im Brutschrank inkubiert. Mit einer Einzelkolonie werden 25 ml gelegt und uber Nacht bei 37 ¨ Flussigmedium angeimpft und unter Schutteln (Wasserbad- bzw. Luftschuttler, 270 U/min, 37 C) ¨ ¨ ¨ ¨ uber Nacht inkubiert. Ausgehend von dieser Ubernachtkultur kann eine großere Kultur angeimpft ¨ ¨ werden. Als Gefaße fur die Flussigmedien dienen Erlenmeyerkolben, die bis zu maximal 25 % befullt ¨ ¨ ¨ ¨ werden, um eine ausreichende Beluftung des Kulturmediums zu gewahrleisten. ¨ ¨ 10.3.1.3. Wachstumsmessungen Zur Kontrolle des Bakterienwachstums wird das Medium photometrisch bei einer Wellenlange von ¨ 600 nm im UV/VIS-Spektrophotometer untersucht. Das Licht wird beim Durchtritt durch die Suspension gestreut. Die Starke der Streuung hangt dabei von der Anzahl und Große der Bakterien ab ¨ ¨ ¨ (Sußmuth et al., 1997). Vergleicht man die Lichtabschwachung mit ungeimpften Medium als Null¨ ¨ wert (Blank), so lasst sich als Maß fur das Bakterienwachstum die optische Dichte (OD) einfuhren. ¨ ¨ ¨ Liegt die OD einer Kultur uber 0,3, muss sie verdunnt werden, da die Trubung einer Flussigkultur nur ¨ ¨ ¨ ¨ bis zu diesem Wert linear proportional zur Zellzahl ist. 10.3.1.4. Glycerinkulturen Glycerinkulturen dienen zur Lagerung von Zellen. Zur Herstellung werden 500 µl Glycerin (80 %) in ¨ enem verschraubbaren Eppendorfgefaß autoklaviert und mit 500 µl einer Ubernachtkultur gemischt. ¨ Nach dem Schockgefrieren in einem Trockeneis/Ethanol-Bad werden die Rohrchen bei -80 C gelagert. ¨ Zur Kultivierung von Einzelkolonien aus einer Glycerinkultur wird ein Verdunnungsausstrich an¨ gelegt. Dazu wird mit einer Impfose ein kleiner Teil von der Oberflache der tiefgefrorenen Gly¨ ¨ cerinkultur abgekratzt und ausgestrichen. Dabei sollte ein Auftauen der Glycerinkultur vermieden werden, um eine moglichst lange Lebensdauer zu gewahrleisten. ¨ ¨ 10.3.2. Plasmidisolierung Zur Isolierung von Plasmiden aus E.coli wurde das Plasmidisolierungskit QIAprep Spin Miniprep Kit der Fa. Qiagen verwendet. Die Durchfuhrung erfolgte nach der mitgelieferten Vorschrift. ¨ 10.3. Gentechnische Methoden 129 10.3.3. Herstellung kompetenter Zellen Die Herstellung kompetenter Zellen ist bei allen Klonierungsarbeiten notwendig, um die Transformation eines Plasmides in eine Wirtszelle zu ermoglichen. Dabei ist eine sehr hohe Transformations¨ effizienz erwunscht. Dies erreicht man in Gegenwart von Rubidiumchlorid (Hanahan, 1983). Mit ¨ dieser Art kompetenter Zellen konnen, je nach verwendetem Plasmid bzw. E.coli Stamm, uber 10 7 ¨ ¨ Transformanden pro µg eingesetzter DNA erhalten werden. 10.3.4. Transformation und Kompetenztest Die kompetenten Zellen werden auf Eis aufgetaut und mit der gewunschten Menge an Plasmid-DNA ¨ ¨ umgesetzt (2-4 µl). Es erfolgt eine einstundige Inkubation auf Eis. Anschließend werden die Zellen fur ¨ 3 Minuten bei 42 C einem Hitzeschock ausgesetzt und danach sofort auf Eis abgeschreckt. Die Suspension wird in ein steriles Reagenzglas mit 1 ml LB-Flussigmedium gegeben und fur 45 Minuten bei ¨ ¨ 37 C und 270 U/min im Schuttler inkubiert. Von der Suspension werden 100 µl mit einem Trigalski¨ Spatel auf Agarplatten ausgestrichen, die das entsprechende Antibiotikum enthalten. Zur Auftragung ¨ aller anderen Zellen wird 30 Sekunden in einer Eppendorfzentrifuge abzentrifugiert, der Uberstand bis auf etwa 200 µl entfernt, die Zellen resuspendiert und auf einer Agarplatte ausgestrichen. Die Platten werden uber Nacht bei 37 C im Brutschrank inkubiert. Sind am nachsten Tag Kolonien entstanden, ¨ ¨ sind die Zellen kompetent. 10.3.5. Restriktionsverdau Beim Restriktionsverdau werden DNA-Molekule spezifisch mit Restriktionsendonukleasen geschnit¨ ten. Dabei erkennt das Enzym eine Basensequenz und spaltet an dieser Stelle eine chemische Bindung. Durch Verdau entsteht aus einem Plasmid ein offenes, lineares DNA-Molekul, dessen Große im ¨ ¨ Agarose-Gel bestimmt werden kann. Da die Reaktionsbedingungen fur die meisten Restriktionsenzyme verschieden sind, mussen diese ¨ ¨ den Produktbeschreibungen der Anbieter entnommen werden. Beim Verdau mit dem Enzym MboII musste nach halbstundiger Inkubation erneut Enzym zur Reaktionslosung zugegeben werden, da das ¨ ¨ Enzym nur fur kurze Zeit stabil war. ¨ 10.3.6. Phosphorylierung von Oligonukleotiden Die Phosphorylierung synthetischer Oligonukleotide in 5'-Position kann mit Hilfe des kauflich erhalt¨ ¨ lichen T4-Polynukleotide Kinase-Kits (Synthetic oligonucleotides 5'-end labeling kit, Fa. Fermentas) durchgefuhrt werden. ¨ 130 10. Experimenteller Teil 10.3.7. Annealing von Oligonukleotiden Das Zusammenlagern (Annealing) von Oligonukleotiden erreicht man durch die Denaturierung und anschließendes langsames Abkuhlen auf Raumtemperatur. Dabei bilden sich die korrekten Basen¨ paare aus. ¨ ¨ Benotigte Losungen: Annealing-Puffer (10x): 100 mM Tris 100 mM Magnesiumchlorid 500 mM Natriumchlorid pH 7,5 Durchfuhrung: ¨ Die Oligonukleotide werden in Annealing-Puffer zehn Minuten bei 70 C im Wasserbad inkubiert. Danach wird die Losung in 500 ml 70 C-warmen Wasser langsam bis auf Raumtemperatur abgekuhlt. ¨ ¨ 10.3.8. Agarose-Gelelektrophorese Zur Trennung und Großenbestimmung von DNA wird die Agarose-Gelelektrophorese verwendet. ¨ Die Detektion der DNA-Molekule erfolgt dabei durch Ethidiumbromid, das sich in die doppelstrangi¨ ¨ gen DNA-Molekule einlagert und mit Hilfe von UV-Transilluminatoren detektiert werden kann. Es ¨ wurden 0,9, 2, 2,5 und 3 %ige Trenngele in selbstgebauten Elektrophoresekammern (Kunststoffverarbeitende Werkstatt, Universitat Kaiserslautern) verwendet. Die Elektrophorese erfolgte bei einer ¨ konstanten Spannung von 110 V. 10.3.9. DNA-Isolierung aus Agarosegelen Zur Isolierung der DNA-Fragmente aus den Agarosegelen wurde das QIAEX II Gel Extraction Kit der Fa. Qiagen verwendet. Die Durchfuhrung erfolgte nach der mitgelieferten Vorschrift. ¨ 10.3.10. Expression Die in dieser Arbeit durchgefuhrten Expressionen von pHE706ext und pET-gel wurden mit ver¨ schiedenen Stamm-Plasmid-Kombinationen durchgefuhrt. Die Durchfuhrung der Expression erfolgte ¨ ¨ aber immer nach identischer Methode. Die Kulturvolumen der Versuche, sowie die Menge an IPTG sind bei den entsprechenden Versuchen aufgefuhrt. ¨ 10.3. Gentechnische Methoden 131 Durchfuhrung: ¨ Die Kultivierung in 500 ml Flussigmedium erfolgt wie in Kap. 10.3.1.2 beschrieben. In regelmaßi¨ ¨ gen Abstanden werden Proben zur Wachstumskontrolle entnommen. Hat die OD einen bestimmten ¨ Wert erreicht, erfolgt die Induktion mit IPTG. Das Zellwachstum wird weiter durch Messung der OD verfolgt. Bevor die Zellen in die stationare Wachstumsphase ubergehen, bzw. die OD einen Wert von ¨ ¨ 4 uberschreitet, wird die Expression durch Inkubation des Kolbens auf Eiswasser gestoppt. Die Sus¨ ¨ pension wird zentrifugiert (8.700 xg, 4 C, 10 min), der Uberstand vollstandig entfernt und das Pellet ¨ bis zur Weiterverarbeitung bei -20 C eingefroren. 10.3.11. Zelllyse ¨ ¨ Benotigte Losungen: Pellet-Waschpuffer: 20 mM Tris pH 7,6 0,75 M Phenylmethysulfonylfluorid (PMSF) in 2-Propanol 50 mM Natriumdihydrogenphosphat 0,5 M Natriumchlorid 20 mM Imidazol 1,5 mM PMSF pH 7,2 Lysozym-Stammlosung: ¨ 10 mg/ml Lysozym in 100 mM Tris, pH 8 PMSF-Losung: ¨ Resuspendierpuffer: Durchfuhrung: ¨ Das Zellpellet wird zweimal mit je 50 ml Waschpuffer gewaschen, bei 6.400 xg und 4 C zehn Minuten abzentrifugiert, in 50 ml Resuspendierpuffer resuspendiert und mit 5 ml Lysozym-Stammlosung ¨ versetzt. Die Zellen werden mit dem Sonifier (8 mal 30 sec bei 65-85 % Leistung) auf Eiswasser lysiert. Zur Abtrennung der unloslichen Bestandteile, inclusion bodies und Zelltrummer wird die ¨ ¨ ¨ Suspension bei 30.000 xg und 4 C dreißig Minuten zentrifugiert und der Uberstand bzw. die inclusion bodies bis zur Weiterverarbeitung bei -20 C gelagert. 132 10. Experimenteller Teil 10.4. Proteinisolierung 10.4.1. Isolierung von rekombinantem Gelonin (HisT -Gelonin1-251 ) 6 ¨ 10.4.1.1. Isolierung mit Nickel-Affinitatschromatographie (Elution mit Imidazol) ¨ ¨ Benotigte Losungen: Nickelsulfat-Losung: ¨ Bindungspuffer: 0,2 M Nickelsulfat 50 mM Natriumdihydrogenphosphat 0,5 M Natriumchlorid 20 mM Imidazol 1,5 mM PMSF pH 7,2 Waschpuffer: 50 mM Natriumdihydrogenphosphat 0,5 M Natriumchlorid 100 mM Imidazol 1,5 mM PMSF pH 7,2 Elutionspuffer: 50 mM Natriumdihydrogenphosphat 0,5 M Natriumchlorid 500 mM Imidazol 1,5 mM PMSF pH 7,2 Regenerationspuffer: 20 mM Tris 500 mM Natriumchlorid 50 mM EDTA-Na2 -Salz pH 8 Dialysepuffer: 20 mM Tris 0,5 M NaCl pH 7,2 Durchfuhrung: ¨ Die Aufreinigung erfolgt durch Nickel-Affinitatschromatographie bei Raumtemperatur unter Ver¨ wendung einer Peristaltikpumpe und eines Uvicord-Detektors bei 280 nm. Die Flußrate wird auf ca. ¨ ¨ ¨ 0,5 - 1 ml/min eingestellt. Alle Losungen mussen vor dem Auftragen auf die Saule steril uber 0,45 µm ¨ 10.4. Proteinisolierung 133 ¨ filtriert werden, um Schwebstoffe abzutrennen. Der Uberstand der Zelllyse wird vor dem Saulen¨ ¨ gang in der Ultrazentrifuge zentrifugiert (400.000 xg, 4 C, 60 min). Wahrenddessen wird die HiTrap Chelating Affinitatssaule (1 ml) mit 10 ml Wasser gewaschen, mit Nickel-Ionen beladen (2 ml Nick¨¨ elsulfatlosung) und anschließend wieder mit 10 ml Wasser gewaschen. Danach wird die Saule mit ¨ ¨ ¨ 10 ml Bindungspuffer equilibriert und der Uberstand der Ultrazentrifugation auf die Saule aufgetra¨ gen. Nichtgebundene Proteine werden mit Bindungspuffer von der Saule gewaschen, bis die Absorp¨ tion bei 280 nm wieder die Baseline erreicht hat. Unspezifisch gebundene Proteine werden mit 10 ml ¨ Waschpuffer von der Saule eluiert, wahrend Gelonin durch Elutionspuffer eluiert werden kann. Die ¨ erhaltene Proteinlosung wird 3 mal gegen 5 l Dialysepuffer bei 4 C dialysiert und bei -20 C gelagert. ¨ Die HiTrap Chelating Affinitatssaule wird durch Spulen mit 10 ml Regenerationspuffer entladen, an¨¨ ¨ schließend mit 10 ml Wasser gespult und danach in 20 %iger ethanolischer Losung bei 4 C gelagert. ¨ ¨ ¨ 10.4.1.2. Isolierung mit Nickel-Affinitatschromatographie (Elution mit Thrombin) ¨ ¨ Benotigte Losungen: Nickelsulfat-Losung: ¨ Waschpuffer: 0,2 M Nickelsulfat 50 mM Natriumdihydrogenphosphat 0,5 M Natriumchlorid 100 mM Imidazol 1,5 mM PMSF pH 7,2 Thrombin-Elutionspuffer: 2,3 U/ml Thrombin 50 mM Natriumdihydrogenphosphat 0,5 M Natriumchlorid 20 mM Imidazol 1,5 mM PMSF pH 7,2 Elutionspuffer: 50 mM Natriumdihydrogenphosphat 0,5 M Natriumchlorid 500 mM Imidazol 1,5 mM PMSF pH 7,2 134 10. Experimenteller Teil Durchfuhrung: ¨ Die Isolierung erfolgt bis zur Elution mit Elutionspuffer analog zur in Kap. 10.4.1.1 beschriebenen Isolierung. Nach der Elution der unspezifisch gebundenen Proteine mit Waschpuffer wird die Saule ¨ mit Bindungspuffer gespult, bis die Adsorption wieder die Baseline erreicht hat. Anschließend wird ¨ die Saule mit einer Spritze mit 1 ml Thrombinelutionspuffer beladen. Die Inkubation erfolgt uber ¨ ¨ 16 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird Gelonin 1-251 mit Bindungspuffer eluiert. Zur Erhohung der Ausbeute kann nichtgeschnittenes Gelonin mit Hilfe des Elutionspuffers eluiert werden. ¨ Das Protein wird wie in Kap. 10.4.1.1 beschrieben dialysiert und die Saule regeneriert. ¨ 10.4.1.3. Abspaltung des HisTag von HisT -Gelonin1-251 6 Der HisTag kann mit Hilfe des Thrombin-Kits (Fa. Novagen) abgespalten werden. Thrombin ist eine Endoprotease, die spezifisch an die Aminosaurensequenz LeuValProArgGlySer bindet und vor dem ¨ enthaltenen Glycin eine Peptidbindung spaltet. ¨ ¨ Benotigte Losungen: Guanidin-hydrochlorid-SL: 6 M Guanidin-hydrochlorid 20 mM Natriumdihydrogenphosphat pH 8,4 Durchfuhrung: ¨ Es werden 0,2 mg/ml His T -Gelonin1-251 mit 1 mU Thrombin pro µg Protein nach Vorschrift des Her6 stellers versetzt und 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Fur die Bestimmung der Hemmung von Thrombin durch Guanidin-hydrochlorid, wurde nach folgen¨ dem Schema pipettiert: 10x Cleavage Buffer Thrombin (1:25) Protein GdmHCl-SL Wasser (bidest.) 5 µl 1 µl x µl (10 µg) y µl 50 - x - y µl Die Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur uber 16 Stunden. ¨ 10.4. Proteinisolierung 135 10.4.2. Isolierung des His(T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-181 -Fusionsproteins 6 10.4.2.1. Aufreinigung Das rekombinante Fusionsprotein wurde von Li (Li, 2002) an der Shanxi-University, Taiyuan, China exprimiert und uns zur Aufreinigung zur Verfugung gestellt. Zum einen lag Protein in vorgereinig¨ ter Form, zum anderen in Form von inclusion bodies vor. Beide wurden mit der gleichen Methode aufgereinigt. ¨ ¨ Benotigte Losungen: Nickelsulfat-Losung: ¨ Denaturierungspuffer: 0,2 M Nickelsulfat 5 M Guanidin-hydrochlorid 20 mM Tris-HCl 0,5 M Natriumchlorid pH 8,0 Waschpuffer: Elutionspuffer: Durchfuhrung: ¨ Die Aufreinigung erfolgt durch Nickel-Affinitatschromatographie bei Raumtemperatur unter Verwen¨ dung einer Peristaltikpumpe und eines Uvicord-Detektors bei 280 nm. Die Flußrate wird auf ca. 0,5 - 1 ml/min eingestellt. Alle Losungen werden vor dem Auftragen auf die Saule steril uber 0,45 µm ¨ ¨ ¨ filtriert um Schwebstoffe abzutrennen. Die aufgereinigte Proteinprobe wird bei 4 C dreimal gegen 500 ml Denaturierungspuffer dialysiert, wahrend die inclusion bodies in Denaturierungspuffer gelost werden (Endkonzentration: 7-10 mg/ml ¨ ¨ Gesamtprotein). Die denaturierte Proteinlosung wird vor dem Saulengang in der Ultrazentrifuge (400.000 xg, 4 C, ¨ ¨ 60 min) zentrifugiert. Wahrenddessen wird die HiTrap Chelating Affinitatssaule (1 ml) mit 10 ml ¨ ¨¨ Wasser gewaschen, mit Nickel-Ionen beladen (2 ml Nickelsulfatlosung) und anschließend wieder mit ¨ 10 ml Wasser gewaschen. Danach wird die Saule mit 10 ml Denaturierungspuffer equilibriert und der ¨ ¨ Uberstand der Ultrazentrifugation auf die Saule aufgetragen. Nichtgebundene Proteine werden mit ¨ Denaturierungspuffer von der Saule gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm wieder die Baseline ¨ erreicht hat. Unspezifisch gebundene Proteine werden mit Waschpuffer eluiert (nur bei Aufreinigung direkt aus den inclusion bodies). Das Fusionsprotein kann schließlich durch Elutionspuffer eluiert werden und wird anschließend sofort zuruckgefaltet (Kap. 10.4.2.2). ¨ Denaturierungspuffer mit 50 mM Imidazol Denaturierungspuffer mit 500 mM Imidazol 136 10. Experimenteller Teil 10.4.2.2. Renaturierung Nach denaturierender Aufarbeitung von Proteinen ist eine Ruckfaltung in die native Form notwendig. ¨ Die hier verwendete Methode der Verdunnung in nicht-denaturierende Puffer beruhte auf einer modi¨ fizierten Vorschrift nach Rudolph und Lilie (Rudolph und Lilie, 1996). ¨ ¨ Benotigte Losungen: Renaturierungspuffer (Tris): 100 mM Tris 4 mM Glutathion (red. Form) 0,4 mM Glutathion (ox. Form) 1 mM EDTA pH 8 Durchfuhrung: ¨ Nach einer Proteinbestimmung wird die denaturierte Proteinlosung unter starkem Ruhren mit Rena¨ ¨ turierungspuffer verdunnt. Dabei wird eine Proteinendkonzentration von 0,1 mg/ml eingestellt. Inku¨ bation uber einen Zeitraum von 24 Stunden bei Raumtemperatur ergibt aus 1 mg denaturiertem Pro¨ tein 0,25 mg renaturiertes Fusionsprotein. Ausgefallene Proteinaggregate werden durch Zentrifugation abgetrennt (4.170 xg, 4 C, 30 min). 10.4.2.3. Recycling der Proteinaggregate ¨ ¨ Benotigte Losungen: Denaturierungspuffer: 5 M Guanidin-hydrochlorid 20 mM Tris-HCl 0,5 M Natriumchlorid pH 8,0 DTT-Stammlosung: ¨ Durchfuhrung: ¨ Die bei der Renaturierung wieder als unlosliche Aggregate ausgefallenen Proteine werden in Dena¨ turierungspuffer aufgenommen und eine Proteinkonzentration von 3-4 mg/ml eingestellt. Zum Auflosen von Disulfidbrucken wird soviel DTT-Stammlosung zugegeben, dass eine Endkonzentration ¨ ¨ ¨ von 30 mM DTT erreicht wird. Die Suspension wird unter schwachem Ruhren fur 24 Stunden bei ¨ ¨ Raumtemperatur inkubiert, unlosliche Aggregate durch Zentrifugation bei 4.170 xg abgetrennt und ¨ ¨ der Uberstand erneut einer Renaturierung unterzogen. 1 M DTT 10.4. Proteinisolierung 137 10.4.3. Isolierung von HisE0 -H--AChR4-208 1 ¨ 10.4.3.1. Isolierung mit Nickel-Affinitatschromatographie (Elution mit Imidazol) Bindungspuffer: 50 mM Natriumdihydrogenphosphat 0,5 M Natriumchlorid 20 mM Imidazol 1,5 mM PMSF pH 7,2 Waschpuffer: 50 mM Natriumdihydrogenphosphat 0,5 M Natriumchlorid 100 mM Imidazol 1,5 mM PMSF pH 7,2 Elutionspuffer: 50 mM Natriumdihydrogenphosphat 0,5 M Natriumchlorid 500 mM Imidazol 1,5 mM PMSF pH 7,2 Durchfuhrung: ¨ Die Aufreinigung erfolgt durch Nickel-Affinitatschromatographie bei Raumtemperatur unter Verwen¨ dung von NiCAM-Saulenmaterial (Fa. Sigma) im Batchverfahren. Dabei wird die Saulenmaterialsus¨ ¨ pension (100 µl) bei 5.000 xg in der Eppendorfzentrifuge zentrifugiert. Das Saulenmaterial wird mit ¨ 500 µl Wasser gewaschen, mit 500 µl Bindungspuffer equilibriert, 1.500 µl Zelllysat aufgetragen und fur eine Stunde unter leichtem Schutteln inkubiert. Zum Entfernen aller ungebundenen Proteine wird ¨ ¨ das Saulenmaterial 4 bis 6 mal mit 1.000 µl Bindungspuffer gewaschen. Unspezifisch gebundene Pro¨ teine werden mit 500 µl Waschpuffer eluiert, wahrend die His E0 -H--AChR4-208 -haltige Fraktion mit ¨ 1 100 µl Elutionspuffer eluiert wird. ¨ 10.4.3.2. Isolierung mit Nickel-Affinitatschromatographie (Elution mit Enterokinase) Bindungspuffer: 50 mM Natriumdihydrogenphosphat 0,5 M Natriumchlorid 20 mM Imidazol 1,5 mM PMSF pH 7,2 138 10. Experimenteller Teil Enterokinasepuffer: 20 mM Tris-HCl 50 mM Natriumchlorid 2,5 mM Calciumchlorid pH 7,4 Enterokinase-Elutionspuffer: Durchfuhrung: ¨ Enterokinasepuffer mit 17 U/ml Enterokinase Die Aufreinigung erfolgt durch Nickel-Affinitatschromatographie bei Raumtemperatur unter Ver¨ wendung von NiCAM-Saulenmaterial (Fa. Sigma) im Batchverfahren. Dabei wird die Saulenma¨ ¨ terialsuspension (100 µl) bei 5.000 xg in der Eppendorfzentrifuge zentrifugiert. Das Saulenmaterial ¨ wird mit 500 µl Wasser gewaschen, mit 500 µl Bindungspuffer equilibriert, 1.500 µl Zelllysat aufgetragen und fur eine Stunde unter leichtem Schutteln inkubiert. Zum Entfernen aller ungebundenen ¨ ¨ Proteine, wird das Saulenmaterial 4 bis 6 mal mit 1.000 µl Bindungspuffer gewaschen und danach ¨ mit 1.000 µl Enterokinasepuffer inkubiert. Die Elution der H--AChR 4-208 -haltigen Fraktion erfolgt durch neunzehn-stundige Inkubation mit 100 µl Enterokinase-Elutionspuffer bei 20 C im Wasserbad. ¨ 10.5. Spezielle Arbeitsmethoden 10.5.1. Isolierung von Gelonin aus Gelonium multiflorum Die Isolierung von Gelonin aus den Samen von Gelonium multiflorum wurde nach einer modifizierten Vorschrift von Stirpe et al. durchgefuhrt (Stirpe et al., 1980; Hofmann, 1988). ¨ 10.5.2. Isolierung von T-AChR aus Torpedo californica Die Isolierung erfolgte aus dem elektrischen Organ des Zitterrochens Torpedo californica nach einer Vorschrift von Mosckovitz, modifiziert von Sehnert (Mosckovitz und Gershoni, 1988; Sehnert, 1994). Außerdem wurde die chromatographische Aufreinigung im Batch-Verfahren durchgefuhrt. ¨ ¨ ¨ Benotigte Losungen: Puffer A: 10 mM Tris 100 mM NaCl 1 mM EGTA 1 mM EDTA-Na2 -Salz 0,1 mM PMSF pH 7,4 (HCl) 10.5. Spezielle Arbeitsmethoden 139 Puffer B: 2 g Natriumcholat ad 200 ml Puffer A 100 mg Natriumcholat ad 100 ml Puffer A Puffer C: Puffer D: 1 M Carbamoylcholinchlorid in Puffer C 10 mM Tris 1 mM EGTA 1 mM EDTA-Na2 -Salz 0,1 mM PMSF 0,1 % Natriumcholat pH 7,4 (HCl) Dialysepuffer: Saulenmaterial: ¨ -Cobratoxin, immobilisiert an 4 % beaded agarose aktiviert mit Cyanobromid 0,2 M Essigsaure ¨ 1 M NaCl in Puffer A Regenerierungspuffer: 10.5.2.1. Isolierung im Batch-Verfahren Durchfuhrung: ¨ 100 g des tiefgefrorenen elektrischen Organs werden bei Raumtemperatur aufgetaut, zerkleinert und mit 200 ml Puffer A bei 4 C im Waring Blendor mit maximaler Leistung homogenisiert. Zur Ver¨ meidung von Uberhitzung wird die Homogenisierung in kleinen Intervallen mit großen Abstanden ¨ durchgefuhrt. Durch die Filtration des Homogenisats uber ein Mulltuch werden grobe Gewebestucke ¨ ¨ ¨ abgetrennt. Das Filtrat wird 60 Minuten (13.000 xg, 4 C) zentrifugiert. Das Pellet wird in 100 ml Puffer B resuspendiert und im Ultraschallbad auf der niedrigsten Stufe (in kurzen Intervallen, unter Eiskuhlung) beschallt. Anschließend wird die Suspension 2 Stunden unter leichtem Schutteln bei ¨ ¨ C inkubiert und anschließend 30 Minuten zentrifugiert (13.000 xg, 4 C). Der erhaltene Uberstand ¨ 4 wird in einem Falcon-Rohrchen mit dem mit Puffer A equilibrierten Saulenmaterial fur 1 Stunde ¨ ¨ ¨ unter leichtem Schutteln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Suspension wird dann mit 4.170 xg fur ¨ ¨ ¨ 10 Minuten zentrifugiert und der Uberstand vorsichtig mit einer Pipette entfernt. Das Saulenmaterial ¨ ¨ wird je mit zweimal 25 ml der Puffer A, B und C gewaschen, zentrifugiert und der Uberstand verworfen. Zur Elution des T-AChR wird das Saulenmaterial mit 4 ml Puffer D uber Nacht bei Raumtem¨ ¨ ¨ peratur unter leichtem Schutteln inkubiert, zentrifugiert und der Uberstand sofort zweimal gegen 5 l ¨ 140 10. Experimenteller Teil Dialysepuffer bei 4 C dialysiert. Zur Regeneration wird das Saulenmaterial zweimal mit je 25 ml Regenerierungspuffer inkubiert, zen¨ trifugiert und in 20 %iger ethanolischer Losung gelagert. ¨ 10.5.3. Chemische Deglykosylierung von Gelonin Die Deglykosylierung von Glykoproteinen ist notwendig, um eine Strukturaufklarung dieser Proteine ¨ zu ermoglichen. Es stehen dabei sowohl enzymatische, als auch chemische Methoden zur Verfugung. ¨ ¨ Bei der chemischen Deglykosylierung wird hauptsachlich Trifluormethansulfonsaure (TFMS) ver¨ ¨ wendet, da damit sowohl die Hydrolyse von O-, als auch N-glykosidischen Bindungen gelingt. Allerdings gelingt die Abspaltung von neutralen Zuckern besser, als die von N-Acetylhexosaminen (Sojar und Bahl, 1987; Edge, 2003). ¨ ¨ Benotigte Losungen: TFMS: Pyridin-Losung: ¨ Dialysepuffer: Durchfuhrung: ¨ Das zu deglykosylierende Protein wird uber Nacht lyophilisiert und in einem Glaskolben mit Hahn ¨ unter Stickstoff mit 150 µl TFMS pro mg Protein versetzt. Die Losung wird unter leichtem Ruhren bei ¨ ¨ 0 °C im Eisbad fur 2 Stunden inkubiert. Dabei ist auf Ausschluss von Feuchtigkeit zu achten. Nach ¨ der Inkubation wird die Losung in einem Trockeneis-Ethanol-Bad auf unter -20 °C abgekuhlt und die ¨ ¨ Saure mit aquimolarer Pyridinlosung langsam neutralisiert. Dabei ist auf die Temperatur zu achten, ¨ ¨ ¨ da die Neutralisationsreaktion stark exotherm ablauft. ¨ Die Proteinlosung wird 3 mal gegen je 5 l Dialysepuffer dialysiert und bis zur weiteren Verwendung ¨ bei -20 °C eingefroren. in versiegelten Ampullen kauflich erhaltlich ¨ ¨ 60 %ige Losung in Wasser ¨ 5 mM Ammoniumhydrogencarbonat 10.5.4. In vitro Translationstest Zur Bestimmung der Toxizitat gegenuber eukaryontische Ribosomen, eignet sich ein in vitro Trans¨ ¨ lationstest in einem zellfreien System (Pelham und Jackson, 1976; Jackson et al., 1983). Losung A: ¨ 2,5 mg Creatinphosphokinase 250 µl Wasser 250 µl Glycerin 10.5. Spezielle Arbeitsmethoden 141 Losung B: ¨ 65,2 mg Hemin in 90 ml 20 mM Tris 5 mM Kaliumchlorid pH 8,2 Losung C: ¨ 6,7 mg Creatinphosphat 100 µl Wasser 5 mM Magnesiumchlorid 2 M Kaliumchlorid Losung D: ¨ Losung E: ¨ L-[U14 C]-Valin (1,85 MBq/ml entspricht 50 µCi/ml) 7,5 mM Alanin 7,5 mM Leucin 5 mM Aspartat 5 mM Glutamat 5 mM Glycin 5 mM Histidin 5 mM Lysin 5 mM Serin 3,75 mM Arginin 3,75 mM Asparagin 3,75 mM Glutamin 3,75 mM Isoleucin 3,75 mM Phenylalanin 3,75 mM Prolin 3,75 mM Threonin 3,75 mM Tryptophan 3,75 mM Tyrosin 2,5 mM Cystein 2,5 mM Methionin Losung F: ¨ Valin-Losung: ¨ 1 mg/ml Valin 1 M NaOH 0,5 M H2 O2 Lysat: Kaninchen Retikulozyten Lysat, unbehandelt 142 10. Experimenteller Teil 8 %ige TCA-Losung: ¨ 80 g TCA ad 1 l Wasser 50 g TCA ad 200 ml Wasser 25 %ige TCA-Losung: ¨ Szintillationscocktail: komplementiertes Lysat: Rotiszint ecoplus 970 µl Lysat 10 µl Losung A ¨ 20 µl Losung B ¨ Master Mix: 50 µl Losung C ¨ 50 µl Losung D ¨ 80 µl Losung E ¨ 20 µl Losung F ¨ Durchfuhrung: ¨ Von den zu messenden Proben werden Verdunnungsreihen angelegt. Dabei ist zu beachten, dass die ¨ Proben bei der Auftragung auf die Zellkulturplatte um den Faktor 11 verdunnt werden. Eine Ne¨ gativkontrolle ist bei jedem Test zur Bestimmung des IC100-Wertes mitzufuhren. In eine bei 30 C ¨ vorgewarmte 96-Loch-Zellkulturplatte (Flachboden) wird 40 µl komplementiertes Lysat mit 5 µl zu ¨ testender Losung fur 5 Minuten bei 30 C inkubiert. Anschließend wird in rascher Folge 10 µl Mas¨ ¨ ter Mix mit einer Multipette zugegeben und die Platte bei 30 C inkubiert. Nach 40 Minuten wird aus jedem Napf jeweils 5 µl Probe entnommen. Diese Proben werden direkt in 1 ml kaltes Wasser gegeben und die Translation somit gestoppt. Man gibt 500 µl Valin-Losung dazu und inkubiert fur ¨ ¨ ¨ ¨ 15 Minuten bei 37 C. Danach werden die Proteine mit 2 ml 25 %iger TCA-Losung gefallt und 30 Minuten inkubiert. Anschließend wird durch Whatman GF/C filtriert und zweimal mit 8 ml 8 %iger TCA-Losung gewaschen, die Filterpapiere getrocknet und nach Zugabe von 3 ml Szintillationscock¨ tail die Radioaktivitat im -Counter bestimmt. ¨ 10.6. Immunologische Methoden 10.6.1. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Dieser immunologische Test dient zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Antikorpern ¨ bzw. Antigenen (Harlow, 1987; Peters und Baumgarten, 1990). Grundlage des Versuches ist die Bindung von Proteinen an die Oberflache von Polystyrol. Die Nachweise dieser Proteine gelingt mit ¨ Hilfe spezifischer Antikorper, die an ein Enzym gekoppelt sind. Die verwendeten Antikorper sind in ¨ ¨ Tab. 10.10 und die Verdunnungen bei den jeweiligen Versuchen aufgefuhrt. ¨ ¨ 10.7. Tierversuche 143 ¨ Antikorper anti-Gelonin mAb 35 ¨ Klasse Spezifitat polyklonal anti-Gelonin IgG1 monoklonal anti-AChR, MIR, EE, T, H, nativ IgG1 anti-His anti-His IgG1 anti-Ratte-IgG-AP anti-Maus-IgG-AP - Ursprung Maus Arbeitskreis -UE, Ratte Arbeitskreis, (Tzartos et al., 1981) N-, C-terminale und interne 6xHis- Maus Fa. Qiagen Tags > 5xHis Maus Fa. Novagen Ratten-IgG (ganzes Molekul) ¨ Hase Fa. Sigma Fab Maus IgG Ziege Fa. Sigma Tab. 10.10.: Verwendete Primar- und Sekundarantikorper; Abkurzungen: EE: Electrophorus ¨ ¨ ¨ ¨ electricus, T: Torpedo californica, H: human, AP: Alkalische Phosphatase Enzymkonjugat,-: nicht bekannt. 10.6.2. Western Blot Nach der Trennung eines Proteingemischs mit Hilfe der SDS-PAGE, konnen die Proteine auf eine ¨ Nitrozellulosemembran ubertragen werden. Auf dieser Membran konnen dann einzelne Proteine mit ¨ ¨ spezifischen Antikorpern detektiert werden (Kyhse-Andersen, 1984). Die verwendeten Antikorper ¨ ¨ sind in Tab. 10.10 aufgefuhrt. Als Sekundarantikorper wurden ausschließlich Antikorper verwendet, ¨ ¨ ¨ ¨ die mit dem Enzym Alkalische Phosphatase gekoppelt sind. Eine Bindung der Antikorper wurde mit ¨ dem Substrat BCIP/NBT (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat/Nitroblau Tetrazolium) detektiert. 10.7. Tierversuche 10.7.1. Halten und Spritzen der Ratte Fur die Immunisierung bzw. fur die Applikation des Narkosemittels ist es notwendig die Ratte zu ¨ ¨ fixieren. Dazu gibt es verschiedene Moglichkeiten (Sharp und La Regina, 1998). ¨ Durchfuhrung: ¨ Die Ratte wird am Schwanzansatz mit einer Hand festgehalten und mit einem Handtuch bedeckt. Mit der anderen Hand wird der Korper fixiert. Dabei wird der Kopf der Ratte zwischen Daumen und ¨ Zeigefinger gehalten und leicht zu Boden gedruckt. Die Ratte wird in der Hautfalte im Genick gepackt ¨ und hochgehoben. Mit der anderen Hand werden die Beine festgehalten und die Ratte mit dem Kopf nach unten geneigt. Eine zweite Person setzt die Spritze im unteren rechten Quadraten des Bauchs und durchsticht die Bauchdecke im 45 ° Winkel. 144 10. Experimenteller Teil 10.7.2. Induzierung der EAMG in Lewis-Ratten Die Induzierung der Experimentellen autoimmunen Myasthenia gravis (EAMG) in Lewis-Ratten erfolgte nach dem Schema von Urbatsch (Urbatsch, 1990). ¨ ¨ Benotigte Losungen: PBS, pH 7,2: 130 mM Natriumchlorid 4,5 mM di-Natriumhydrogenphosphat 2,5 mM Natriumdihydrogenphosphat pH 7,2 (NaOH) T-AChR: Ovalbumin-Lsg: Kap. 10.5.2 2 mg Ovalbumin ad 1 ml PBS, pH 7,2 Durchfuhrung: ¨ Der zur Induzierung der EAMG benotigte T-AChR muss in einem geeigneten Puffer vorliegen. Dazu ¨ wird die Proteinlosung zweimal gegen 5 l PBS, pH 7,2 dialysiert. Anschließend wird die Losung auf ¨ ¨ ca. 1 mg/ml aufkonzentriert und die Konzentration im UV-Spektrometer bestimmt. Zur Immunisierung werden 30 µg T-AChR und 20 µg Ovalbumin gemischt und die Losung uber ¨ ¨ einen Celluloseacetatfilter (0,45 µm) steril filtriert. Fur die Erstimmunisierung (Priming) wird die Pro¨ ¨ ¨ teinlosung dann im Verhaltnis 1:4 mit kompletten Freund's Adjuvans (CFA) unter Eiskuhlung versetzt ¨ und emulgiert. Fur die Auffrischung (Boost) wird CFA durch inkomplettes Freund's Adjuvans ersetzt. ¨ Die Immunisierung der weiblichen Lewis-Ratten (12 Wochen, Fa. Charles River, Sulzfeld) erfolgte durch intraperitoneale (i.p.) Injektion. 10.7.3. Repetitive Nervenstimulation ¨ ¨ Benotigte Losungen: Chloralhydrat: Durchfuhrung: ¨ Zur Immobilisierung der Ratte werden 400 µg Chloralhydrat pro kg Korpergewicht i.p. gespritzt. Die ¨ Ratte wird zum Einschlafen in einen ruhigen, dunklen Raum gebracht. Ist die Ratte immobilisiert, wird sie in eine Wachswanne gelegt, die Hinterlaufe so plaziert, dass ¨ die Unterschenkel nach außen zeigen. Danach wird die Ratte mit den Reizelektroden fixiert. Dabei 7 % Chloralhydrat 10.7. Tierversuche 145 werden beide Elektroden (EEG-Nadelelektroden (l = 1,2 cm, = 0,4 mm, Fa. Neurokard GmbH) direkt durch die Muskulatur des Oberschenkels gesteckt und die Ratte so fixiert. Die Ableitelektroden werden durch den Fuß gesteckt. Eine Elektrode wird zentral, die andere peripher platziert. Eine Masse-Elektrode ist optional. Die RNS erfolgt durch Stimulation des Ischiasnervs (Nervus ischiadicus) mit einer Frequenz von 4 Hz. Die Pulshohe betragt 20 V, die Pulsdauer 0,2 ms. Die Aufzeichnung erfolgt mit einem Oszil¨ ¨ loskop. Um eine gute Auswertbarkeit zu ermoglichen, werden erst zwei bis drei Einzelpulse gegeben, ¨ bevor mit der RNS begonnen wird. Jede Messung wird mehrmals wiederholt. Die Auswertung der erhaltenen Signale erfolgt je nach Art des erhaltenen Diagramms: (1) Sind die Einzelsignale genauso groß wie das erste Signal der repetitiven Nervenstimulation, dann wird aus diesen Werten der Mittelwert (A1S ) gebildet. Nach ca. 10 Stimulationen sind die gemessenen Amplituden konstant. Aus mindestens 5 Amplituden (A nS ) wird der Mittelwert AnS berechnet. (2) Zeigt das erste Signal der RNS ein Artefakt, so werden nur die Einzelpulse bei der Berechnung von A1S verwendet. Der Dekrementwert D errechnet sich dann zu: 1 D[%] = 100 - 00 · AnS A1S ( 10.1) 146 10. Experimenteller Teil 147 A. Anhang ¨ A.1. Diskutierte Aminosaurensequenzen von naturlichem Gelonin ¨ Nolan | Rosenblum | 1 GLDTVSFSTKGATYITYVNFLNELRVKLKPEGNSHGIPLLRKKCDDPGKCFVLVALSNDN 1 GLDTVSFSTKGATYITYVNFLNELRVKLKPEGNSHGIPLLRKG-DDPGKCFVLVALSNDN ****************************************** **************** 61 GQLAEIAIDVTSVYVVGYQVRNRSYFFKDAPDAAYEGLFKNTIK--------TRLHFGGS 60 GQLAEIAIDVTSVYVVGYQVRNRSYFFKDAPDAAYEGLFKNTIKNPLLFGGKTRLHFGGS ******************************************** ******** Nolan | Rosenblum | Nolan | 113 YPSLEGEKAYRETTDLGIEPLRIGIKKLDENAIDNYKPTEIASSLLVVIQMVSEAARFTF Rosenblum | 120 YPSLEGEKAYRETTDLGIEPLRIGIKKLDENAIDNYKPTEIASSLLVVIQMVSEAARFTF ************************************************************ Nolan | 173 IENQIRNNFQQRIRPANNTISLENKWGKLSFQIRTSGANGMFSEAVELERANGKKYYVTA Rosenblum | 180 IENQIRNNFQQRIRPANNTISLENKWGKLSFQIRTSGANGMFSEAVELERANGKKYYVTA ************************************************************ Nolan | 233 VDQVKPKIALLKFVDKDPK | 251 AS -> 28.172,20 Da Rosenblum | 240 VTQVKPKIALLKFVDKDPE | 258 AS -> 28.811,89 Da * **************** Abb. A.1.: Vergleich der Aminosaurensequenzen von Gelonin nach Nolan et al. (Nolan et al., ¨ 1993) und Rosenblum et al. (Rosenblum et al., 1995). Die angegebenen Molekulargewichte errechnen sind aus der Aminos aurensequenz und berucksichtigen keine posttranslationale Mo¨ ¨ difikationen. *: Identische Aminos aure in beiden Sequenzen, -: Aminosaure nur in einem Protein ¨ ¨ vorhanden. 148 A. Anhang ¨ A.2. DNA- und Aminosaurensequenz der rekombinanten Proteine A.2.1. HisT-Gelonin1-251 6 DNA- und Aminosaurensequenz des rekombinanten Gelonins im Expressionsvektor pET-gel. Die Se¨ quenz enthielt alle 251 AS des naturlichen Gelonins (Swissprot P33186, Nolan et al., 1993). Zusatzlich ¨ ¨ enthielt das Protein einen N-terminalen HisTag mit einer Thrombin-Schnittstelle zur Abspaltung. Die berechnete Masse betragt 30.494,72 Da, wobei das Methionin formyliert ist (M*), die Masse ¨ bei abgespaltenem HisTag betragt 28.584,66 Da. Der berechnete pI-Wert betragt 9,22 bzw. 9,12 bei ¨ ¨ abgespaltenem HisTag. 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 ATGGGCAGCA GCCATCATCA TCATCATCAC AGCAGCGGCC TGGTGCCGCG CGGCAGCCAT M* G S SHH HHHH SSG LVP RGSH ATGGGCCTGG ATACCGTGAG CTTCAGCACC AAAGGCGCCA CCTATATTAC CTATGTGAAC MGL DTV SFST KGA TYI TYVN TTCCTGAACG AACTGCGTGT GAAACTGAAA CCGGAAGGCA ACAGCCATGG CATTCCGCTG FLN ELR VKLK PEG NSH GIPL CTGCGTAAAA AATGCGATGA TCCGGGCAAA TGCTTCGTGC TGGTGGCGCT GAGCAACGAT LRK KCD DPGK CFV LVA LSND AACGGCCAGC TAGCGGAAAT TGCGATTGAT GTGACCAGCG TGTATGTGGT GGGCTATCAG NGQ LAE IAID VTS VYV VGYQ GTGCGTAACC GTAGCTATTT CTTCAAAGAT GCGCCGGATG CGGCGTATGA AGGCCTGTTC VRN RSY FFKD APD AAY EGLF AAAAACACCA TTAAAACCCG TCTGCATTTC GGCGGCAGCT ATCCGAGTCT AGAAGGCGAA KNT IKT RLHF GGS YPS LEGE AAAGCGTATC GTGAAACCAC CGATCTGGGC ATTGAACCGC TGCGTATTGG CATTAAAAAA KAY RET TDLG IEP LRI GIKK CTGGATGAAA ACGCGATTGA TAACTATAAA CCGACCGAAA TTGCGAGCAG CCTGCTGGTG LDE NAI DNYK PTE IAS SLLV GTGATTCAGA TGGTGAGCGA AGCGGCGCGT TTCACCTTCA TTGAAAACCA GATTCGTAAC VIQ MVS EAAR FTF IEN QIRN AACTTCCAGC AGCGGATCCG TCCGGCGAAC AACACCATTA GCCTGGAAAA CAAATGGGGC NFQ QRI RPAN NTI SLE NKWG AAACTGAGCT TCCAGATTCG TACCAGCGGC GCGAACGGCA TGTTCAGCGA AGCGGTGGAA KLS FQI RTSG ANG MFS EAVE CTGGAACGTG CGAACGGCAA AAAATATTAT GTGACCGCGG TGGATCAGGT GAAACCGAAA LER ANG KKYY VTA VDQ VKPK ATTGCGCTGC TGAAATTCGT CGACAAAGAT CCGAAATAAT AA IAL LKF VDKD PK- A.2. DNA- und Aminosaurensequenz der rekombinanten Proteine ¨ 149 A.2.2. His(T)-Gelonin1-246 -H--AChR4-181 6 DNA- und Aminosauresequenz des Fusionsproteins His (T) -Gelonin1-246 -H--AChR4-186 im Ex¨ 6 pressionsvektor pET-GA. Das Fusionsprotein bestand aus Gelonin mit den Aminosauren 1 bis 246 ¨ (Swiss-Prot P33186) und dem C-terminal fusionierten, extrazellularen -AChR-Fragment mit den ¨ Aminosauren 4 bis 181 der -Untereinheit des humanen, nikotinischen Acetylcholinrezeptors (Swiss¨ Prot P02708). Die Aminosauren LSNN gehorten zum Vektor. Ein N-terminaler HisTag erlaubte die ¨ ¨ Aufreinigung mit Nickel-Affinitatschromatographie. Eine Schnittstelle fur Thrombin sollte es er¨ ¨ ¨ ¨ moglichen den HisTag abzuspalten. Die berechnete Masse betragt unter Berucksichtigung des for¨ mylierten Methionins (M*) 50.868,89 Da bei einem pI-Wert von 7,22. 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 ATGGGCAGCA GCCATCATCA TCATCATCAC AGCAGCGGCC TGGTGCCGCG CGGCAGCCAT M* G S SHH HHHH SSG LVP RGSH ATGGGCCTGG ATACCGTGAG CTTCAGCACC AAAGGCGCCA CCTATATTAC CTATGTGAAC MGL DTV SFST KGA TYI TYVN TTCCTGAACG AACTGCGTGT GAAACTGAAA CCGGAAGGCA ACAGCCATGG CATTCCGCTG FLN ELR VKLK PEG NSH GIPL CTGCGTAAAA AATGCGATGA TCCGGGCAAA TGCTTCGTGC TGGTGGCGCT GAGCAACGAT LRK KCD DPGK CFV LVA LSND AACGGCCAGC TAGCGGAAAT TGCGATTGAT GTGACCAGCG TGTATGTGGT GGGCTATCAG NGQ LAE IAID VTS VYV VGYQ GTGCGTAACC GTAGCTATTT CTTCAAAGAT GCGCCGGATG CGGCGTATGA AGGCCTGTTC VRN RSY FFKD APD AAY EGLF AAAAACACCA TTAAAACCCG TCTGCATTTC GGCGGCAGCT ATCCGAGTCT AGAAGGCGAA KNT IKT RLHF GGS YPS LEGE AAAGCGTATC GTGAAACCAC CGATCTGGGC ATTGAACCGC TGCGTATTGG CATTAAAAAA KAY RET TDLG IEP LRI GIKK CTGGATGAAA ACGCGATTGA TAACTATAAA CCGACCGAAA TTGCGAGCAG CCTGCTGGTG LDE NAI DNYK PTE IAS SLLV GTGATTCAGA TGGTGAGCGA AGCGGCGCGT TTCACCTTCA TTGAAAACCA GATTCGTAAC VIQ MVS EAAR FTF IEN QIRN AACTTCCAGC AGCGGATCCG TCCGGCGAAC AACACCATTA GCCTGGAAAA CAAATGGGGC NFQ QRI RPAN NTI SLE NKWG AAACTGAGCT TCCAGATTCG TACCAGCGGC GCGAACGGCA TGTTCAGCGA AGCGGTGGAA KLS FQI RTSG ANG MFS EAVE CTGGAACGTG CGAACGGCAA AAAATATTAT GTGACCGCGG TGGATCAGGT GAAACCGAAA LER ANG KKYY VTA VDQ VKPK ATTGCGCTGC TGAAATTCGT CGAGACCCGT CTGGTGGCAA AGCTATTTAA AGACTACAGC IAL LKF VETR LVA KLF KDYS 150 A. Anhang 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 AGCGTGGTGC GGCCAGTGGA AGACCACCGC CAGGTCGTGG AGGTCACCGT GGGCCTGCAG SVV RPV EDHR QVV EVT VGLQ CTGATACAGC TCATCAATGT GGATGAAGTA AATCAGATCG TGACAACCAA TGTGCGTCTG LIQ LIN VDEV NQI VTT NVRL AAACAGCAAT GGGTGGATTA CAACCTAAAA TGGAATCCAG ATGACTATGG CGGTGTGAAA KQQ WVD YNLK WNP DDY GGVK AAAATTCACA TTCCTTCAGA AAAGATCTGG CGCCCAGACC TTGTTCTCTA TAACAATGCA KIH IPS EKIW RPD LVL YNNA GATGGTGACT TTGCTATTGT CAAGTTCACC AAAGTGCTCC TGCAGTACAC TGGCCACATC DGD FAI VKFT KVL LQY TGHI ACGTGGACAC CTCCAGCCAT CTTTAAAAGC TACTGTGAGA TCATCGTCAC CCACTTTCCC TWT PPA IFKS YCE IIV THFP TTTGATGAAC AGAACTGCAG CATGAAGCTG GGCACCTGGA CCTACGACGG CTCTGTCGTG FDE QNC SMKL GTW TYD GSVV GCCATCAACC CGGAAAGCGA CCAGCCAGAC CTGAGCAACT TCATGGAGAG CGGGGAGTGG AIN PES DQPD LSN FME SGEW GTGATCAAGG AGTCCCTGAG CAATAACTAG VIK ESL SNN- A.2. DNA- und Aminosaurensequenz der rekombinanten Proteine ¨ 151 A.2.3. HisE0-H--AChR4-208 1 DNA- und Aminosaurensequenz des extrazellularen Fragments der -Untereinheit des humanen, ¨ ¨ nikotinischen Acetylcholinrezeptors im Expressionsvektor pHE706ext. Der Vektor kodierte fur die ¨ Aminosauren 4 bis 208 (Swiss-Prot P02708). Das Protein besaß einen N-terminalen HisTag mit ein¨ er Schnittstelle fur Enterokinase. Die berechnete Masse betragt 26.817,26 Da bzw. 24.159,55 Da bei ¨ ¨ abgespaltetem HisTag. Der berechnete pI-Wert liegt bei 5,93 bzw. bei 5,45 ohne HisTag. 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 ATGGGCCATC ATCATCATCA TCATCATCAT CATCACAGCA GCGGCCATAT CGACGACGAC M* G H HHH HHHH HHS SGH IDDD GACAAGCATA TGCTCGAGAC CCGTCTGGTG GCAAAGCTAT TTAAAGACTA CAGCAGCGTG DKH MLE TRLV AKL FKD YSSV GTGCGGCCAG TGGAAGACCA CCGCCAGGTC GTGGAGGTCA CCGTGGGCCT GCAGCTGATA VRP VED HRQV VEV TVG LQLI CAGCTCATCA ATGTGGATGA AGTAAATCAG ATCGTGACAA CCAATGTGCG TCTGAAACAG QLI NVD EVNQ IVT TNV RLKQ CAATGGGTGG ATTACAACCT AAAATGGAAT CCAGATGACT ATGGCGGTGT GAAAAAAATT QWV DYN LKWN PDD YGG VKKI CACATTCCTT CAGAAAAGAT CTGGCGCCCA GACCTTGTTC TCTATAACAA TGCAGATGGT HIP SEK IWRP DLV LYN NADG GACTTTGCTA TTGTCAAGTT CACCAAAGTG CTCCTGCAGT ACACTGGCCA CATCACGTGG DFA IVK FTKV LLQ YTG HITW ACACCTCCAG CCATCTTTAA AAGCTACTGT GAGATCATCG TCACCCACTT TCCCTTTGAT TPP AIF KSYC EII VTH FPFD GAACAGAACT GCAGCATGAA GCTGGGCACC TGGACCTACG ACGGCTCTGT CGTGGCCATC EQN CSM KLGT WTY DGS VVAI AACCCGGAAA GCGACCAGCC AGACCTGAGC AACTTCATGG AGAGCGGGGA GTGGGTGATC NPE SDQ PDLS NFM ESG EWVI AAGGAGTCCC GTGGCTGGAA ACATAGCGTG ACCTATAGCT GCTGCCCGGA TACCCCGTAT KES RGW KHSV T CTGGATATTA CCTATCATTT CGTGATGCAG TAA L D I T Y H F V M Q Y S C C P D T P Y 152 A. Anhang A.3. Plasmidkarten Abb. A.2.: Plasmidkarte pHE706 Abb. A.3.: Plasmidkarte pHE706ext A.3. Plasmidkarten 153 Abb. A.4.: Plasmidkarte pBDH-VU1 Abb. A.5.: Plasmidkarte pET19b 154 A. Anhang Abb. A.6.: Plasmidkarte pET-gel Abb. A.7.: Plasmidkarte pET-GA A.3. Plasmidkarten 155 Abb. A.8.: Plasmidkarte pUCHE706 Abb. A.9.: Plasmidkarte pUCHE706ext 156 A. Anhang ¨ A.4. Mogliche Bestandteile der Glykosylierung von Gelonin Mmono (Da) Zucker D-Xylose (Xyl) D-Mannose (Man) N-Acetyl-D-Glucosamin (GlucNAc) Modifizierungen Oxidation Desaminierung Phosphorylierung Pufferbestandteile H+ Wasser Na+ Mm (Da) 150,0529 150,1314 180,0634 180,1577 221,0900 221,2103 15,9950 0,9840 79,9663 1,0073 18,0106 22,9898 15,9994 0,9847 79,9799 1,0074 18,0152 22,9898 Tab. A.1.: Mogliche Bestandteile der Glykosylierung von Gelonin mit monoisotopischen M mono ¨ und mittleren molekularen Massen M m . Abb. A.10.: Mogliche Zuckerbestandteile der Oligosaccharid-Strukturen von Pflanzenpro¨ teinen. 157 Literaturverzeichnis Aderem A., Ulevitch R. (2000) Toll-like receptors in the induction of the innate immune response. Nature, 406, 782­787. Akira S., Takeda K., Kaisho T. (2001) Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity. Nat Immunol, 2, 675­780. al Jaufy A., Haddad J., King S., McPhee R., Jackson M. (1994) Cytotoxicity of a shiga toxin A subunit-CD4 fusion protein to human immunodeficiency virus-infected cells. Infect Immun, 62, 956­960. Alexeev T., Krivoshein A., Shevalier A., Kudelina I., Telyakova O., Vincent A., Utkin Y., Hucho F., Tsetlin V. (1999) Physicochemical and immunological studies of the N-terminal domain of the Torpedo acetylcholine receptor -subunit expressed in Escherichia coli. Eur J Biochem, 259, 310­319. Alexopoulou L., Holt A., Medzhitov R., Flavell R. 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Lohrke (Fachbereich Biologie, Technische Universitat Kaiserslautern) danke ich ¨ ¨ ¨ fur seine Hilfe bei den ersten Schritten in der Elektrophysiologie und fur seine stetige Hilfs¨ und Diskussionsbereitschaft. Herrn Prof. Dr. E. Friauf (Fachbereich Biologie, Technische Universitat Kaiserslautern) danke ich fur die Bereitstellung der Gerate. ¨ ¨ ¨ · Herrn Prof. Dr. G. Niedner-Schatteburg (Fachbereich Chemie, Technische Universitat Kaiser¨ slautern) danke ich fur die Messung des ESI-FT Massenspektrums von rekombinantem Gelonin. ¨ · Herrn Thorsten Daubenfeld danke ich fur die immer frohliche Zusammenarbeit im Labor, die ¨ ¨ lange Zeit zum Erhalt der Sprachkultur beigetragen hatte. · Herrn Jorn Buttner danke ich fur die gute Zusammenarbeit wahrend seiner Diplomarbeit und ¨ ¨ ¨ ¨ seine freundliche und immer aufgeschlossene Art. · Herrn Joachim Ackel danke ich auch fur die Zusammenarbeit wahrend seiner Diplomarbeit und ¨ ¨ seine Unterstutzung bei der Durchfuhrung der Tierversuche. ¨ ¨ · Herrn Dr. Reinhard Philipp danke ich fur sein offenes Ohr bei Problemen. ¨ 178 · Herrn Dr. J.G. Wise danke ich fur die Unterstutzung bei Fragen zur gentechnischen Arbeit. ¨ ¨ · Frau Susanne Kunz und Herrn Dr. Hans-Joachim Schmitz danke ich fur ihre Hilfe bei den er¨ sten Versuchen zum Umgang mit den Ratten. · Frau Dr. U. Westermilies danke ich fur die bereitwillige Beantwortung der tierarztlichen Fragen. ¨ ¨ · Den Mitarbeitern im Arbeitskreis danke ich fur die tolle Zusammenarbeit, fur das sehr gute ¨ ¨ Arbeitsklima und die vielen interessanten Gesprache. ¨ · Frau Elke Litmianski danke ich fur die Herstellung der polyklonalen Anti-Gelonin Antikorper ¨ ¨ und ihr offenes Ohr bei fast allen Problemen. · Frau Carolin Fluck danke ich fur ihre freundliche Hilfe und Unterstutzung. ¨ ¨ · Meinen Eltern danke ich fur die Unterstutzung und den großen Ruckhalt uber die letzten ¨ ¨ ¨ ¨ Jahrzehnte und das sie immer an mich geglaubt haben. · Besonderen Dank gilt Frau Christine Gall fur ihre intensive Korrekturarbeit, Unterstutzung und ¨ ¨ fur ihre guten Ideen. Ich danke ihr besonders dafur, dass es sie gibt. ¨ ¨ ...und Ratte K2 danke ich dafur, dass sie mir gezeigt hat, was es heißt Tierversuche durchzufuhren. ¨ ¨ 179 C. Lebenslauf Name: Anschrift: Martin Hossann Gerhart-Hauptmann Straße 24/121 67663 Kaiserslautern Geburtsdatum: Geburtsort: Eltern: 03. Juni 1975 76829 Landau/Pfalz Bernd Hossann Marlis Hossann (geb. Forster) ¨ Staatsangehorigkeit: ¨ Familienstand: Schulbildung: deutsch ledig 1981 - 1983 Grundschule Landau Mitte 1983 - 1985 Pestalozzi-Grundschule, Landau 1985 - 1994 Max-Slevogt Gymnasium, Landau 06/1994 Allgemeine Hochschulreife Wehrdienst: 10/1995 - 12/1995 6./Luftwaffenausbildungsregiment 2, Budel/NL 01/1996 - 07/1996 Luftwaffenmaterialdepot 42, Germersheim Studium: 10/1994 Aufnahme des Chemiestudiums an der Universitat Kaiserslautern ¨ 10/1997 Vordiplom Chemie 06/2000 - 02/2001 Diplomarbeit unter Anleitung von Prof. Dr. W. E. Trommer seit 03/2001 Beginn der Dissertation unter Anleitung von Prof. Dr. W. E. Trommer 04. Juni 2004 Wissenschaftliche Aussprache 180 A geschrieben mit LTEX(TEX-Version 3.14159 (Web2C 7.4.5)) auf Debian GNU Linux